CC BY
6
ORIGINAL RESEARCHES
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
https://doi.org/10.36233/0507-4088-149 © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Адъювантное действие дисперсного фуллерена С60 на иммунный ответ против конструкций, имитирующих аминокислотные и нуклеотидные последовательности неструктурного белка NS5B вируса гепатита С
Масалова О.В.1, Леснова Е.И.1, Андреев С.М.2, Шершакова Н.Н.2, Козлов В.В.1, Пермякова К.Ю.13, Демидова Н.А.1, Валуев-Эллистон В.Т.4, Турецкий Е.А.25, Иванов А.В.4, Николаева Т.Н.1, Хаитов М.Р.26, Пронин А.В.1, Кущ А.А.1
1ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва, Россия;
2ФГБУ «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, г. Москва, Россия;
3ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»
Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 109472, г. Москва, Россия;
4ФГБУН «Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта» Российской академии наук, 119991, г. Москва, Россия; 5ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Россия;
6ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России, 117997, г. Москва, Россия
Введение. Вакцина против гепатита С пока не разработана. Рекомбинантные белки и плазмиды, кодирующие белки вируса гепатита С (ВГС), - компоненты кандидатных вакцин - индуцируют слабый иммунный ответ и требуют использования адъювантов.
Цель работы - изучить адъювантную способность водного раствора фуллерена С60 при иммунизации мышей рекомбинантным белком NS5B (rNS5B) ВГС - РНК-зависимой РНК-полимеразой, а также плазмидой pcNS5B, экспрессирующей этот белок.
Материалы и методы. Водный раствор дисперсного фуллерена (dnC60) получен методом ультрафильтрации. Мышей C57BL/6 иммунизировали rNS5B подкожно, pcNS5B - внутримышечно в смеси с разными дозами dnC60 трёхкратно, затем оценивали гуморальный и клеточный ответ на ВГС.
Результаты. Показано, что иммунизация мышей rNS5B в смеси с dnC60 в дозах 2-50 мкг/мышь приводила к значительной индукции гуморального ответа: дозозависимый прирост титров антител IgG1 был в 7-20 раз выше. Усиления клеточного ответа к rNS5B при введении с dnC60 не наблюдалось: продукция IFN-y лимфоцитами, стимулированными in vitro, не увеличивалась; антитела изотипа IgG2a - маркера Th1 звена иммунного ответа - не обнаруживались. Гуморальный ответ на ДНК-иммунизацию был слабым у мышей всех групп, получавших pcNS5B. Клеточный ответ при введении плазмиды в смеси с dnC60 подавлялся. Показана обратная зависимость индекса стимуляции пролиферации лимфоцитов в ответ на специфические стимуляторы in vitro от дозы dnC60, снижение количества клеток, синтезирующих IFN-y, в реакции ELISpot, сокращение популяции CD8+-лимфоцитов.
Заключение. Дисперсный фуллерен dnC60 представляется весьма обещающим адъювантом для повышения иммуностимулирующей активности слабоиммуногенных белков, к которым относятся белки ВГС, включая поверхностные, важные для протективного ответа. Для повышения способности dnC60 усиливать клеточный иммунный ответ на компоненты кандидатной вакцины необходимы дальнейшие исследования.
Ключевые слова: вирус гепатита С; неструктурный белок NS5B; ДНК-иммунизация; фуллерен Сеа адъ-юванты; иммунный ответ
Для цитирования: Масалова О.В., Леснова Е.И., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Козлов В.В., Пермякова К.Ю., Демидова Н.А., Валуев-Эллистон В.Т., Турецкий Е.А., Иванов А.В., Николаева Т.Н., Хаитов М.Р., Пронин А.В., Кущ А.А. Адъювантное действие дисперсного фуллерена С60 на иммунный ответ против конструкций, имитирующих аминокислотные и нуклеотидные последовательности неструктурного белка NS5B вируса гепатита С. Вопросы вирусологии. 2022; 67(6): 516-526. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-149 Для корреспонденции: Масалова Ольга Владимировна, д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник, заведу-ющлы лабораторией клеточной инженерии ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, г. Москва, Россия. E-mail: ol.mas@mail.ru
Участие авторов: Масалова О.В. - концепция и дизайн исследования, анализ и интерпретация данных, подготовка текста; Леснова Е.И. - проведение экспериментов; Андреев С.М. - проведение экспериментов, редактирование статьи; Шершакова Н.Н. - проведение экспериментов; Козлов В.В. - проведение экспериментов, анализ и интерпретация данных, редактирование статьи; Пермякова К.Ю. - проведение экспериментов; Демидова Н.А. -проведение экспериментов; Валуев-Эллистон В.Т. - проведение экспериментов; Турецкий Е.А. - проведение экс-
периментов; Иванов А.В. - проведение экспериментов, редактирование статьи; Николаева Т.Н. - проведение экспериментов, редактирование статьи; Хаитов М.Р - редактирование статьи; Пронин А.В. - редактирование статьи; Кущ А.А. - концепция и дизайн исследования, редактирование статьи. Финансирование. Исследование выполнено за счёт государственного бюджета. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). Протокол исследования одобрен Этическим комитетом ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (Протокол № 10 от 07.06.2021).
Поступила 29.10.2022 Принята в печать 10.12.2022 Опубликована 30.12.2022
ORIGINAL ARTICLE
https://doi.oig/10.36233/0507-4088-149
Adjuvant effect of dispersed fullerene C60 on the immune response to constructs harboring amino acid and nucleotide sequences of hepatitis C virus nonstructural NS5B protein
Olga V. Masalova1, Ekaterina I. Lesnova1, Sergey M. Andreev2, Nadezda N. Shershakova2, Vyacheslav V. Kozlov1, Kristina Yu. Permyakova13, Natalia A. Demidova1, Vladimir T. Valuev-Elliston4, Evgeny A. Turetskiy25, Alexander V. Ivanov4, Tatiana N. Nikolaeva1, Musa R. Khaitov26, Alexander V. Pronin1, Alla A. Kushch1
1Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russia;
2NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, 115522, Moscow, Russia;
3Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology — MVA by K.I. Skryabin», 109472, Moscow, Russia;
4Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 119991, Moscow, Russia; 5Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), 119991 Moscow, Russia; 6Pirogov Russian National Research Medical University, 119997, Moscow, Russia
Introduction. A vaccine against hepatitis C has not yet been developed. Recombinant proteins and plasmids encoding hepatitis C virus (HCV) proteins, the components of candidate vaccines, induce a weak immune response and require the use of adjuvants.
The aim of the work was to study the adjuvant action of an aqueous solution of fullerene C60 during immunization of mice with HCV recombinant protein NS5B (rNS5B) that is an RNA-dependent RNA polymerase, or with NS5B-encoding pcNS5B plasmid.
Materials and methods. An aqueous solution of dispersed fullerene (dnC60) was obtained by ultrafiltration. C57BL/6 mice were immunized with rNS5B subcutaneously, pcNS5B - intramuscularly mixed with different doses of dnC60 three times, then the humoral and cellular response to HCV was evaluated.
Results. Mice immunization with rNS5B in a mixture with dnC60 at doses of 2-50 |jg/mouse significantly induced humoral response: a dose-dependent increase in IgG1 antibody titers was 7-20 times higher than in the absence of fullerene. There was no increase in the cellular response to rNS5B when administered with dnC60. The humoral response to DNA immunization was weak in mice of all groups receiving pcNS5B. The cellular response was suppressed when the plasmid was injected in a mixture with dnC60.
Conclusions. Dispersed fullerene dnC60 is a promising adjuvant for increasing the immunostimulating activity of weakly immunogenic proteins including surface and other HCV proteins, important for a protective response. Further research is needed to enhance the ability of dnC60 to boost the cellular immune response to the components of the candidate vaccine.
Keywords: hepatitis C virus; nonstructural NS5B protein; DNA immunization; fullerene C6(y adjuvants; immune response
For citation: Masalova O.V., Lesnova E.I., Andreev S.M., Shershakova N.N., Kozlov V.V., Permyakova K.Yu., Demidova N.A., Valuev-Elliston V.T., Turetskiy E.A., Ivanov A.V., Nikolaeva T.N., Khaitov M.R., Pronin A.V., Kushch A.A. Adjuvant effect of dispersed fullerene C60 on the immune response to constructs harboring amino acid and nucleotide sequences of hepatitis C virus nonstructural NS5B protein. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2022; 67(6): 516-526 (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-149
For correspondence: Olga V. Masalova, Dr. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Cell Engineering, Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation; 123098, Moscow, Russia. E-mail: ol.mas@mail.ru
ORIGINAL RESEARCHES
Information about the authors:
Masalova O.V., https://orcid.org/0000-0001-5571-5669 Lesnova E.I., https://orcid.org/0000-0002-2801-6843 Andreev S.M., https://orcid.org/0000-0001-8297-579X Shershakova N.N., https://orcid.org/0000-0001-6444-6499 Kozlov V.V., https://orcid.org/0000-0002-0502-4824 Permyakova K.Yu., https://orcid.org/0000-0002-3579-4416 Demidova N.A., https://orcid.org/0000-0003-1961-9789 Valuev-Elliston V.T., https://orcid.org/0000-0003-0365-570X Turetskiy E.A., https://orcid.org/0000-0002-6822-3409 Ivanov A.V., https://orcid.org/0000-0002-5659-9679 Nikolaeva T.N., https://orcid.org/0000-0001-6226-7251 Khaitov M.R., https://orcid.org/0000-0003-4961-9640 Pronin A.V., https://orcid.org/0000-0001-5266-9783 Kushch A.A., https://orcid.org/0000-0002-3396-5533
Contribution: Masalova O.V. - the study concept design, analysis and interpretation of the data, preparing of the text; Lesnova E.I. - conducting of the experiments; Andreev S.M. - conducting of the experiments, review and editing; Shershakova N.N. - conducting of the experiments; Kozlov V.V. - conducting of the experiments, analysis and interpretation of the data, review and editing; Permyakova K.Yu. - conducting of the experiments; Demidova N.A. - conducting of the experiments; Valuev-Elliston V.T. - conducting of the experiments; Turetskiy E.A. - conducting of the experiments; Ivanov A.V. - conducting of the experiments, review and editing; Nikolaeva T.N. - conducting of the experiments, review and editing; Khaitov M.R. - review and editing; Pronin A.V. - review and editing; Kushch A.A. - the study concept design, review and editing.
Funding. The research was funded by the state budget. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with Consensus Author Guidelines for Animal Use (IAVES, July 23, 2010). The research protocol was approved by the Ethics Committee of the Gamaleya NRC of Epidemiology and Microbiology (Protocol No 10 dated June 7, 2021).
Received 29 October 2022 Accepted 10 December 2022 Published 30 December 2022
Введение
Гепатит С признан одной из главных причин хронических заболеваний печени, включая терминальные стадии - цирроз и гепатокарциному. До 80% случаев острого гепатита С переходят в хроническую форму, вызывая хронический гепатит С, что объясняется повышенной частотой мутаций вируса гепатита С (ВГС), интерференцией вирусных белков с факторами врождённого и адаптивного иммунитета хозяина, образованием эскейп-вариантов ВГС, ускользающих от иммунного ответа [1].
Долгое время проблема эффективного лечения гепатита С оставалась нерешённой, так как стандартная терапия, основанная на сочетании пегилированного рекомбинантного интерферона (1Ш) а и рибавирина, позволяла излечивать не более половины пациентов и сопровождалась серьёзными побочными эффектами [2]. В 2014 г. в терапии гепатита С произошёл прорыв: благодаря применению пангенотипных препаратов прямого противовирусного действия (ПП-ПД), блокирующих вирусные ферменты N33, ^5В и №5А, число пациентов с устойчивым исчезновением вируса из периферической крови превысило 95% [3]. Это событие называют новой эрой в лечении гепатита С. Однако со временем выявился ряд фактов, показывающих, что точку в решении проблемы гепатита С ставить рано. Так, ПППД крайне дороги, что делает лечение малодоступным. Исследования последних лет показали, что исчезновение вируса при
действии ПППД не приводит к полной нормализации функций лимфоцитов: не восстанавливается пролиферация Т-клеток, продолжается синтез цитокинов, вызывающих воспаление и фиброз, наблюдается экспансия супрессорных клеток [4, 5]. Мало изучены отдалённые последствия блокирования вирусных ферментов, так как ВГС может оставаться в печени и клетках крови после исчезновения вирусной РНК в плазме периферической крови [6, 7]. При лечении ПППД часто отмечается реактивация вирусов других таксономических групп [8, 9]. Успешная элиминация ВГС с помощью ПППД не защищает от реинфекции.
Отсутствие вакцины - главное препятствие в контроле за гепатитом С [10]. Доказано, что эффективная вакцина должна стимулировать мощный мульти-эпитопный и функциональный клеточный иммунный ответ, а также индуцировать высокоактивные вирус-нейтрализующие антитела [11]. Усугубляет проблему разработки вакцин отсутствие адекватной лабораторной модели гепатита С на животных [12]. Поэтому на начальных этапах разработки вакцин используют стандартный подход, который заключается в анализе эффективности иммунного ответа, индуцированного вакцинами, в иммунокомпетентных мышах [13].
Основой для разработки вакцин служат генно-инженерные продукты, имитирующие последовательности ВГС: рекомбинантные белки, пептиды, представляющие В- и Т-клеточные эпитопы, ДНК в составе плазмид и вирусных векторов. Что касается рекомбинантных белков в качестве вакцинных пре-
паратов, то основная проблема состоит в их слабой иммуногенности, в том числе в недостаточной индукции В-клеточного ответа. При ДНК-иммунизации иммунный ответ носит в основном Т-клеточную направленность, тогда как образования антител практически не наблюдается. Несмотря на испытания многочисленных вакцин против гепатита С разного состава, ни одна из них пока не одобрена для применения, что в значительной степени связано с отсутствием высокоэффективных адъювантов [14, 15].
В связи с этим большой интерес представляют углеродсодержащие наноматериалы, в том числе фул-лерены [16]. Они нетоксичны, биосовместимы; это сильные антиоксиданты, некоторые из них обладают выраженной противовоспалительной и противовирусной активностью [17-21], могут ингибировать фиброз печени и предотвращать цирроз в экспериментальной крысиной модели [22]. Эти препараты могут повышать иммуногенность за счёт комплексования иммуногена и формирования мультиплетной структуры, а также улучшения транспорта в антигенпре-зентирующие клетки с дальнейшим процессингом. Например, фуллеренол - гидроксилированный фулле-рен C60(OH)22 - испытывали как адъювант для иммунизации животных вирусными белками и ДНК-вакциной. Результаты показали, что такие наночастицы обладают иммуномодулирующей активностью, усиливая врождённый иммунный ответ через активацию различных Toll-подобных рецепторов дендритных клеток и макрофагов [23, 24]. В последние годы на основе легко масштабируемой зелёной технологии была разработана водорастворимая нанодисперсная форма немодифицированного фуллерена С60 (dnC60); она проявляет противовоспалительный, противовирусный и ранозаживляющий эффекты и относится к группе нетоксичных субстанций [19, 25, 26].
Целью настоящей работы было выяснение способности водного раствора dnC60 оказывать иммуностимулирующее действие при введении мышам компонентов кандидатной вакцины против гепатита С -рекомбинантного белка NS5B ВГС - РНК-зависимой РНК-полимеразы, а также ДНК-конструкции, кодирующей этот белок.
Материалы и методы
Рекомбинантный белок NS5B ВГС (rNS5B) -
полноразмерный белок без С-концевого гидрофобного участка, содержащего 21 аминокислотный остаток (а.о.), (2420-3011 а.о., генотип 1b) был экспрессиро-ван в Escherichia coli и очищен на агарозе Ni-NTA (никель - нитрилоацетат), как описано ранее [27]. Его использовали как иммуноген при иммунизации мышей, как антиген для стимуляции Т-клеточных реакций in vitro, а также как сорбент в иммунофермент-ном анализе (ИФА) для оценки продукции антител.
Синтетические олигопептиды синтезированы в НПО «Иммунотэкс» (БелкиАнтитела.РФ, г. Ставрополь, Россия) с чистотой более 98%, аминокислотные последовательности приведены в таблице. Пептиды имитировали ВГС-специфические эпитопы цитоток-
сических лимфоцитов (CTL) и Т-хелперов 1-го типа (Th1); их использовали как стимуляторы Т-клеточных реакций in vitro. Поиск эпитопов проводили в соответствии с картированными последовательностями [28-32] с использованием ресурса Immune Epitope Database Analysis Resource1.
Плазмида pcNS5В, кодирующая полноразмерный белок NS5B ВГС, получена на основе вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen, США) и описана ранее [33, 34].
Дисперсный фуллерен dnC60. Водный раствор фуллерена (dnC60) был получен ультрафильтрационным методом из высокоочищенного фуллерена (99,95%, «НеоТекПродакт», Россия), как описано ранее [19, 25]. Этот метод обеспечивает высокий выход фуллерена C60 без использования ультразвука и нагревания, при этом гидродинамический размер частиц, определённый методом динамического светорассеяния, составляет около 200 нм. В настоящей работе исходная концентрация стерильного раствора была 1 мг/мл. Дозы рассчитывали с учётом весового содержания С60, определённого по оптической плотности раствора при 340 нм (коэффициент молярной экстинкции 50 200).
Мыши. Для экспериментов in vivo использовали самок мышей инбредной линии C57BL/6 (Н-2Ь) в возрасте 6-8 недель (средний вес 20 ± 3 г), полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая».
Иммунизация мышей. Проводили две серии экспериментов по испытанию иммуностимулирующей активности dnC60 на модели рекомбинантного белка rNS5B и ДНК-конструкции pcNS5B. Белок rNS5B вводили мышам подкожно в корень хвоста в дозе 4 мкг/ мышь либо в физиологическом растворе (ф/р), либо в смеси с dnC60 в дозах 2, 10 и 50 мкг/мышь. Плаз-миду pcNS5B вводили в дозе 100 мкг/мышь внутримышечно в четырёхглавую мышцу бедра задних лап, в ф/р или в смеси с dnC60 в дозах 5 и 25 мкг/мышь. Контрольным группам мышей вводили ф/р. Иммунизации проводили трёхкратно с интервалом 2 недели, через 7-9 дней после последней инъекции учитывали иммунный ответ индивидуально для каждой мыши (n = 8 в каждой группе).
Оценка иммунного ответа, гуморальный ответ. Активность взаимодействия антител к белку rNS5B ВГС в сыворотках крови мышей определяли методом непрямого ИФА, как описано ранее [33]. 96-луночные планшеты сенсибилизировали rNS5B в фосфатно-со-левом буфере, pH 7,2 (PBS), в концентрации 1 мкг/мл в течение ночи при комнатной температуре. В качестве вторичных использовали антитела к иммуноглобулинам мыши изотипов IgG1 и IgG2a, конъюгирован-ные с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США), в качестве субстрата пероксида-зы - тетраметилбензидин (Sigma, США); оптическую плотность измеряли при 450 нм. За титр сывороток в ИФА принимали предельное разведение сыворотки
1T Cell Epitope Prediction Tools. Available from: http://tools. immuneepitope.org/main/tcell/.
ORIGINAL RESEARCHES
крови, при котором значение оптической плотности при А450 в 2 раза превышало значение для контрольного образца (сыворотка крови неиммунизированных мышей).
Анализ пролиферации лимфоцитов иммунизированных мышей проводили in vitro по включению в лимфоциты [3Н]-тимидина. Для получения лимфоцитов селезёнки диспергировали, клеточные суспензии процеживали через ситечки с размером пор 100 мкм (BD Falcon Cell Srtainers, США), дважды отмывали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия). Лимфоциты помещали в 96-луночные культуральные панели по 5 х 105 клеток в лунку в среде RPMI-1640, содержащую 20% эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, США), 2 мМ глутамина, 4,5 г/л глюкозы, 50 мкг/мл гентамицина, 0,2 ед/мл инсулина. К клеткам добавляли стимулятор -рекомбинантный белок NS5B в конечной концентрации 1 мкг/мл и культивировали при 37 °C в атмосфере 5% СО2 в течение 5 сут. Культуральные жидкости отбирали для анализа цитокинов, в клетки добавляли свежую среду с [3Н]-тимидином (1 мкКи/лунка) (ФГБУ «Институт молекулярной генетики НИЦ «Курчатовский институт» РАН). Через 18 ч радиоактивность в клетках измеряли с помощью ß-счетчика MicroBeta2 (PerkinElmer, США). Рассчитывали индекс стимуляции пролиферации (ИСП) как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимуляторами к радиоактивности в лунках со средой.
Измерение концентрации IFN-y в культуральных жидкостях, полученных после стимуляции лимфоцитов, проводили методом ИФА с помощью наборов Mouse IFN-y ELISA development kit (HRP) (Mabtech, Швеция) в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию цитокина определяли по калибровочным кривым стандартных образцов. Предел чувствительности для IFN-y составлял 2 пг/мл.
Определение количества IFN-у-секретирующих клеток проводили методом ELISpot c использованием тест-системы Mouse IFN-y ELISpotPLUS kit (ALP)
(Mabtech, Швеция). Изолированные спленоциты (4 х 10 5 клеток в лунке) инкубировали с иммобилизованными на 96-луночных планшетах антителами к IFN-y мыши течение 2,5 сут при 37 °C в атмосфере 5% СО2 в присутствии стимуляторов - rNS5B (1 мкг/мл) и пептидов (1 и 5 мкг/мл в двух повторах, данные усредняли). Окрашивание клеток проводили в соответствии с инструкцией. Окрашенные пятна (spots, споты) детектировали визуально с помощью стереоскопического микроскопа МБС-10 (ОАО «ЛЗОС», Россия). Результаты выражали как разницу в количестве спотов на 106 клеток в лунках в присутствии стимуляторов и в контрольных лунках без стимуляторов (со средой).
Определение фенотипа лимфоцитов методом проточной цитометрии. Лимфоциты, выделенные из селезёнок иммунизированных мышей, анализировали методом проточной цитометрии с использованием меченных флуорохромами антител к кластерам дифференцировки CD4 и CD8 (BD Biosciences, США). Окрашивание клеток (106 клеток/проба) проводили по стандартной методике, рекомендованной производителем. Измерения выполняли на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto™ II (США), результаты анализировали с помощью программы BD FACSDiva v.6.1.3 (BD Biosciences, США).
Для статистической обработки результатов использовали программы Statistica 8.0 и GraphPad Prism 7. Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение. Для сравнения параметрических количественных данных использовали t-test (критерий Стьюдента), непараметрических - U-test (критерий Манна-Уитни). Значения р < 0,05 принимались как статистически значимые.
Результаты
В первой серии экспериментов изучали способность dnC60 в дозах 2, 10 и 50 мкг/мышь проявлять адъювантные свойства при иммунизации рекомби-
Таблица. Характеристика синтетических олигопептидов из региона белка NS5B вируса гепатита С Table. Characteristics of synthetic oligopeptides from hepatitis C virus NS5B protein
Обозначение Designation Позиция аминокислотных остатков Amino acid positions По следовательно сть Sequence Характеристика эпитопа Epitope characteristics Источник Reference
р1 2726-2733 AGLQDCTM CTL, синтез IFN-y CTL, IFN-y release N. Himoudi и соавт. [28], S. Vertuani и соавт. [32]
р2 2555-2563 TTIMAKNEV CTL, консервативный CTL, conservative A. Ikram и соавт. [29]
р3 2576-2584 ARLIVFPDL CTL, протективный, синтез IFN-y CTL, protective, IFN-y release N. Himoudi и соавт. [28]
р4 2594-2601 LYDVVSKL CTL, синтез IFN-y CTL, IFN-y release N. Himoudi и соавт. [28], A.C. Tan и соавт. [31]
р5 2820-2827 RHTPVNSW CTL, протективный CTL, protective K. Nitschke и соавт. [30]
р6 2423-2430 SYSWTGAL Th1 A. Ikram и соавт. [29]
нантным белком rNS5B ВГС. Среднегеометрический титр антител IgG1 к NS5B, введённого в ф/р (группа 1), составил 1 : 105 (рис. 1 а), антител изотипа IgG2a обнаружено не было (титр < 1 : 100). У мышей, которых иммунизировали белком rNS5B ВГС в смеси с dnC60 (группы 2-4), был зарегистрирован дозо-зависимый эффект увеличения уровня антител IgG1 в 7, 10 и 20 раз соответственно (p < 0,05) (рис. 1 а, б); антитела изотипа IgG2a не выявлялись.
Клеточный ответ оценивали по пролиферации лимфоцитов in vitro и секреции ими IFN-y в ответ на
стимуляцию rNS5B. Оба показателя были на низком уровне, варьировали среди индивидуальных мышей, статистически значимо не различаясь как между группами, которым вводили рекомбинантный белок, так и с контрольной группой, которая получала только ф/р (рис. 2).
При проведении экспериментов in vivo не было зарегистрировано ни падежа иммунизированных мышей, ни потери ими массы тела. Поведенческие реакции у животных контрольной и опытных групп не различались. Однако при вскрытии животных
Рис. 1. Активность антител изотипа IgG1 к реком-бинантному белку rNS5B вируса гепатита С в сыворотках мышей, иммунизированных rNS5B в смеси с дисперсным фуллереном: а - кривые титрования сывороток в ИФА; б - кратность увеличения титров антител в группах мышей, за единицу принят титр антител в группе 1 (1 : 105). ОП - оптическая плотность при 450 нм.
*Статистически значимые различия (p < 0,05) по сравнению с группой 1, которой rNS5B вводили с
физиологическим раствором. Fig. 1. Activity of IgG1 antibodies to the recombinant HCV rNS5B protein in the sera of mice immunized with rNS5B in a mixture with dispersed fullerene: a - sera titration curves in ELISA; b - the increase of antibody titers in groups of mice, the antibody titer in group 1 (1 : 105) was taken as a unit. OD - optical
density at 450 nm. * p < 0.05 compared to group 1, to which rNS5B was administered with saline solution (saline).
пролиферация proliferation
секреция IFN-y IFN^y secretion
ZZ3
о
ф/р (гр.1) saline (Gr1)
2 мкг dnC60 (rp.2) 2 цд dnC60 (Gr2)
10 мкг dnC60 (rp.3) 10 цд dnC60 (Gr3)
50 мкг dnC60 (rp.4) 50 цд dnC60 (Gr4)
К
Control
Рис. 2. Клеточный ответ к рекомбинантному белку NS5B в спленоцитах мышей, иммунизированных rNS5B в смеси с дисперсным фуллереном. Пролиферативный ответ лимфоцитов выражен в виде индекса стимуляции пролиферации, секреция IFN-y - концентрация в пг/мл; индекс стимуляции пролиферации рассчитывали как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимуляторами к радиоактивности в лунках со средой. Контрольной группе вводили только физиологический раствор.
Fig. 2. Cellular response to recombinant NS5B protein in splenocytes of mice immunized with rNS5B in a mixture with dispersed fullerene. The lymphocyte proliferation is expressed as a stimulation index (SI); IFN-y secretion is a cytokine concentration in culture fluids by ELISA, in pg/ml; SI was calculated as the ratio of radioactivity (in cpm/min) in wells with stimulants to radioactivity in wells with medium alone.
The control group (Control) was administered saline alone.
ORIGINAL RESEARCHES
в группе 4, получивших 50 мкг dnC60, наблюдались жировые отложения на внутренних органах - печени, желудке, селезёнке. При этом органы были слегка увеличены в размерах, нормального цвета. Можно судить о первой (начальной) степени ожирения. Ткань печени и почек при визуальной оценке не была изменена. В связи с этим в следующих экспериментах мы вдвое уменьшили максимально использованную дозу ^с60.
Изучение способности dnC60 проявлять стимулирующую активность проводили при иммунизации плазмидой, кодирующей ген №5В, фуллерен вводили в дозах 5 и 25 мкг/мышь. Гуморальный ответ на ДНК-иммунизацию был слабым у мышей всех групп, получавших рс^5В: титры антител к целевому белку обоих изотипов не превышали 1 : 100.
Рис. 3. Снижение пролиферативной активности in vitro спле-ноцитов мышей, иммунизированных плазмидой pcNS5B с дисперсным фуллереном, в ответ на стимуляцию белком rNS5B. Индекс стимуляции пролиферации рассчитывали как отношение радиоактивности (в имп/мин) в лунках со стимулятором
(rNS5B) к радиоактивности в лунках со средой. *Статистически значимые различия (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой, которой вводили только физиологический раствор.
Fig. 3. Reduction of lymphocyte proliferation of mice immunized with pcNS5B plasmid with dispersed fullerene in response to in vitro stimulation by rNS5B protein. The stimulation index (SI) was calculated as the ratio of radioactivity (in cpm/min) in wells with stimulants to radioactivity in wells with medium alone. *p < 0.05 compared to the control group (Control), which was administered saline alone.
В процессе оценки Т-клеточного иммунного ответа показано, что при стимуляции спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных pcNS5B, была выявлена активная пролиферация лимфоцитов в ответ на rNS5B. При этом ИСП у мышей группы 1 достигал 8 (рис. 3). При иммунизации плазмидой в смеси с dnC,Qнаблюдалась обратная зависимость показателя ИСП от дозы dnC60.
Анализ количества лимфоцитов, синтезирующих IFN-y, проводили in vitro методом ELISpot. В качестве стимуляторов клеток использовали rNS5B и 6 пептидов, имитирующих Т-клеточные эпитопы белка. Как показано на рис. 4, все антигены вызывали формирование спотов в группе 1, в группах 2 и 3 - только один из пептидов и rNS5B, но в значительно меньшем количестве.
Подсчёт популяций Т-клеток в селезёнках иммунизированных мышей проводили методом проточной цитометрии. Установлено статистически значимое снижение (р < 0,0001) Th/CD4+ во всех экспериментальных группах, получивших плазмиду, по сравнению с контрольной группой, которой вводили только ф/р, показатели не зависели от концентрации dnC60 (рис. 5). В случае CTL/CD8+ наблюдалась другая картина: данная популяция клеток была снижена только в группах 2 и 3, иммунизированных с добавлением
dnC60 (р < 0,0001).
Обсуждение
В качестве кандидата для включения в вакцину был выбран неструктурный белок NS5B ВГС, так как это один из важнейших ферментов вируса и мишень для действия ряда ПППД; в нём картировано самое большое число, по сравнению с другими вирусными белками, консервативных Т-клеточных эпитопов, важных для индукции эффективного иммунного ответа [35]. Результаты работы показали высокую эффективность водного раствора дисперсного фуллерена в стимуляции гуморального ответа на белок NSB: при трёхкратном введении прирост титров антител в зависимости от дозы dnC60 был в 7-20 раз выше. Ранее на модели рекомбинантного белка NS4 ВГС мы показали, что водорастворимые производные фуллерена С60 с глюкозаминилмурамилдипептидом и натриевой со-
Рис. 4. Различия в количестве IFN-у-синтезирую-щих клеток, полученных от мышей, иммунизированных плазмидой pcNS5B в присутствии/отсутствии dnC60. Результаты представлены как разница
в количестве спотов на 106 клеток в лунках со стимуляторами и в контрольных лунках без стимуляторов (со средой); р1-р6 - пептиды, перечисленные в таблице, представляющие последовательности вируса гепатита С. Fig. 4. Differences in the number of IFN-y-synthe-sizing cells obtained from mice immunized with pcNS5B plasmid in the presence/absence of dnC The results are presented as a difference in the number of spot-forming cells (SFC) per 106 cells in wells with stimulants and in control wells without stimulants (with medium alone); p1-p6 are peptides listed in Table representing HCV sequences.
Рис. 5. Определение доли лимфоцитов CD4+ и CD8+ в группах мышей, иммунизированных плаз-мидой pcNS5B в сочетании с дисперсным фулле-
реном, методом проточной цитометрии. *Сгагистически значимые различия (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой, которой вводили только физиологический раствор. Fig. 5. Determination of the proportion of CD4+ and CD8+ lymphocytes in the spleen of mice immunized with pcNS5B plasmid in combination with dispersed fullerene by flow cytometry. *p < 0.05 compared to the control group (Control), which was administered saline alone.
лью аминокапроновой кислоты на порядок усиливали гуморальный ответ, при этом антиген вводился в дозе в 5 раз большей (20 мкг/мышь) по сравнению с использованной в настоящей работе (4 мкг). Эти препараты, однако, не были эффективны при инъекции малых доз антигена и стимулировали иммунный ответ только после 4-5 иммунизаций [36]. Следует также отметить, что в работе китайских учёных применение C60(OH)22 в сочетании с тремя белками ВГС повышало гуморальный ответ только к одному из них, притом менее значительно (в 4 раза) и после 4 иммунизаций [23].
Введение белка подкожно с максимально использованной дозой dnC 50 мкг/мышь вызывало некоторые побочные эффекты. Ранее показано, что при однократном введении фуллерена С60 независимо от пути введения (внутривенный, внутрибрюш-инный, интрагастральный) препарат не обладает острым токсическим эффектом в большом диапазоне доз, вплоть до 2700 мкг/мышь [37]. Острой токсичности мы также не наблюдали; возможно, жировые отложения на внутренних органах могут объясняться неоднократной (трёхкратной) иммунизацией, а также путём введения препарата. Интересно, что при изучении противоаллергических свойств dnC60 на модели атопического дерматита у мышей показаны различные эффекты при накожном и подкожном введении препарата: только при накожной экспликации увеличивалась выработка ключевых цитокинов Thl-профи-ля интерлейкина (IL) 12 и IFN-y; в большей степени повышалась экспрессия маркера активации Т-регуля-торных клеток Foxp3, блокирующих клеточный иммунный ответ [21].
Клеточный ответ к rNS5B при иммунизации белком с dnC60 не усиливался, о чём свидетельствует отсутствие значимого увеличения пролиферации и продукции IFN-y стимулированными лимфоцитами in vitro, а также антител изотипа IgG2a - маркера Th1 звена иммунного ответа. Для изучения влияния дисперсного фуллерена на клеточный ответ при ДНК-иммунизации мышей иммунизировали плазмидой pcNS5B совместно с dnC60. Установлено, что внутримышечная иммунизация плазмидой в физиологическом растворе вызывает на достаточно высоком уровне пролифера-
цию лимфоцитов в ответ на специфический антиген и синтез IFN-y не только к rNS5B, но и к ряду пептидов - эпитопов CTL и Th1. Оказалось, что добавление dnC60 дозозависимо ингибирует клеточный ответ. В группах мышей, получивших плазмиду с дисперсным фуллереном, снижалась доля CD8+-лимфоцитов. Доля CD4+-лимфоцитов также была снижена по сравнению с контрольными мышами, но не с группой, получившей pcNS5B без dnC60.
Полученные данные согласуются с опубликованными ранее результатами о противовоспалительной активности фуллерена и дополняют их. Так, показано, что некоторые производные фуллерена С60 ингибируют активацию одного из основных провоспалительных транскрипционных факторов NF-kB [38]. С использованием экспериментальной модели на мышах в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) установлено, что введение dnC60 ингибирует продукцию цитокинов Th1-, Th2- и ТЫ7-профиля [39]. Аналогичные данные получены японскими исследователями: водная на-носуспензия кристаллического фуллерена частично подавляла ГЗТ-опосредованное воспаление, при этом также выявлено снижение секреции IL-6, IL-17 и относительный рост популяции T-регуляторных клеток [40].
Заключение
Таким образом, полученные данные демонстрируют, что препарат dnC60 представляется весьма обещающим адъювантом для повышения иммуногенности слабоиммуногенных белков, к которым относятся белки ВГС, включая поверхностные, важные для про-тективного ответа. Однако для повышения способности dnC60 усиливать клеточный иммунный ответ на компоненты кандидатной вакцины против гепатита С необходимы дальнейшие исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Dustin L.B. Innate and adaptive immune responses in chronic HCV infection. Curr. Drug Targets. 2017; 18(7): 826-43. https://doi.org/ 10.2174/1389450116666150825110532.
2. Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: standard-of-care treatment. Adv. Pharmacol. 2013; 67: 169-215. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405880-4.00005-6
ORIGINAL RESEARCHES
3. Spearman C.W., Dusheiko G.M., Hellard M., Sonderup M. Hepatitis C. Lancet. 2019; 394(10207): 1451-66. https://doi. org/10.1016/S0140-6736(19)32320-7
4. Osuch S., Metzner K.J., Caraballo Cortes K. Reversal of T cell exhaustion in chronic HCV infection. Viruses. 2020; 12(8): 799. https://doi.org/10.3390/v12080799
5. Telatin V., Nicoli F., Frasson C., Menegotto N., Barbaro F., Castelli E., et al. In chronic hepatitis C infection, myeloid-derived suppressor cell accumulation and T cell dysfunctions revert partially and late after successful direct-acting antiviral treatment. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2019; 9: 190. https://doi.org/10.3389/ fcimb.2019.00190
6. Elmasry S., Wadhwa S., Bang B.R., Cook L., Chopra S., Kanel G., et al. Detection of occult hepatitis C virus infection in patients who achieved a sustained virologic response to direct-acting antiviral agents for recurrent infection after liver transplantation. Gastroenterology. 2017; 152(3): 550-53.e8. https://doi. org/10.1053/j.gastro.2016.11.002
7. Wang Y., Rao H., Chi X., Li B., Liu H., Wu L., et al. Detection of residual HCV-RNA in patients who have achieved sustained virological response is associated with persistent histological abnormality. EBioMedicine. 2019; 46: 227-35. https://doi. org/10.1016/j.ebiom.2019.07.043
8. Holmes J.A., Yu M.L., Chung R.T. Hepatitis B reactivation during or after direct acting antiviral therapy - implication for susceptible individuals. Expert Opin. Drug Saf. 2017; 16(6): 651-72. https:// doi.org/10.1080/14740338.2017.1325869
9. Ghweil A.A., Helal M.M. Reactivation of herpesvirus in patients with hepatitis C treated with direct-acting antiviral agents. Infect. Drug Resist. 2019; 12: 759-62. https://doi.org/10.2147/IDR. S184598
10. Verma R., Khanna P., Chawla S. Hepatitis C vaccine. Need of the hour. Hum. Vacc. Immunother. 2014; 10(7): 1927-9. https://doi. org/10.4161/hv.29033
11. Bailey J.R., Barnes E., Cox A.L. Approaches, progress, and challenges to hepatitis C vaccine development. Gastroenterology. 2019; 156(2): 418-30. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.08.060
12. Ploss A., Kapoor A. Animal models of hepatitis C virus infection. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2020; 10(5): a036970. https:// doi.org/10.1101/cshperspect.a036970
13. Ahlen G., Frelin L. Methods to evaluate novel hepatitis C virus vaccines. Methods Mol. Biol. 2016; 1403: 221-44. https://doi. org/10.1007/978-1-4939-3387-7_11
14. Andrianov A.K., Fuerst T.R. Immunopotentiating and delivery systems for HCV vaccines. Viruses. 2021; 13(6): 981. https://doi. org/10.3390/v13060981.
15. Sepulveda-Crespo D., Resino S., Martinez I. Innate immune response against hepatitis C virus: targets for vaccine adjuvants. Vaccines (Basel). 2020; 8(2): 313. https://doi.org/10.3390/ vaccines8020313
16. Gaur M., Misra C., Yadav A.B., Swaroop S., Maolmhuaidh F.O., Bechelany M., et al. Biomedical applications of carbon nanomaterials: fullerenes, quantum dots, nanotubes, nanofibers, and graphene. Materials (Basel). 2021; 14(20): 5978. https://doi. org/10.3390/ma14205978
17. Barzegar A., Naghizadeh E., Zakariazadeh M., Azamat J. Molecular dynamics simulation study of the HIV-1 protease inhibit ion using fullerene and new fullerene derivatives of carbon nanostructures. Mini Rev. Med. Chem. 2017; 17(7): 633-47. https://doi.org/10.2174/ 1389557516666160609080157
18. Hurmach V., Platonov M., Prylutska S., Klestova Z., Cherepanov V., Prylutskyy Y., et al. Anticoronavirus activity of water-soluble pristine C60 fullerenes: in vitro and in silico screenings. Adv. Exp. Med. Biol. 2021; 1352: 159-72. https://doi.org/10.1007/978-3-030-85109-5_10.
19. Klimova R., Andreev S., Momotyuk E., Demidova N., Fedorova N., Chernoryzh Y., et al. Aqueous fullerene C60 solution suppresses herpes simplex virus and cytomegalovirus infections. Fuller. Nanotub. Carbon Nanostructures. 2019; 28(6): 487-99. https://doi. org/10.1080/1536383x.2019.1706495
20. Reina G., Peng S., Jacquemin L., Andrade A.F., Bianco A. Hard nanomaterials in time of viral pandemics. ACS nano. 2020; 14(8): 9364-88. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c04117
21. Shershakova N., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struchkova I., Kamyshnikov O., et al. Anti-inflammatory
effect of fullerene C60 in a mice model of atopic dermatitis. J. Nanobiotechnology. 2016; 14: 8. https://doi.org/10.1186/s12951-016-0159-z
22. Kuznietsova H., Dziubenko N., Hurmach V., Chereschuk I., Motuziuk O., Ogloblya O., et al. Water-soluble pristine C60 fullerenes inhibit liver fibrotic alteration and prevent liver cirrhosis in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2020; 2020: 8061246. https://doi. org/10.1155/2020/8061246
23. Liu J., Feng X., Chen Z., Yang X., Shen Z., Guo M., et al. The adjuvant effect of C60(0H)22 nanoparticles promoting both humoral and cellular immune responses to HCV recombinant proteins. Mater Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 2019; 97: 753-9. https://doi.org/10.1016/j.msec.2018.12.088
24. Xu L., Liu Y., Chen Z., Li W., Liu Y., Wang L., et al. Morphologically virus-like fullerenol nanoparticles act as the dual-functional nanoadjuvant for HIV-1 vaccine. Adv. Mater. 2013; 25: 5928-36. https://doi.org/10.1002/adma.201300583
25. Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A., Andreev I., et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by novel dialysis method: simple way to fullerene aqueous solution. Fuller. Nanotub. Carbon Nanostructures. 2015; 23(9): 792-800. https://doi.org/10.1080/1536383x.2014.998758
26. Shershakova N.N., Andreev S.M., Tomchuk A.A., Makarova E.A., Nikonova A.A., Turetskiy E.A., et al. Wound healing activity of aqueous dispersion of fullerene C60 produced by "green technology". Nanomedicine. 2023; 47: 102619. https://doi. org/10.1016/j.nano.2022.102619
27. Ivanov A.V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky V.O., Kukhanova M.K., et al. Development of the system ensuring a high-level expression of hepatitis C virus nonstructural NS5B and NS5A proteins. Protein Expr. Purif. 2006; 48(1): 14-23. https://doi.org/10.1016/j.pep.2006.02.011
28. Himoudi N., Abraham J.D., Fournillier A., Lone Y.C., Joubert A., Op De Beeck A., et al. Comparative vaccine studies in HLA-A2.1-transgenic mice reveal a clustered organization of epitopes presented in hepatitis C virus natural infection. J. Virol. 2002; 76(24): 1273546. https://doi.org/10.1128/jvi.76.24.12735-12746.2002
29. Ikram A., Zaheer T., Awan F.M., Obaid A., Naz A., Hanif R., et al. Exploring NS3/4A, NS5A and NS5B proteins to design conserved subunit multi-epitope vaccine against HCV utilizing immunoinformatics approaches. Sci. Rep. 2018; 8(1): 16107. https://doi.org/10.1038/s41598-018-34254-5.
30. Nitschke K., Barriga A., Schmidt J., Timm J., Viazov S., Kuntzen T., et al. HLA-B*27 subtype specificity determines targeting and viral evolution of a hepatitis C virus-specific CD8+ T cell epitope. J.Hepatol. 2014; 60(1): 22-9. https://doi.org/10.1016/jjhep.2013.08.009.
31. Tan A.C., Eriksson E.M., Kedzierska K., Deliyannis G., Valkenburg S.A., Zeng W., et al. Polyfunctional CD8(+) T cells are associated with the vaccination-induced control of a novel recombinant influenza virus expressing an HCV epitope. Antiviral Res. 2012; 94(2): 168-78. https://doi.org/10.1016/j. antiviral.2012.03.009
32. Vertuani S., Bazzaro M., Gualandi G., Micheletti F., Marastoni M., Fortini C., et al. Effect of interferon-alpha therapy on epitope-specific cytotoxic T lymphocyte responses in hepatitis C virus-infected individuals. Eur. J. Immunol. 2002; 32(1): 144-54. https://doi.org/10.1002/1521-4141(200201)32:1<144::AID-IMMU144>3.0.CO;2-X.
33. Масалова О.В., Леснова Е.И., Иванов А.В., Пичугин А.В., Пермякова К.Ю., Смирнова О.А. и др. Сравнительный анализ иммунного ответа на ДНК-конструкции, кодирующие неструктурные белки вируса гепатита С. Вопросы вирусологии. 2013; 58(2): 21-8.
34. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. Hepatitis C virus proteins activate NRF2/ARE pathway by distinct ROS-dependent and independent mechanisms in HUH7 cells. PLoS One. 2011; 6(9): e24957. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0024957
35. Rao X., Hoof I., van Baarle D., Kesmir C., Textor J. HLA preferences for conserved epitopes: a potential mechanism for hepatitis C clearance. Front. Immunol. 2015; 6: 552. https://doi. org/10.3389/fimmu.2015.00552
36. Масалова О.В., Шепелев А.В., Атанадзе С.Н., Парнес З.Н., Романова В.С., Вольпина О.М. и др. Иммуностимулирующее действие водорастворимых производных фуллерена - перспектив-
ных адъювантов для вакцин нового поколения. Доклады РАН. 1999; 369(3): 411-3.
37. Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В., Камышников О.Ю. и др. Отсутствие острой токсичности у водного раствора фуллерена С60. Immunologiya. 2016; 37(6): 325-9. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-325-329
38. Funakoshi-Tago M., Miyagawa Y., Ueda F., Mashino T., Moriwaki Y., Tago K., et al. A bis-malonic acid fullerene derivative significantly suppressed IL-33-induced IL-6 expression by inhibiting NF-kappaB activation. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 254-64. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2016.08.031
39. Башкатова Е.Н., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Бабахин А.А., Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Изучение модулирующей активности производных фуллерена С60 на реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Физиология и патология иммунной системы. 2012; 16(2): 17-27.
40. Yamashita K., Sakai M., Takemoto N., Tsukimoto M., Uchida K., Yajima H., et al. Attenuation of delayed-type hypersensitivity by fullerene treatment. Toxicology. 2009; 261(1-2): 19-24. https://doi. org/10.1016/j.tox.2009.04.034
REFERENCES
1. Dustin L.B. Innate and adaptive immune responses in chronic HCV infection. Curr. Drug Targets. 2017; 18(7): 826-43. https://doi.org/ 10.2174/1389450116666150825110532.
2. Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: standard-of-care treatment. Adv. Pharmacol. 2013; 67: 169-215. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-405880-4.00005-6
3. Spearman C.W., Dusheiko G.M., Hellard M., Sonderup M. Hepatitis C. Lancet. 2019; 394(10207): 1451-66. https://doi. org/10.1016/S0140-6736(19)32320-7
4. Osuch S., Metzner K.J., Caraballo Cortes K. Reversal of T cell exhaustion in chronic HCV infection. Viruses. 2020; 12(8): 799. https://doi.org/10.3390/v12080799
5. Telatin V., Nicoli F., Frasson C., Menegotto N., Barbaro F., Castelli E., et al. In chronic hepatitis C infection, myeloid-derived suppressor cell accumulation and T cell dysfunctions revert partially and late after successful direct-acting antiviral treatment. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2019; 9: 190. https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00190
6. Elmasry S., Wadhwa S., Bang B.R., Cook L., Chopra S., Kanel G., et al. Detection of occult hepatitis C virus infection in patients who achieved a sustained virologic response to direct-acting antiviral agents for recurrent infection after liver transplantation. Gastroenterology. 2017; 152(3): 550-53.e8. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2016.11.002
7. Wang Y., Rao H., Chi X., Li B., Liu H., Wu L., et al. Detection of residual HCV-RNA in patients who have achieved sustained virological response is associated with persistent histological abnormality. EBioMedicine. 2019; 46: 227-35. https://doi. org/10.1016/j.ebiom.2019.07.043
8. Holmes J.A., Yu M.L., Chung R.T. Hepatitis B reactivation during or after direct acting antiviral therapy - implication for susceptible individuals. Expert Opin. Drug Saf. 2017; 16(6): 651-72. https:// doi.org/10.1080/14740338.2017.1325869
9. Ghweil A.A., Helal M.M. Reactivation of herpesvirus in patients with hepatitis C treated with direct-acting antiviral agents. Infect. Drug Resist. 2019; 12: 759-62. https://doi.org/10.2147/IDR.S184598
10. Verma R., Khanna P., Chawla S. Hepatitis C vaccine. Need of the hour. Hum. Vacc. Immunother. 2014; 10(7): 1927-9. https://doi. org/10.4161/hv.29033
11. Bailey J.R., Barnes E., Cox A.L. Approaches, progress, and challenges to hepatitis C vaccine development. Gastroenterology. 2019; 156(2): 418-30. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.08.060
12. Ploss A., Kapoor A. Animal models of hepatitis C virus infection. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2020; 10(5): a036970. https:// doi.org/10.1101/cshperspect.a036970
13. Ahlen G., Frelin L. Methods to evaluate novel hepatitis C virus vaccines. Methods Mol. Biol. 2016; 1403: 221-44. https://doi. org/10.1007/978-1-4939-3387-7_11
14. Andrianov A.K., Fuerst T.R. Immunopotentiating and delivery systems for HCV vaccines. Viruses. 2021; 13(6): 981. https://doi. org/10.3390/v13060981.
15. Sepulveda-Crespo D., Resino S., Martinez I. Innate immune response against hepatitis C virus: targets for vaccine adjuvants.
Vaccines (Basel). 2020; 8(2): 313. https://doi.org/10.3390/ vaccines8020313
16. Gaur M., Misra C., Yadav A.B., Swaroop S., Maolmhuaidh F.O., Bechelany M., et al. Biomedical applications of carbon nanomaterials: fullerenes, quantum dots, nanotubes, nanofibers, and graphene. Materials (Basel). 2021; 14(20): 5978. https://doi. org/10.3390/ma14205978
17. Barzegar A., Naghizadeh E., Zakariazadeh M., Azamat J. Molecular dynamics simulation study of the HIV-1 protease inhibit ion using fullerene and new fullerene derivatives of carbon nanostructures. Mini Rev. Med.. Chem. 2017; 17(7): 633-47. https://doi.org/10.2174 /1389557516666160609080157
18. Hurmach V., Platonov M., Prylutska S., Klestova Z., Cherepanov V., Prylutskyy Y., et al. Anticoronavirus activity of water-soluble pristine C60 fullerenes: in vitro and in silico screenings. Adv. Exp. Med. Biol. 2021; 1352: 159-72. https://doi.org/10.1007/978-3-030-85109-5_10.
19. Klimova R., Andreev S., Momotyuk E., Demidova N., Fedorova N., Chernoryzh Y., et al. Aqueous fullerene C60 solution suppresses herpes simplex virus and cytomegalovirus infections. Fuller. Nanotub. CarbonNanostructures. 2019; 28(6): 487-99. https://doi. org/10.1080/1536383x.2019.1706495
20. Reina G., Peng S., Jacquemin L., Andrade A.F., Bianco A. Hard nanomaterials in time of viral pandemics. ACS nano. 2020; 14(8): 9364-88. https://doi.org/10.1021/acsnano.0c04117
21. Shershakova N., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struchkova I., Kamyshnikov O., et al. Anti-inflammatory effect of fullerene C60 in a mice model of atopic dermatitis. J. Nanobiotechnology. 2016; 14: 8. https://doi.org/10.1186/s12951-016-0159-z
22. Kuznietsova H., Dziubenko N., Hurmach V., Chereschuk I., Motuziuk O., Ogloblya O., et al. Water-soluble pristine C60 fullerenes inhibit liver fibrotic alteration and prevent liver cirrhosis in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2020; 2020: 8061246. https://doi. org/10.1155/2020/8061246
23. Liu J., Feng X., Chen Z., Yang X., Shen Z., Guo M., et al. The adjuvant effect of C60(OH)22 nanoparticles promoting both humoral and cellular immune responses to HCV recombinant proteins. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 2019; 97: 753-9. https://doi.org/10.1016/j.msec.2018.12.088
24. Xu L., Liu Y., Chen Z., Li W., Liu Y., Wang L., et al. Morphologically virus-like fullerenol nanoparticles act as the dual-functional nanoadjuvant for HIV-1 vaccine. Adv. Mater. 2013; 25: 5928-36. https://doi.org/10.1002/adma.201300583
25. Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A., Andreev I., et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by novel dialysis method: simple way to fullerene aqueous solution. Fuller. Nanotub. Carbon Nanostructures. 2015; 23(9): 792-800. https://doi.org/10.1080/1536383x.2014.998758
26. Shershakova N.N., Andreev S.M., Tomchuk A.A., Makarova E.A., Nikonova A.A., Turetskiy E.A., et al. Wound healing activity of aqueous dispersion of fullerene C60 produced by "green technology". Nanomedicine. 2023; 47: 102619. https://doi. org/10.1016/j.nano.2022.102619
27. Ivanov A.V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky V.O., Kukhanova M.K., et al. Development of the system ensuring a high-level expression of hepatitis C virus nonstructural NS5B and NS5A proteins. Protein Expr. Purif. 2006; 48(1): 14-23. https://doi.org/10.1016/j.pep.2006.02.011
28. Himoudi N., Abraham J.D., Fournillier A., Lone Y.C., Joubert A., Op De Beeck A., et al. Comparative vaccine studies in HLA-A2.1-transgenic mice reveal a clustered organization of epitopes presented in hepatitis C virus natural infection. J. Virol. 2002; 76(24): 1273546. https://doi.org/10.1128/jvi.76.24.12735-12746.2002
29. Ikram A., Zaheer T., Awan F.M., Obaid A., Naz A., Hanif R., et al. Exploring NS3/4A, NS5A and NS5B proteins to design conserved subunit multi-epitope vaccine against HCV utilizing immunoinformatics approaches. Sci. Rep. 2018; 8(1): 16107. https://doi.org/10.1038/s41598-018-34254-5.
30. Nitschke K., Barriga A., Schmidt J., Timm J., Viazov S., Kuntzen T., et al. HLA-B*27 subtype specificity determines targeting and viral evolution of a hepatitis C virus-specific CD8+ T cell epitope. J. Hepatol. 2014; 60(1): 22-9. https://doi.org/10.1016/j. jhep.2013.08.009.
31. Tan A.C., Eriksson E.M., Kedzierska K., Deliyannis G., Valkenburg S.A., Zeng W., et al. Polyfunctional CD8(+) T
ORIGINAL RESEARCHES
cells are associated with the vaccination-induced control of a novel recombinant influenza virus expressing an HCV epitope. Antiviral Res. 2012; 94(2): 168-78. https://doi.Org/10.1016/j. antiviral.2012.03.009
32. Vertuani S., Bazzaro M., Gualandi G., Micheletti F., Marastoni M., Fortini C., et al. Effect of interferon-alpha therapy on epitope-specific cytotoxic T lymphocyte responses in hepatitis C virus-infected individuals. Eur. J. Immunol. 2002; 32(1): 144-54. https://doi.org/10.1002/1521-4141(200201)32:1<144::AID-IMMU144>3.0.C0;2-X.
33. Masalova O.V., Lesnova E.I., Ivanov A.V., Pichugin A.V., Permyakova K.Yu., Smirnova O.A., et al. Comparative analysis of the immune response to DNA constructions encoding hepatitis C virus nonstructural proteins. Voprosy virusologii. 2013; 58(2): 21-8. (in Russian)
34. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. Hepatitis C virus proteins activate NRF2/ARE pathway by distinct ROS-dependent and independent mechanisms in HUH7 cells. PLoS One. 2011; 6(9): e24957. https:// doi.org/10.1371/journal.pone.0024957
35. Rao X., Hoof I., van Baarle D., Kesmir C., Textor J. HLA preferences for conserved epitopes: a potential mechanism for hepatitis C clearance. Front. Immunol. 2015; 6: 552. https://doi. org/10.3389/fimmu.2015.00552
36. Masalova O.V., Shepelev A.V., Atanadze S.N., Parnes Z.N., Romanova V.S., Vol'pina O.M., et al. Immunostimulating effect of water-soluble fullerene derivatives—perspective adjuvants for a new generation of vaccine. Doklady RAN. 1999; 369(3): 411-3. (in Russian)
37. Shershakova N.N., Baraboshkina E.N., Andreev S.M., Shabanova D.D., Smirnov V.V., Kamyshnikov O.Yu., et al. Fullerene C60 aqueous solution does not show acute toxicity. Immunologiya. 2016; 37(6): 325-9. https://doi.org/10.18821/0206-4952-2016-37-6-325-329 (in Russian)
38. Funakoshi-Tago M., Miyagawa Y., Ueda F., Mashino T., Moriwaki Y., Tago K., et al. A bis-malonic acid fullerene derivative significantly suppressed IL-33-induced IL-6 expression by inhibiting NF-kappaB activation. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 254-64. https://doi.org/10.1016/j.intimp.2016.08.031
39. Bashkatova E.N., Andreev S.M., Shershakova N.N., Babakhin A.A., Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Study of modulating effects of fullerene [C60] adducts on the reaction of delayed-type hypersensitivity. Fiziologiya i patologiya immunnoy sistemy. 2012; 16(2): 17-27. (in Russian)
40. Yamashita K., Sakai M., Takemoto N., Tsukimoto M., Uchida K., Yajima H., et al. Attenuation of delayed-type hypersensitivity by fullerene treatment. Toxicology. 2009; 261(1-2): 19-24. https://doi. org/10.1016/j.tox.2009.04.034
