Научная статья на тему 'Активність циклонуклеотид залежних протеїнкіназ в клітинах товстого кишечника щурів за умов розвитку виразкового коліту'

Активність циклонуклеотид залежних протеїнкіназ в клітинах товстого кишечника щурів за умов розвитку виразкового коліту Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

CC BY
147
27
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Физика живого
Область наук
Ключевые слова
ПKA / ПKG / ВИРАЗКОВИЙ КОЛіТ / КОЛОНОЦИТ / ЦАМФ / ЦГМФ / ЯЗВЕННЫЙ КОЛИТ

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Кравченко О. О., Гавриш Л. І., Остапченко Л. І., Дробінська О. В.

В цитоплазматичних мембранах і цитозольній фракції колоноцитів товстого кишечника досліджено активність цАМФі цГМФ-залежних протеїнкіназ в динаміці розвитку виразкового коліту і трансформації клітин у щурів. Показано, що в механізми розвитку діарейного синдрому і виразкового коліту залучена мембранозв’язана форма РКG, активність якої знижується на початкових етапах (1 доба) запалення в товстій кишці. В наступні строки спостереження виявлено значне зростання активності цитоплазматичної фракції РКА та РКG, що вказує на участь досліджуваних ферментів у розвитку патологій товстого кишечника.Исследована активность цАМФ и цГМФ-зависимых протеинкиназ в цитоплазматической и мембранной фракциях колоноцитов толстого кишечника крыс при развитии экспериментального язвенного колита с последующей трансформацией клеток. Показано, что в механизмы развития диарейного синдрома и начальных стадий колита вовлечена мембраносвязанная форма РКG, активность которой снижалась в начальные сроки наблюдения. В последующие етапы развития воспаления и перерождения наблюдалось возрастание активности цитоплазматичесой фракции исследованных ферментов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по ветеринарным наукам , автор научной работы — Кравченко О. О., Гавриш Л. І., Остапченко Л. І., Дробінська О. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Активність циклонуклеотид залежних протеїнкіназ в клітинах товстого кишечника щурів за умов розвитку виразкового коліту»

Фізики живого, Т. 15, No2, 2007'. С.49-53. I^hysics ОҐtllC Д]і

© Кравченко 0.0., Гаврииі Л.І., Остапченко Л. І., Дробінська О.В. www.pa.scieiice-centei\net A5®

УДК 577.152.271:616.35

АКТИВНІСТЬ ЦИКЛОНУКЛЕОТИД ЗАЛЕЖНИХ ПРОТЕЇНКІНАЗ В КЛІТИНАХ ТОВСТОГО КИШЕЧНИКА ЩУРІВ ЗА УМОВ РОЗВИТКУ ВИРАЗКОВОГО КОЛІТУ

Кравченко О.О., Гавриш Л.І., Остапченко Л. І., Дробінська О.В.

Київський національний університет імені Тараса Шевченка Надійшла до редакцї 07.10.2007

В цитоплазматичних мембранах і цитозольній фракції колоноцитів товстого кишечника досліджено активність цАМФ- і цГМФ-залежних протеїнкіназ в динаміці розвитку виразкового коліту і трансформації клітин у щурів. Показано, що в механізми розвитку діарейного синдрому і виразкового коліту залучена мембранозв’язана форма РКв, активність якої знижується на початкових етапах (1 доба) запалення в товстій кишці. В наступні строки спостереження виявлено значне зростання активності цитоплазматичної фракції РКА та РКв, що вказує на участь досліджуваних ферментів у розвитку патологій товстого кишечника.

Ключові слова: ПКА, ПКв, виразковий коліт, колоноцит, цАМФ, цГМФ.

ВСТУП

Виразковий коліт (ВК) - хронічне

захворювання товстої кишки невідомої етіології, яке характеризується дифузним запальним ураженням її слизової оболонки [1]. При

неспецифічному виразковому коліті вірогідність

розвитку колоректального раку збільшується через 5-15 років на 10-20%. Основними факторами,

залученими у патогенез цього захворювання є порушення всмоктування та секреції води і електролітів епітеліальними клітинами товстого і тонкого кишечнику [2]. Співвідношення абсорбції і секреції регулюється нейроендокринними медіаторами і гормонами. Дані процеси корелюють із змінами вмісту таких внутрішньоклітинних вторинних месенджерів, як cAMP і cGMP. Ці сигнальні молекули реалізують активацію cAMP -та cGMP -залежних протеїнкіназ, ферментів, які залучені у механізми регуляції іонного транспорту, проліферації і диференціації клітин шляхом фосфорилювання численних білкових субстратів [3,4]. Підвищення рівня cAMP і cGMP в клітинах товстого кишечника призводить до порушення дифузії іонів Cl- та К+, що може обумовлювати розвиток діарейного синдрому [5,6]. За умов експериментальної моделі інфекційного ентероколіту, викликаного Escherichia coli і Yersinia enterocolitica показано зростання вмісту внутрішньоклітинного cGMP та cAMP, що пов’язано з активацією мембранозв’язаної гуанілатциклази та аденілатциклази і порушенням функціонування Cl- каналів [2].

Крім регуляції вищезазначених процесів, циклонуклеотидзалежні протеїнкінази впливають на диференціацію, проліферацію та загибель клітин шляхом фосфорилювання МАП кіназ (Яа1-1, у-Моз), гістонів та проапоптичних факторів (в8К-3а, в8К-3Р) [5,7].

Система циклонуклеотидзалежного фосфорилювання є важливою ланкою регуляції внутрішньоклітинних процесів у нормі та за різних патологічних станів товстої кишки. Однак, отримані на сьогодні експериментальні дані є досить розрізненими та неповними, а відтак не дають можливості сформувати цілісне уявлення про послідовність біохімічних змін в динаміці розвитку виразкового коліту і трансформації клітин.

Метою роботи було дослідити активність сАМР- і свМР -залежних протеїнкіназ в мембранній і цитозольній фракціях колоноцитів за умов розвитку коліт- асоційованого канцерогенезу у щурів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

У роботі дотримувалися міжнародних рекомендацій про проведення медично-біологічних досліджень з використанням тварин згідно Європейської конвенції.

Експерименти проводились на нелінійних білих щурах самцях масою 150 - 180г. Тварин

утримували на стандартному раціоні віварію. Модель коліт-асоційованого канцерогенезу відтворювали введенням декстрансульфат натрієвої солі і 1,2 диметилгідразину за методичними рекомендаціями [8].

Кравченко О.О., Гавриш Л.І., Остапченко Л. І., Дробінська О.В.

Щурам експериментальної групи протягом тижня питну воду замінювали на 1% розчин декстрансульфат натрієвої солі (м.в.30 000-50 000), після чого вводили специфічний проканцероген 1,2- диметилгідразин щотижнево протягом 2,5 місяців у дозі 20мг/кг підшкірно. Епітеліальні клітини товстої кишки виділяли за рекомендаціями [10]. Фракції плазматичних мембран і цитозоль епітеліальних клітин отримували методом диференційного центрифугування на градієнті сахарози (30% ).

Активність cAMP - і cGMP -залежних протеїнкіназ визначали в препаратах плазматичних мембран і цитозолі колоноцитів за включенням 32P з y-^P/АТР до специфічних субстратів фосфотрансферазної реакції [11]. Радіоактивність вимірювали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107 на рідинно - сцинтиляційному лічильнику Delta (USA). Питому активність ферментів виражали у пмоль 32PK за 1 хвилину на 1 мг білка. Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд.

Статистичну обробку результатів та побудову графіків проводили методами варіаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження морфофункціональних змін у процесі запалення та на ранніх етапах розвитку онкологічних процесів є важливим напрямком для визначення динаміки патологій та захисного потенціалу слизової оболонки товстої кишки.

Для морфологічної оцінки стану товстого кишечника були проведені візуальні макроскопічні та цитологічні дослідження, які показали відсутність змін слизової оболонки на 1-шу добу після ініціації виразкового коліту 1% розчином декстрансульфат натрієвої солі. На 3 добу експерименту встановлено типові гострі ерозивно-запальні ушкодження слизової оболонки, геморагії та набряки, які супроводжувались характерними симптомами коліту (діарея) і зберігались на 7 добу експерименту. Протягом розвитку запалення товстого кишечника нами встановлено збільшення в колоноцитах слизу порівняно з контролем, що є підтвердженням порушення секреції і всмоктування води та електролітів. На фоні розвитку коліту при щотижневому введенні специфічного проканцерогену 1,2 -диметилгідразину ми спостерігали (6 тиждень) локальні потовщення м’язевого шару кишечника за рахунок лейкоцитарної інфільтрації, на 8 тиждень - дисплазію, метаплазію і трансформацію клітин, а на 10 тиждень у 20% щурів виявлено аномальні новоутворення в проксимальному відділі товстого кишечника, які мали вигляд щільних наростів правильної округлої

форми діаметром від 1 до 5 мм і характеризувались як помірно диференційований рак слизової

оболонки товстого кишечника (аденокарцинома).

За умов розвитку досліджуваної нами патології з усієї системи протеїнкіназ особливу увагу привертають сАМР - і сОМР -залежні

протеїнкінази, які приймають участь у регуляції багатьох внутрішньоклітинних процесів, контролюючи транспорт іонів та проліферацію

клітин [7].

Для з’ясування участі протеїнкінази А (РКА) і протеінкінази О (РКО) у процесі розвитку

виразкового коліту та його ускладнень, нами досліджено активність даного ферменту в плазматичних мембранах та цитозолі колоноцитів товстого кишечника щурів за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу у щурів.

У ході досліджень встановлено, що на 1 та 3 добу розвитку виразкового коліту в плазматичних мембранах щурів не спостерігалось статистично достовірних змін активності РКА. Поруч з цим в цитозольній фракції на 3 добу експерименту відмічено певне зменшення активності досліджуваного ферменту порівняно з контролем. В наступний період спостереження (7-ма доба) розвитку виразкового коліту зафіксовано стрімке зростання активності сАМР-залежної протеїнкінази більш ніж в 2 рази відносно контролю як в мембранній фракції, так і в цитозолі клітин слизової оболонки товстого кишечника (рис.1).

Беручи до уваги те, що симптоми гострого коліту були відмічені вже на 3 добу експерименту, коли активність ферменту ще не зазнала суттєвих змін, можна передбачити, що РКА не бере безпосередньої участі в активації секреторно-сорбційних розладів на початкових етапах запалення в товстій кишці. Поруч з цим, його стрімка активація на 7 добу коліту вказує на роль РКА в розвитку та підсиленні функціональних змін колоноцитів за умов запалення. При введені специфічного проканцерогену (1,2-диметилгідразину) на 2-й тиждень активність досліджуваного ферменту в цитоплазмі залишалась високою (значення були подібними за дії індуктора запалення), а в плазматичних мембранах активність ферменту знижувалась до рівня контрольних показників, що може бути пов’язаним з порушенням структурно-функціонального стану мембран.

В наступні терміни спостереження (4, 6 тиждень) встановлено поступове зменшення активності РКА в цитозольній фракції і на 8 тиждень експерименту цей показник був в межах контрольних значень. Активність РКА в мембранній фракції також поступово знижувалась і на 6 тиждень дії 1,2-диметилгідразину (становила лише 74% від контролю). На 10 тиждень експерименту нами зафіксовано сильну активацію досліджуваного

ферменту як в цитозольній, так і в мембраній фракціях колоноцитів, що, можливо, пов’язано із збільшенням вмісту циклічних нуклеотидів за умов розвитку патології. Активація цитозольної фракції РКА може змінювати властивості цитоскелетних протеїнів, МАП кіназ, проапоптичних факторів (О8К-3) [4,5] і, як наслідок, негативно впливати на проліферацію, диференціацію клітин, що надалі може призвести до незворотніх порушень функціональної активності колоноцитів.

При дослідженні активності оОМР -залежної протеїнкінази, встановлено достовірне зниження активності РКО в мембранній (на 1-шу добу експерименту) та цитозольній (на 1, 3 добу) фракціях досліджувуаних клітин. На 7 добу розвитку запального ураження товстої кишки було встановлено статистично достовірне зменшення

активності мембранозв’язаної РКО більш ніж на 50% порівняно з контролем і зростання активності (майже в 1,5 раза) в цитозольній фракції (рис.2).

На основі отриманих даних можна припустити, що до механізмів розвитку діарейного синдрому при виразковому коліті залученні мембранозв’язані РКО, оскільки, за даними літератури РКО регулює транспорт СІ-, № +, Са2+ [2, 5], впливаючи на відповідні канали. Тривале зниження активності мембранної форми РКО може викликати зміни сорбційно-секреторного статусу клітин товстого кишечника і викликати діарею.

При введенні канцерогену (на 2-ий тиждень) відмічено зростання активності РКО як в цитозольній, так і в мембранній фракціях. В наступні періоди спостереження спостерігалось поступове зниження досліджуваних параметрів.

Рис. 1. Активність протеїнкінази А (РКА) у плазматичних мембранах (О) та цитозолі (В) клітин слизової оболонки товстого кишечника щурів за умов розвитку експериментального виразкового коліту та на початкових стадіях онкопатологій (М±т, п=6):

Примітки (тут і далі):

* - Р<0,05

1 - контроль;

2 - 1 -ша доба введення декстран сульфат натрієвої солі;

3 - 3-тя доба введення декстран сульфат натрієвої солі;

4 - 7-ма доба введення декстран сульфат натрієвої солі;

5 - 2 тижні введення канцерогену після дії декстран сульфат натрієвої солі;

6 - 4 тижні введення канцерогену після дії декстран сульфат натрієвої солі;

7 - 6 тижнів введення канцерогену після дії декстран сульфат натрієвої солі;

8 - 8 тижнів введення канцерогену після дії декстран сульфат натрієвої солі;

9-10 тижнів введення канцерогену після дії декстран сульфат натрієвої солі;

Кравченко О.О., Гавриш Л.І., Остапченко Л. І., Дробінська О.В.

Рис. 2. Активність протеїнкінази О (РКО) у плазматичних мембранах ( □ ) та цитозолі ( ) клітин слизової

оболонки товстого кишечника щурів за умов розвитку експериментального виразкового коліту та на початкових стадіях онкопатологій (М±т, п=6).

Після введення проканцерогену на 8 тиждень нами встановлено зниження активності мембранозв’язаної і цитозольної фракцій РКА до рівня контрольних величин і суттєве зниження активності мембранозв’ язаної і цитозольної фракції РКО.

На 10 тиждень після введення канцерогену нами встановлено статистично достовірне підвищення активності мембранозв’язаної (на 300%) і цитозольної (на 40%) фракцій протеінкінази А та підвищення активності мембранозв’ язаної і цитозольної фракції протеінкінази О більш ніж на 200% порівняно з контролем.

Отримані нами результати співвідносяться з даними літератури, де показано, що зміни рівня сАМР і сОМР прямо пов’язані з наявністю онкологічного процесу [12]. В трансформованих клітинах порушується склад і структура ліпідів мембран, знижується рівень циклічних нуклеотидів, що впливає на активність мембранозв’язаної і цитозольної форм РКА і РКО і є характерним для клітин з високим рівнем проліферації. Подальший процес злоякісної трансформації проявляється на 10 тиждень введення проканцерогену і характеризується як помірно диференційований рак слизової оболонки товстого кишечника. У цей термін досліджень нами встановлено підвищення активності мембранозв’язаної і цитозольної фракцій протеінкінази А та протеінкінази О в областях новоутворень. На відміну від пухлин іншої локалізації, при канцерогенезі у товстому кишечнику новоутворення формуються із клітин, які мають підвищену експресію протеінкінази О [7].

ВИСНОВКИ

Таким чином, в результаті проведених досліджень нами встановлено порушення процесів всмоктування і секреції води та електролітів на 3-7 добу після введення декстран сульфат натрієвої солі, що супроводжується накопиченням слизу в колоноцитах. За таких умов активність мембранозв’ язаної і цитозольної фракцій

протеінкінази А і протеінкінази G знижувалась. В подальші терміни досліджень (7 доба) на фоні симптомів гострого запалення спостерігалось статистично достовірне зростання активності досліджуваних ферментів в 2 рази. На 2-S тиждень після введення канцерогену нами виявлені локальні потовщення слизової оболонки і аномальні

новоутворення в проксимальному відділі товстого кишечника. Активність мембранозв’ язаної і цитозольної фракцій протеінкінази А і

протеінкінази G у ці ж терміни досліджень поступово знижувалась, але не досягала контрольних величин, що свідчить про залучення циклонуклеотидзалежної ланки внутрішньоклітинної сигналізації у механізми регуляції

іонного транспорту, проліферації і диференціації клітин слизової оболонки товстої кишки.

Література

1. Podolsky D.K. Inflammatory Bowel Disease //The new Eng J of Med. - 2002. - Vol.347,#6, - P.417-429.

2. Kunzelmann К., Mall М. Electrolyte Transport in the Mammalian Colon: Mechanisms and Implications for Disease //Physiological Reviews.- 2002.-Vol. S2, No. 1.-Р. 245-2S9.

3. Shabb J.B. Physiological Substrates of cAMP-Dependent Protein Kinase //Chem. Rev. - 2001. -Vol. 101. - P. 2381-2411.

4. Златкина А. Р., Белоусова Е. А., Винницкий Л., И., Воробьева Н. Т. Состояние циклазной системы при язвенном колите//Клин. мед. - 1988. - №10. - С.10-13.

5. Griffioen G., Thevelein J.M. Molecular mechanisms controlling the localisationof protein kinase A //Curr Genet. - 2002. - Vol. 41. - P. 199-207.

6. Liu L., Li H, Underwood T., LloydM., David M., Sperl G., Pamukcu R., Thompson W.J. Cyclic GMP-Dependent Protein Kinase Activation and Induction by Exisulind and CP461 in Colon Tumor Cells // The j pharmac. and exp. ther. - Vol. 299. - № 2. -Р.583-592.

7. Deguchi A., Thompson W.J., Weinstein I.B. Activation of protein kinase G is sufficient to induce apoptosis and inhibit cell migration in colon cancer cells. // Cancer Res. - 2004. - Vol. 64. - № 11. - P.3966-3973.

8. Sayer B., Lu J., Green C., Soderholm J.D., Akhtar M., McKay D.M. Dextran sodium sulphate-induced colitis perturbs muscarinic cholinergic control of colonic epithelial ion transport // British Journal of Pharmacology. - 2002. - Vol. 135. - P. 1794-1800.

9. Wang J.-G., Wang D.-F., Lev B.-J., Si J.-M. A novel mouse model for colitis-associated colon carcinogenesis induced by 1,2-dimethylhydrazine and dextran sulfate sodium // World J Gastroenterol. - 2004. - Vol. 10, №20, - P.2958-2962.

10. Roediger W. E. W., Truelove S. C. Methods of preparing isolated colonic epithelial cells (colonocytes) for metabolic studies // Gut. -1979.-Vol. 20.-P. 484-488.

11. Gill G. N., Walton G.M. Assay of cyclic nucleotide dependent protein kinase // Advances in cyclic nucleotides research / Eds. G. Brooker, P. Greengard/. -1979 - Vol.10. - P. 93-105.

12. Little B. Radiation carcinogenesis // Carcinogenesis. -2000. - Vol. 21, №3. - P.397-404.

THE CYCLIC-DEPENDENT PROTEIN KINASES ACTIVITY IN RAT COLON CELLS UNDER ULCER COLITIS

Kravchenko O.O., Gavrish L.I., Ostapchenko L.I., Drodinska O.V.

The cyclic nucleotide dependent protein kinase activities were investigated in rat colonocytes under ulcer colitis and colon malignancy development. The decreasing of PKG activity in colonocyte particulate fraction was established under diarrhea syndrome and earlier colitis phase. The cytoplasmic cAMP- and cGMP-dependent kinase activities were shown increasing during next stages of investigation.

Key words: PKA, PKG, ulcer colitis, colonocyte, cAMP, cGMP.

АКТИВНОСТЬ ЦИКЛОНУКЛЕОТИД ЗАВИСИМЫХ ПРОТЕИНКИНАЗ В КЛЕТКАХ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА КРЫС ПРИ УСЛОВИИ РАЗВИТИЯ ЯЗВЕННОГО КОЛИТА

Кравченко О.О., Гавриш Л.И., Остапченко Л. И., Дробинская Л.В.

Исследована активность цАМФ и цГМФ-зависимых протеинкиназ в цитоплазматической и мембранной фракциях колоноцитов толстого кишечника крыс при развитии экспериментального язвенного колита с последующей трансформацией клеток. Показано, что в механизмы развития диарейного синдрома и начальных стадий колита вовлечена мембраносвязанная форма РКG, активность которой снижалась в начальные сроки наблюдения. В последующие етапы развития воспаления и перерождения наблюдалось возрастание активности цитоплазматичесой фракции исследованных ферментов.

Ключевые слова: ПКА, ПК^, язвенный колит, колоноцит, цАМФ, цГМФ.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.