CC BY
84
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015 УДК 615.371:578.891].012.6
Масалова О.В.1, Лескова Е.И.1, Пермякова К.Ю.1, Иванов А.В.2, Туницкая В.Л.2, Кущ А.А.1
УСИЛЕНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ СОЧЕТАННОМ ВВЕДЕНИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ДНК И БЕЛКОВ РЕПЛИКАТИВНОГО КОМПЛЕКСА
ВИРУСА ГЕПАТИТА С
-'ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, 123098, Москва; 2ФГБУ «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН», 119991, Москва
Перспективным подходом к созданию вакцин против гепатита С является разработка конструкций на базе нуклеотидных последовательностей вируса гепатита С (ВГС), однако оптимальный состав вакцинной композиции не определен. Цель работы состояла в оценке эффективности иммунного ответа при сочетанном введении мышам ДНК-конструкции pcNS3-NS5B, кодирующей белки репликативного комплекса, и рекомбинантных неструктурных белков NS3 и NS5B ВГС с использованием различных адъювантов. Мышей DBA иммунизировали ДНК-конструкцией и/или реком-бинантными белками троекратно. Гуморальный иммунный ответ оценивали в ИФА, клеточный - по анализу уровня пролиферации лимфоцитов в реакции бласттрансформации in vitro, по синтезу и секреции цитокинов IFN-y и IL-2 методами ELISpot и ИФА. Показано, что плазмида pcNS3-NS5B вызывает преимущественно Т-клеточный ответ, тогда как NS3 и NS5B стимулируют сильный гуморальный иммунный ответ. Впервые установлено принципиальное преимущество комбинированной вакцинации животных ДНК-конструкцией pcNS3-NS5B в сочетании с белками NS3 и NS5B ВГС: статистически значимо усиливается как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ. При этом стимулируется иммунный ответ не только к введенным белкам NS3 и NS5B, но также и к другим антигенам, кодируемым плазмидой pcNS3-NS5B (NS4, NS5A). Наиболее интенсивный иммунный ответ получен при троекратном совместном введении ДНК-конструкции pcNS3-NS5B с генным адъювантом pcGM-CSF в сочетании с рекомбинантными белками NS3 и NS5B ВГС, введенными с IFN-a. Адъювантная активность рекомбинантного белка IFN-alpha, впервые показанная на модели генов и белков ВГС, может служить предпосылкой для включения его в кандидатный вакцинный препарат.
Ключевые слова: вирус гепатита С; неструктурные белки; ДНК-иммунизация; рекомбинантные белки; иммунный ответ; адъюванты, IFN-a; вакцина.
Гепатит С признан одной из главных причин хронических заболеваний печени, включая терминальные стадии - цирроз и гепатокарциному. До 80% случаев острого гепатита С переходят в хроническую форму, что объясняется повышенной частотой мутаций вируса гепатита С (ВГС), интерференцией вирусных белков с факторами врожденного и адаптивного иммунитета хозяина, образованием «эскейп»-вариантов ВГС, ускользающих от иммунного ответа [1, 2]. Исследование больных с разрешившимся гепатитом С и с хронизацией инфекции показало, что основным благоприятным фактором является ранний, сильный и муль-тиспецифичный клеточный ответ к белкам ВГС [1]. Стандартная терапия гепатита С в настоящее время основана на сочетании пегилированного рекомбинантного IFN-a и рибавирина; при этом устойчивое исчезновение вируса наблюдается не более чем у 50% пациентов [3]. Терапия с применением новых препаратов прямого противовирусного действия на основе ингибиторов ферментов ВГС - NS3 и NS5B, а также блокаторов белка NS5A позволяет излечивать большинство пациентов, но ее крайне высокая стоимость делает лечение недоступным большинству больных [4]. Большие надежды возлагают на создание вакцинного препарата, способного оказывать как профилактическое действие (предотвращение заражения и/или облегчение течения заболевания), так и терапевтический эффект (усиление иммунного ответа и элиминация вируса у пациентов с хроническим гепатитом С). Основой для разработки вакцин служат генно-инженерные продукты, имитирующие последовательности ВГС: рекомбинантные белки, пептиды, представляющие В- и Т-клеточные эпитопы, ДНК в составе
Для корреспонденции: Масалова Ольга Владимировна, ol.mas@ mail.ru
плазмид и вирусных векторов [5]. Кандидатные вакцины против гепатита С находятся в стадии разработки, некоторые из них проходят клинические испытания, однако значительных успехов пока добиться не удалось [5, 6].
Ранее было установлено, что созданная нами ДНК-конструкция pcNS3-NS5B, кодирующая неструктурные белки репликативного комплекса - NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B в одной открытой рамке считывания, превосходит по иммуногенности плазмиды, несущие гены отдельных неструктурных белков [7]. В то же время значительное усиление Т-клеточного ответа на ДНК-вакцину, содержащую гены репликативного комплекса ВГС, не сопровождалось столь же значительным повышением уровня антител. В последнее время показан вклад нейтрализующих антител, индуцируемых поверхностными белками ВГС, в защите от заражения вирусом [1, 5]. Однако роль антител к неструктурным белкам ВГС недостаточно изучена. Известно, что индукция гуморального иммунного ответа достигается введением в организм чужеродных (в том числе вирусных) белков. Рекомбинантные белки, экспрессированные в бактериальных клетках и несущие аминокислотные последовательности ВГС, выполняют роль суррогатных антигенов, однако их иммуностимулирующая активность, как правило, ниже, чем натуральных вирусных белков. В связи с этим представляло интерес выяснить, приведет ли введение рекомбинантных белков ВГС наряду с ДНК-вакциной к гармонизации иммунного ответа, т.е. к установлению баланса между гуморальным (1Ъ2-зависимым) и клеточным (Th1-зависимым) звеньями иммунитета. Одной из задач работы было выяснить, удастся ли достигнуть дополнительного усиления ответа на ДНК-белковую вакцину с помощью иммуномодуляторов. В качестве рекомбинантных белков выбраны последовательности хеликазы NS3 ВГС и РНК-зависимой РНК полимеразы NS5B, которые участвуют в репликации ВГС и проявляют иммуногенную активность in vivo [8].
Цель работы состояла в экспериментальной оценке эффективности иммунного ответа при сочетанном введении мышам ДНК-конструкции pcNS3-NS5B и рекомбинантных белков NS3 и NS5B ВГС и в изучении иммуностимулирующей активности различных адъювантов.
Материалы и методы
ДНК-конструкции, рекомбинантные белки и пептиды.
Плазмида, кодирующая фрагмент полипротеина NS3-NS5B ВГС (pcNS3-NS5B, генотип 1b), получена на основе вектора pcD-NA3.1(+) («Invitrogen», США) и описана ранее [7]. Плазмида, кодирующая гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулиру-ющий фактор мышей (pcGM-CSF), любезно предоставлена Л.Н. Шингаровой и использована как эффективный генный адъювант [9] во всех группах подопытных животных. Очищенные рекомбинантные белки ВГС, полученные ранее [10-13], содержат последовательности белков: core (1-90 а.о.); NS3 (протеазный домен 1027-1229 а.о.; хеликазный домен 1230-1658 а.о., генотип 1b, иммунодоминантный регион 1192-1459 а.о., генотип 1а); NS4 (1677-1754 а.о., генотип 1b); NS5A (2212-2313 а.о., генотип 2a); NS5B (2420-3011 а.о., генотип 1b). Пептиды из состава ВГС (ООО «Алмабион», Россия) содержат последовательности белка NS4 (1693-1707 а.о.) и белка NS5A (2163-2171 а.о.).
Иммунизация мышей. Иммунизировали 10 групп мышей по 8 животных - самок линии DBA/2J (H-2d), 6-8 нед, полученных из Центрального питомника лабораторных животных «Андреевка» РАН. В качестве иммуногенов, которые вводили отдельно или совместно, использовали: плазмиду pcNS3-NS5B ВГС; вектор pcDNA 3.1 без вставки (как контроль); рекомби-
Таблица 1
Антигены и адъюванты, использованные при иммунизации мышей
Группа мышей Плазмиды Рекомбинантные белки ВГС Адъюванты
1-я pcNS3-NS5B - pcGM-CSF
2-я pcNS3-NS5B - pcGM-CSF + ГМДП
3-я pcNS3-NS5B - pcGM-CSF + IFN-a
4-я pcNS3-NS5B + pcGM-CSF
5-я pcNS3-NS5B + pcGM-CSF + ГМДП
6-я pcNS3-NS5B + pcGM-CSF + IFN-a
7-я pcDNA 3.1 (+) + pcGM-CSF
8-я pcDNA 3.1 (+) + pcGM-CSF + ГМДП
9-я pcDNA 3.1 (+) + pcGM-CSF + IFN-a
10-я Физиологический раствор - -
нантные белки ВГС - хеликазный домен №3 и полноразмерный белок Ш5В (табл. 1).
Плазмиды вводили внутримышечно в дозе 100 мкг/мышь в смеси с генным адъювантом pcGM-CSF (100 мкг/мышь). Реком-бинантные белки вводили подкожно в холку в дозе 2 мкг/мышь каждого белка (в сумме 4 мкг/мышь). Другие группы мышей иммунизировали теми же конструкциями с добавлением соединений, которые испытаны как дополнительные адъюванты: 1) глюкозаминил-мурамилдипептид (ГМДП) - синтетический аналог участка клеточной стенки бактерий, любезно предоставлен Т.М. Андроновой; 2) рекомбинантный Ш^а (Ш^ойЬ, любезно предоставлен В.В. Малиновской). Доза ГМДП составляла 200 нм/мышь (0,33 мг), доза Ш^а - 105 МЕ/мышь, причем цитокин вводили последовательно в одно и то же место 2 раза - в день основной иммунизации и через 24 ч. Мышей иммунизировали троекратно с интервалом 2 нед, иммунный ответ анализировали через 9 дней после 2-й и 3-й иммунизаций.
Оценка иммунного ответа. Гуморальный ответ. Активность взаимодействия антител к белкам ВГС в сыворотках крови
мышей с антигенами ВГС определяли методом непрямого им-муноферментного анализа (ИФА) по стандартной методике как описано ранее [9]. В качестве вторичных антител использовали антитела к иммуноглобулинам мыши изотипов IgG1 и IgG2a, конъюгированные с пероксидазой хрена («Jackson Immunore-search Laboratories», США), в качестве субстрата пероксидазы - тетраметилбензидин («Sigma», США); оптическую плотность измеряли при 450 нм. За титр сывороток в ИФА принимали предельное разведение, при котором значение оптической плотности при А450 в 2 раза превышало значение для сыворотки крови неиммунизированных мышей.
Т-клеточный ответ in vitro оценивали: 1) в реакции бласт-трансформации лимфоцитов (РБТЛ); 2) по секреции цитокинов IFN-y и IL-2; 3) методом ELISpot. Клетки селезенки от мышей каждой экспериментальной группы объединяли и выделяли фракцию мононуклеарных клеток, как описано ранее [14]. Для стимуляции спленоцитов in vitro использовали рекомбинантные белки и пептиды в конечной концентрации 1 и 10 мкг/мл соответственно.
РБТЛ выполняли, как описано ранее [14]. Индекс стимуляции пролиферации (ИСП) рассчитывали как отношение среднего количества лимфобластов через 5 дней после внесения специфических антигенов к среднему количеству лимфобластов в контрольных лунках - с культуральной средой и неспецифическим антигеном.
Цитокины IFN-y и IL-2 в культуральных жидкостях, полученных через 2,5 сут после стимуляции лимфоцитов, выявляли методом ИФА с помощью наборов («Mabtech», Швеция). Концентрацию цитокинов определяли по калибровочным кривым стандартных образцов. Предел чувствительности для IFN-y составлял 7 пг/мл, для IL-2 - 6 пг/мл.
Количество клеток, секретирующих IFN-y- и IL-2, определяли методом ELISpot c помощью тест-систем «BD Biosciences ELISpot Kit» (США) как описано ранее [9]. Результаты выражали в количестве пятен («spots») на 106 клеток.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 6. Данные представляли как среднее арифметическое или среднее геометрическое (титры антител) из 3-4 повторов и стандартное отклонение. Статистическую значимость различий оценивали по t-критерию Стьюдента и считали значимыми прир < 0,05.
Таблица 2
Стимуляция пролиферации лимфоцитов мышей, иммунизированных ДНК-конструкциями и/или рекомбинантными белками NS3
и NS5B, индуцированная антигенами ВГС in vitro
Коли- Антигены, использованные для активации Т-клеток in vitro
Группа чество NS3 NS4 NS5
мышей имму-низаций NS3_1192-1459 NS3_1027-1229 NS3 1230-1658 NS4 1677-1754 NS4 16931707 NS5A 22122313 NS5A 21632171 NS5B2420-3011
1-я 2 2,0 12,2 3,1 5,3 0,9 1,7 1,0 0,9
3 2,4 166,0 7,7 9,6 5,1 6,1 3,4 8,8
2-я 2 2,9 13,9 5,0 20,2 1,2 2,4 1,4 1,4
3 7,9 181,8 7,0 39,6 4,5 5,0 4,2 6,7
3-я 2 2,0 24,5 6,9 22,6 1,1 2,1 1,1 2,1
3 3,3 150,0 6,5 41,5 5,8 3,8 3,7 5,8
4-я 2 2,0 9,5 3,3 37,8 1,3 3,6 1,5 1,8
3 16,1 140,1 19,7 177,3 7,0 5,2 3,0 7,8
5-я 2 6,9 9,9 4,8 20,6 1,1 1,8 1,5 1,4
3 2,8 174,7 5,5 48,6 3,7 8,0 6,2 11,6
6-я 2 6,5 16,3 6,9 43,5 2,1 2,3 1,8 1,7
3 16,2 214,2 16,6 161,7 15,1 11,3 18,1 15,2
7-я 2 0,8 0,9 1,2 0,8 0,9 0,8 0,9 0,8
3 1,0 1,9 1,6 0,9 0,8 1,6 1,0 0,9
8-я 2 1,5 1,0 0,6 1,3 0,5 0,8 0,8 0,8
3 2,8 1,2 10,9 0,8 1,3 1,1 1,5 11,5
9-я 2 1,4 0,9 1,1 0,8 1,5 1,5 0,8 1,2
3 7,7 1,2 9,4 0,8 1,1 1,3 0,9 6,3
Примечание. Представлены средние значения ИСП; ИСП в контрольной группе приняты за единицу; выделены значения ИСП, статистически значимо (р < 0,05) отличающиеся от контрольной группы.
Результаты и обсуждение
Гуморальный иммунный ответ. В сыворотках мышей после 2-й иммунизации антитела к белкам ВГС не обнаружены (титр < 1:10). Титры антител к различным антигенам ВГС после 3-й иммунизации представлены на рис.1. Установлено, что ДНК-вакцина pcNS3-NS5B с pcGM-CSF (1-я группа) индуцировала антитела преимущественно изотипа IgG2a, титры антител были невысокими (< 1:300), но выше, чем в контроле (p<0,05). Добавление других адъювантов (2-я и 3-я группы) увеличивало активность антител изотипа IgG1 к хеликазному домену NS3 в 5-6 раз (p < 0,05), тогда как на активность антител изотипа IgG2a не влияло. Введение мышам рекомбинантных белков (7-я группа) приводило к значительной индукции антител обоих изотипов к белку NS3 (титры 1:5000-1:8000) и в меньшей степени - к NS5B (1:1401:450). При введении белков с адъювантом ГМДП (8-я группа) статистически значимо повысились титры антител к NS3 и NS5B изотипа IgG1 (p < 0,05). Титры антител к белкам NS4 и NS5A в 7-9-й группах достоверно не отличались от контроля. Сочетанная иммунизация мышей плазмидой pcNS3-NS5B и рекомбинантны-ми белками (4-6-я группа) приводила к возрастанию активности антител к NS3 и NS5B обоих изотипов: титры анти-^3 антител достигали 1:130000, анти-^5В - 1:28000. Титры антител в этих группах были статистически значимо выше по сравнению с таковыми в группах мышей, иммунизированных отдельно плазмидой (1-3-я группа) и рекомбинантными белками (7-9-я группа) с соответствующими адъювантами.
Клеточный иммунный ответ. Результаты РБТЛ показали, что после двух иммунизаций мышей плазмидой pcNS3-NS5B без адъювантов только 3 из 8 испытанных антигенов ВГС стимулировали образование лимфобластов in vitro (табл. 2). В 2-й и 3-й группах (плазмида с адъювантами) ИСП>2 получены в ответ на 5 антигенов. Иммунизация рекомбинантными белками (7-9-я группа) не вызывала пролиферацию лимфоцитов. Сочетанная иммунизация мышей плазмидой и белками ВГС (4-6-я группа) приводила к образованию лимфобластов в ответ на 4-6 антигенов.
После 3-й иммунизации активность пролиферации повысилась во всех группах, статистически значимо - в 1, 4 и 6-й группах (см. табл. 2). Введение плазмиды pcNS3-NS5B стимулировало образование лимфобластов, отвечающих пролиферацией
на все исследованные антигены ВГС вне зависимости от присутствия адъювантов, за исключением антигена №4_1677-1754, в ответ на который ИСП были статистически значимо больше во 2-й и 3-й группах, причем уже после второй иммунизации. Иммунизация рекомбинантными белками приводила к пролифе-ративному ответу на введенные белки №3 и №5В только при добавлении адъювантов (8-9-я группа). Сочетанная иммунизация мышей плазмидой и белками статистически значимо по сравнению с введением отдельных конструкций увеличивала пролиферацию лимфоцитов в ответ на большинство антигенов ВГС в 4-й и 6-й группах, но не в 5-й группе (адъювант ГМДП). Увеличение пролиферативного ответа в 6-й группе получено не только к рекомбинантным белкам - хеликазному домену №3 и ^5В, использованным для иммунизации, но и к другим участкам ВГС (№4, №5А), кодируемым плазмидой.
Изучение уровня цитокинов, вырабатываемых спленоци-тами дважды иммунизированных мышей в ответ на стимуляцию антигенами ВГС, показало, что лишь 2 рекомбинантных белка - протеазный домен Ш3_1027-1229 и участок Ш4_1677-1754, вызывали секрецию ГГЫ-у и ГЬ-2 в 1-6-й группах, но не в 7-9-й группах (результаты не показаны).
После третьей иммунизации мышей плазмидой рсШ3-Ш5В без адъювантов и с ГМДП (1-я и 2-я группы) секреция ГГЫ-у отмечена в ответ на 3 антигена из состава белков №3 и №4, тогда как при добавлении адъюванта 1ГЫ-а (3-я группа) - только на 1 из них (табл. 3). ^-2 во 2-й и 3-й группах секретировался исключительно в ответ на протеазный домен №3, в 1-й группе -дополнительно на последовательности №5А и №5В. Иммунизация рекомбинантными белками (7-9-я группа) практически не индуцировала секрецию цитокинов, за исключением небольших количеств ГГЫ-у в 9-й группе в ответ на хеликазный домен №3. Совместная иммунизация мышей плазмидой и белками, введенными с (6-я группа), статистически значимо повышала как количество антигенов, вызвавших секрецию цитокинов, так и их концентрацию. Так, секреция ГГЫ-у выявлена при стимуляции спленоцитов 5 антигенами (9-185 пг/мл), ^-2 - всеми 8 использованными антигенами (6-31 пг/мл).
При анализе результатов ELiSpot установлено (табл. 4), что плазмида рсШ3-Ш5В без адъювантов (1-я группа) индуцировала накопление ^^у-секретирующих лимфоцитов в ответ
Таблица 3
Секреция цитокинов и И-2 спленоцитами мышей, троекратно иммунизированных ДНК-конструкциями
и/или рекомбинантными белками ВГС
Группа
Секрети-
Антигены, использованные для активации Т-клеток in vitro
мышей руемый NS3 NS4 NS5
цитокин NS3_ 1192-1459 NS3_ 1027-1229 NS3_ 1230-1658 NS4_ 1677-1754 NS4 16931707 NS5A 2212-2313 NS5A 2163-2171 NS5B 2420-3011
1-я IFN-y 0 24 9 9 0 0 0 0
IL-2 6 20 0 0 0 7 0 6
2-я IFN-y 0 115 11 19 0 0 0 0
IL-2 0 25 0 0 0 0 0 0
3-я IFN-Y 0 15 0 0 0 0 0 0
IL-2 0 18 0 0 0 0 0 0
4-я IFN-Y 0 191 9 11 0 0 9 0
IL-2 6 42 0 6 0 0 0 0
5-я IFN-Y 0 124 0 0 0 0 0 0
IL-2 0 17 0 0 0 0 0 9
6-я IFN-Y 0 185 9 29 0 0 11 12
IL-2 9 31 10 22 6 22 15 20
7-я IFN-Y 0 0 0 0 0 0 0 0
IL-2 0 0 0 0 0 0 0 0
8-я IFN-Y 0 0 0 0 0 0 0 0
IL-2 0 0 0 0 0 0 0 0
9-я IFN-Y 0 0 7 0 0 0 0 0
IL-2 0 0 0 0 0 0 0 0
10-я IFN-Y 0 0 0 0 0 0 0 0
IL-2 0 0 0 0 0 0 0 0
П р и м е ч а ванных мышей пг/мл IL-2.
н и е. Представлены концентрации цитокинов (в пг/мл), секретируемых в культуральную среду лимфоцитами иммунизиро-при стимуляции их антигенами ВГС in vitro (средние значения); выделены положительные значения; 0 - < 7 пг/мл IFN-y, < 6
1000 OOO-i
100 000-
10 000-
1000-
100-
10
NS3 1230-1658 NS4 1677-1754 NS4A 2212-2313 NS5B 2420-3011
1000 OOO-i
100 000-
10 000-
1000-
100-
МвЗ_1230-1658 N84 1677-1754 М34А_2212-2313 МЭ5В_2420-3011 ■ 1-я И 2-я Ц 3-я ¡3 4-я 0 5-я Щб-я Щ7-я Д8-я Щ 9-я □ 10-я
Рис. 1. Индукция антител изотипов IgG1 (а) и IgG2a (б) к белкам ВГС у мышей, иммунизированных ДНК-конструкциями и/или рекомбинантными белками ВГС. По горизонтали - рекомбинантные белки ВГС, использованные для сорбции в ИФА; По вертикали - титр антител (среднегеометрическое значение ± стандартное отклонение). Цифрами обозначены группы мышей в соответствии с табл. 1.
на антигены из состава всех неструктурных белков, тогда как плазмида с добавлением ГМДП (2-я группа) - на антигены №3 и №4, плазмида с добавлением ГГЫ-а (3-я группа) - только на антигены №3. ГЬ-2-секретирующие клетки обнаружены в 1-3-й группе в сходных количествах при стимуляции антигенами №3 и Ш4. Иммунизация мышей рекомбинантными белками не приводила к формированию цитокинсекретирующих клеток, достоверно превышающих пороговый уровень контрольной группы. Сочетанная иммунизация мышей плазмидой и рекомбинантны-ми белками (4-я группа) индуцировала статистически значимо большее по сравнению с 1-й и 7-й группами количество «спо-тов» в ответ на протеазный и хеликазный домены №3, рекомбинантные белки №4 и №5А. При использовании ГМДП (5-я группа) добавление белков к плазмиде приводило к снижению способности образовывать «споты» по сравнению с 2-й группой. Напротив, применение адъюванта 1ЕЫ-а совместно с плаз-мидой и рекомбинантными белками (6-я группа) стимулировало у иммунизированных мышей образование цитокинсекретирую-щих клеток в ответ на большинство антигенов ВГС ^<0,05 по сравнению с 3-й и 9-й группами).
Проведенное ранее исследование иммуногенных свойств плаз-миды pcNS3-NS5B, введенной в смеси с генным адъювантом pcGM-CSF, показало, что эти конструкции индуцируют функционально активный Т-клеточный ответ одновременно на антигены, представляющие эпитопы белков Ж3, N84, Ж5А и №5В ВГС; показан высокий уровень пролиферации CD4+ Т-клеток, секреция Л-2 и 1ЕЫ-у, индукция антител изотипа IgG2a к белкам №3 и NS5B [7]. Вероятно, это обусловлено тем, что синтезируемые в составе репликативного комплекса белки имеют адекватный фолдинг, способствующий экспрессии иммуногенных детерминант, в том числе и конформационно-зависимых. В настоящей работе одна из групп
мышей - 1-я, иммунизирована идентичными конструкциями, однако с более коротким интервалом между иммунизациями - 2 нед вместо 3 нед. Результаты сравнительного анализа иммунного ответа показали, что это не привело к значительным различиям как в эпитопной направленности, так и в интенсивности клеточного ответа. Две группы мышей были иммунизированы плазмидами pcNS3-NS5B с pcGM-CSF и дополнительно ГМДП или IFN-a, иммуностимулирующую активность которых мы изучали в ходе выполнения настоящей работы. ГМДП был использован как адъювант, показавший эффективную стимуляцию гуморального ответа на белок NS4 ВГС [15]. Рекомбинантный белок IFN-a ранее не изучен как адъювант для стимуляции иммунного ответа при ДНК-иммунизации, но используется для терапии гепатита С. Оказалось, что ГМДП и IFN-a при иммунизации плазмидой с pcGM-CSF не повышали титр антител и значение ИСП, в то же время уровни синтеза и секреции цитокинов снижались, особенно в 3-й группе (добавление IFN-a).
Три группы мышей иммунизировали рекомбинантными белками NS3 и NS5B, которые были выбраны, так как они являются важными вирусными ферментами, необходимыми для репликации ВГС - хеликазой и РНК-зависимой РНК-полимеразой соответственно; NS5B рассматривается как перспективная мишень для действия терапевтических препаратов [4]; в составе этих белков картировано множество иммунодоминант-ных Т-клеточных эпитопов для CD4+- и CD8+-лимфоцитов [16]; иммунный ответ на эти белки исследован в меньшей степени, чем на другие белки ВГС. Для адекватного сравнения результатов мышам этих групп вводили также вектор без вставки генов ВГС - плазмиду pcDNA 3.1 (+) с pcGM-CSF.
Плазмиду использовали в качестве генного адъюванта, так как ранее нами установлено, что низкий титр антител (<1:50) при иммунизации мышей рекомбинантным белком NS3 без адъюванта увеличивался в 10-20 раз при введении с pcGM-CSF [9]. В настоящей работе установлено, что титры антител изотипов IgG1 и IgG2a в 7-й группе на белок NS3 достигали 1:5000-1:8000. Статистически значимо увеличивал титр антител к белкам NS3 и Ж5В только ГМДП. Анализ клеточного ответа показал, что иммунизация белками ВГС вызывала пролиферацию лимфоцитов в ответ на стимуляторы при использовании адъювантов (8-я и 9-я группы), однако клетки не были способны синтезировать цитокины или синтезировали их на уровне ниже чувствительности тест-систем. Таким образом, результаты проведенных экспериментов подтвердили данные, полученные на разных моделях, что при ДНК-иммунизации стимулируется преимущественно клеточное звено иммунитета (Th1), а при белковой - гуморальное (Th2) [5, 9, 17].
Комбинированная иммунизация животных плазмидой и ре-комбинантными белками приводила к статистически значимому усилению как гуморального, так и клеточного иммунного ответа Th1- и Нь2-типов. При этом стимулировался функционально активный иммунный ответ не только к введенным белкам, но также и к другим антигенам, кодируемым плазмидой pcNS3-NS5B, - протеазному домену NS3, NS4, NS5A. Этот факт указывает на принципиальное преимущество комбинированной вакцинации. В нескольких исследованиях на модели структурных белков ВГС - core, Е1 и E2 [18, 19], а также неструктурных белков NS3 и NS5A [9, 17] показано, что использование комбинации имму-ногенов нуклеотидной и белковой природы более эффективно по сравнению с применением индивидуальных компонентов ВГС. Сочетанное применение ДНК-вакцин и белков заявлено только в одной разработке, находящейся в стадии клинических испытаний, в которой рекомбинантный белок core вводится с
Таблица 4
Сравнительное количество и 1Ь-2-секретирующих клеток, индуцированных в культуре спленоцитов мышей, иммунизиро-
ванных ДНК-конструкциями и/или рекомбинантными белками ВГС
Группа Синтези- Антигены, использованные для активации Т-клеток in vitro
мышей руемыи NS3 NS4 NS5
цитокин NS3 1192- NS3 NS3_ 1230-1658 NS4 1677- NS4 1693- NS5A 2212- NS5A 2163- NS5B 2420-
1459 1027-1229 1754 1707 2313 2171 3011
1-я IFN-Y 17 238 25 32 28 17 32 26
IL-2 17 110 37 27 22 22 19 13
2-я IFN-Y 14 251 29 55 16 19 14 7
IL-2 15 69 37 34 16 16 26 13
3-я IFN-Y 18 246 51 15 7 15 11 18
IL-2 25 80 22 27 5 22 9 17
4-я IFN-Y 17 1391 119 253 34 31 28 25
IL-2 19 389 108 124 15 30 23 24
5-я IFN-Y 13 191 8 18 24 17 7 3
IL-2 11 293 20 18 25 17 21 23
6-я IFN-Y 24 921 135 106 48 28 33 35
IL-2 29 340 58 84 23 30 15 30
7-я IFN-Y 16 21 15 21 10 18 19 12
IL-2 13 20 25 24 14 23 13 12
8-я IFN-Y 16 15 5 21 3 5 14 16
IL-2 19 25 14 22 19 19 22 23
9-я IFN-Y 7 18 8 22 18 18 12 2
IL-2 18 16 24 24 24 23 14 21
10-я IFN-Y 10 20 15 16 11 15 11 10
IL-2 10 19 18 19 9 10 14 10
Примечание. Представлено среднее количество «спотов» на 106 клеток. Фоновый уровень реакции ELISpot для №N-7 > 24, для ^-2 > 27. Выделены положительные значения, статистически значимо отличающиеся от контрольной группы.
ДНК-конструкцией, кодирующей структурные белки соге/Е1/Е2 ВГС [18]. Для конструкций на основе комплекса неструктурных белков такие данные получены впервые. Наиболее интенсивный иммунный ответ по сумме параметров получен при трехкратном совместном введении ДНК-конструкции рсШ3-Ш5В с генным адъювантом pcGM-CSF в сочетании с рекомбинантными белками N83 и КБ5В ВГС, введенными с ГГЫ-а. В высоких дозах 1ГЫ-а много лет использовали при лечении гепатита С. Установлено, что он обладает широким спектром иммунологической активности: стимулирует фагоцитоз, активность !ЫК-клеток, выработку цитокинов, эффекторных клеток иммунной системы, усиливает экспрессию продуктов генов МНС I класса [3]. В низких дозах 1ГЫ-а может способствовать дифференцировке и активации дендритных клеток - основных антигенпрезентирующих клеток [20], чем, вероятно, обусловлен его адъювантный эффект при со-четанной иммунизации.
Таким образом, установлена высокая эффективность вакцинной композиции, включающей ДНК-конструкции рсШЗ-Ш5В и pcGM-CSF и рекомбинантные белки N83 и Ш5В ВГС. Иммунизация данной вакцинной композицией в сочетании с 1ГЫ-а стимулирует как гуморальное, так и клеточное звенья иммунитета. Это указывает на возможность использования разработанной композиции для профилактики острого гепатита С, предотвращения хронизации и терапии хронического гепатита С совместно с противовирусными препаратами. Адъювантная активность рекомбинантного белка 1Ё№а, впервые показанная на модели генов и белков ВГС, может служить основанием для включения его в кандидатный вакцинный препарат.
Благодарности
Авторы выражают благодарность Л.Н. Шингаровой (ФГБУН «Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН» - ИБХ РАН) за предоставление плазмиды pcGM-CSF, В.В. Малиновской (ООО «Фе-рон») - рекомбинантного человеческого интерферона Ш№а (^-а2Ь), Т.М. Андроновой (ИБХ РАН) - ГМДП, А.Н. Буркову и Т.И. Улановой (НПО «Диагностические системы», Нижний Новгород) - трех рекомбинантных белков ВГС. Работа полу-
чила частичную финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (проекты №№ 13-04-40307-Н и 13-04-40308-Н).
Сведения об авторах:
Масалова Ольга Владимировна (Masalova O.V.) - д-р биол.наук, вед.научн. сотр. ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, лаб. клеточной инженерии. 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, e-mail: [email protected]
Леснова Екатерина Ивановна (Lesnova E.I.) - научн. сотр. ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, лаб. клеточной инженерии. 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, e-mail: [email protected]
Пермякова Кристина Юрьевна (Permyakova K.Yu.) -мл. научн. сотр. лаб. клеточной инженерии. ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России,. 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, e-mail: [email protected]
Иванов Александр Владимирович (Ivanov A.V.) - канд. хим. наук, ст. научн. сотр. ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, лаб. молекулярных основ действия биологически активных соединений. 119991 Москва, ул. Вавилова, 32, e-mail: [email protected]
Туницкая Вера Леонидовна (Tunitskaya V.L.) - д-р хим. наук, вед.научн. сотр. ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, лаб. молекулярных основ действия биологически активных соединений. 119991 Москва, ул. Вавилова, 32, e-mail: [email protected]
Кущ Алла Александровна (Kushch А.А) - д-р биол.наук, проф., рук. лаб. клеточной инженерии. ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16, e-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА
7. Масалова О.В., Леснова Е.И., Иванов А.В., Пичугин А.В., Пермякова К.Ю., Смирнова О.А. и др. Сравнительный анализ иммунного ответа на ДНК-конструкции, кодирующие неструктурные белки вируса гепатита С. Вопросы вирусологии. 2013; 58 (2): 21-8.
9. Масалова О.В., Леснова Е.И., Шингарова Л.Н., Туницкая В.Л., Уланова Т.И., Бурков А.Н. и др. Комбинированное применение нуклео-тидных и аминокислотных последовательностей белка NS3 вируса гепатита С, гена гранулоцитарно-макрофагального колониестиму-лирующего фактора и блокатора регуляторных Т-клеток индуцирует эффективный иммунный ответ против вируса гепатита С. Молекулярная биология. 2012; 46 (3): 525-34.
10. Масалова О.В., Абдулмеджидова А.Г., Атанадзе С.Н., Лакина Е.И., Семилетов Ю.А., Бурков А.Н. и др. Характеристика панели моно-клональных антител и эпитопное картирование белков вируса гепатита С. Доклады РАН. 2002; 383 (4): 545-50.
11. Муковня А.В., Туницкая В.Л., Хандажинская А.Л., Голубева Н.А., Закирова Н.Ф., Иванов А.В. и др. Хеликаза/ЫТРаза вируса гепатита С. Эффективная система экспрессии и новые ингибиторы. Биохимия. 2008; 73: 822-832.
12. Уланова Т.И., Пузырев В.Ф., Бурков А.Н., Обрядина А.П. Влияние гетерогенности аминокислотной последовательности на иммуно-реактивность комплекса антигенных эпитопов, локализованного в пределах 1192-1456 аминокислот белка NS3 вируса гепатита С. Вопросы вирусологии. 2006; 51 (1): 28-30.
14. Масалова О.В., Леснова Е.И., Грабовецкий В.В., Смирнова О.А., Уланова Т.И., Бурков А.Н. и др. ДНК-иммунизация плазмидой, содержащей ген белка NS5A вируса гепатита C, индуцирует эффективный клеточный иммунный ответ. Молекулярная биология. 2010; 44 (2): 275-83.
15. Масалова О.В., Кущ А.А. Моноклональные антитела к белкам вируса гепатита С - инструмент для картирования антигенных детерминант, диагностики гепатита С и изучения вирусного патогенеза. Российский биотерапевтический журнал. 2003; 2 (3): 7-24.
Поступила 15.05.14
REFERENCES
1. Horner S.M. Activation and evasion of antiviral innate immunity by hepatitis C virus. J. Mol. Biol. 2014; 426 (6): 1198-209.
2. Irshad M., Mankotia D.S., Irshad K. An insight into the diagnosis and pathogenesis of hepatitis C virus infection. World J. Gastroenterol. 2013; 19 (44): 7896-909.
3. Pawlotsky J.M. Hepatitis C virus: standard-of-care treatment. Adv. Pharmacol. 2013; 67: 69-215.
4. Rupp D., Bartenschlager R. Targets for antiviral therapy of hepatitis C. Semin. Liver Dis. 2014; 34 (1): 9-21.
5. Halliday J., Klenerman P., Barnes E. Vaccination for hepatitis C virus: closing in on an evasive target. Expert Rev. Vaccines. 2011; 10 (5): 659-72.
6. Honegger J.R., Zhou Y., Walker C.M. Will there be a vaccine to prevent HCV infection? Semin. Liver Dis. 2014; 34 (1): 79-88.
7. Masalova O.V., Lesnova E.I., Ivanov A.V., Pichugin A.V., Permyakova K.Yu., Smirnova O.A. et al. Comparative analysis of the immune response to DNA constructions encoding hepatitis C virus nonstructural proteins. Voprosy virusologii. 2013; 58 (2): 21-8. (in Russian)
8. Moradpour D., Penin F., Rice C.M. Replication of hepatitis C virus. Nat. Rev. Microbiol. 2007; 5: 453-63.
9. Masalova O.V., Lesnova E.I., Shingarova L.N., Tunitskaia V.L., Ulano-va T.I., Burkov A.N. et al. The combined application of nucleotide and amino acid sequences of NS3 hepatitis C virus protein, DNA encoding granulocyte macrophage colony-stimulating factor and inhibitor of regulatory T cells induces effective immune response against hepatitis C virus. Molecularnaya biology. 2012; 46 (3): 525-34. (in Russian)
10. Masalova O.V., Abdulmedzhidova A.G., Atanadze S.N., Lakina E.I., Semiletov Yu.A., Burkov A.N. et al. Characterization of a panel of monoclonal antibodies and mapping the epitopes of hepatitis C virus proteins. DokladyRAN. 2002; 383 (4): 545-50. (in Russian)
11. Mukovnya A.V., Tunitskaya V.L., Khandazhinskaya A.L., Golubeva NA, Zakirova NF, Ivanov AV et al. Hepatitis C virus helicase/NTPase: an efficient expression system and new inhibitors. Biokhimiya.. 2008; 73 (6): 660-8. (in Russian)
12. Ulanova T.I., Puzyrev V.F., Burkov A.N., Obyadina A.P. Impact of the heterogenicity of amino acid sequence on the immunoreactivity of an antigenic epitopic complex localized within amino acids 1192-1456 of protein NS3 protein of hepatitis C virus. Voprosy virusologii. 2006; 51 (1): 28-30. (in Russian)
13. Ivanov A.V., Korovina A.N., Tunitskaya V.L., Kostyuk D.A., Rechinsky V.O., Kukhanova M.K. et al. Development of the system ensuring a highlevel expression of hepatitis C virus nonstructural NS5B and NS5A proteins. Protein Expr. Purif. 2006; 48 (1): 14-23.
14. Masalova O.V., Lesnova E.I., Grabovetskiy V.V., Smirnova O.A., Ulanova T.I., Burkov A.N. et al. DNA immunization with a plasmid carrying the gene of hepatitis C virus protein 5A (NS5A) induces an effective cellular immune response. Molecularnaya biologiya. 2010; 44 (2): 245-53. (in Russian)
15. Masalova O. V., Kushch A.A. Monoclonal antibodies to hepatitis C virus proteins as a tool for antigenic determinant mapping, hepatitis C diagnostics and investigation of viral pathogenesis. Rossiyskiy bioterapevtiches-kiy zhurnal. 2003; 2 (3): 7-24. (in Russian)
16. Thimme R., Neumann-Haefelin C., Boettler T., Blum H. Adaptive immune responses to hepatitis C virus: from viral immunobiology to a vaccine. J. Biol. Chem. 2008; 389 (5): 457-67.
17. Masalova O.V., Lesnova E.I., Pichugin A.V., Melnikova T.M., Grabovetsky V.V., Petrakova N.V. et al. The successful immune response against hepatitis C nonstructural protein 5A (NS5A) requires heterologous DNA/protein immunization. Vaccine. 2010; 28 (8): 1987-96.
18. Alvarez-Lajonchere L., Shoukry N.H., Grá B., Amador-Cañizares Y., Helle F., Bédard N. et al. Immunogenicity of CIGB-230, a therapeutic DNA vaccine preparation, in HCV-chronically infected individuals in a Phase I clinical trial. J. Viral Hepatitis. 2009; 16 (3): 156-67.
19. Ghorbani M., Nass T., Azizi A., Soare C., Aucoin S., Giulivi A. et al. Comparison of antibody- and cell-mediated immune responses after intramuscular hepatitis C immunizations of BALB/c mice. Viral Immunol. 2005; 18 (4): 637-48.
20. Aricó E., Belardelli F. Interferon-a as antiviral and antitumor vaccine adjuvants: mechanisms of action and response signature. J. Interferon Cytokine Res. 2012; 32 (6): 235-47.
Received 15.05.14
ENHANCEMENT OF THE IMMUNE RESPONSE BY CO-DELIVERY OF THE HEPATITIS C VIRUS RECOMBINANT DNA AND PROTEINS OF REPLICATIVE COMPLEX
Masalova O. V. Lesnova E. I. Permyakova K. Yu. Ivanov A. V. 2, Tunitskaya V. L.2, KushchA. A.1
1 Ivanovsky Institute of Virology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia; 2 Engelhardt Institute of Molecular
Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
The plasmids encoding amino acid sequences corresponding to the hepatitis C virus (HCV) are regarded as promising candidates for the anti-HCV vaccines. However, optimal composition of these vaccines was not determined. The goal of this work was to evaluate the immune response after immunization of mice with the DNA construct pcNS3-NS5B encoding proteins, which constitute viral replicative complex combined with the recombinant nonstructural proteins NS3 and NS5B using various adjuvants. DBA mice were immunized with the DNA construct and/or the recombinant proteins three times. The antibody response was evaluated using ELISA. Cell immunity was estimated using lymphocyte proliferation test in vitro and by production and secretion of IFN-y and IL-2 measured in ELISpot and ELISA. It was found that the pcNS3-NS5B plasmid induced predominantly T cell response, whereas the recombinant NS3 and NS5B proteins stimulated a potent humoral immune response. It allowed us to demonstrate for the first time a statistically significant stimulation of both humoral and cell immunity after immunization with the pcNS3-NS5B in combination with the NS3 and NS5B HCV proteins. It was noteworthy that the animals developed the immune response not only to NS3 and NS5B proteins, but also to other antigens encoded by pcNS3-NS5B plasmid (NS4, NS5A). The most pronounced immune response was observed in the mice subjected to a triple immunization with pcNS3-NS5B plasmid in combination with a gene adjuvant pcGM-CSF and recombinant proteins (NS3 and NS5B), which were injected together with IFN-a. The adjuvant activity of IFN-a, which was demonstrated in a model of the HCV gene and proteins, can be prerequisite for including it in a candidate vaccine.
Key words: hepatitis C virus, nonstructural proteins, DNA immunization, recombinant proteins, immune response, adjuvants, IFN-a; vaccine.
