CC BY
14
УДК 541.183
АДСОРБЦИЯ ЦИТОХРОМА С НА ГИДРОКСИЛИРОВАННЫХ И ТРИМЕТИЛСИЛИЛИРОВАННЫХ СИЛИКАГЕЛЯХ
Т.Д. Хохлова
(кафедра физической химии)
Сопоставлена адсорбция цитохрома С на силикагелях (со средними диаметрами пор от 2,5 до 240 нм), гидроксилированных и гидрофобизированных триметилхлорсиланом. В 2%-м изопропаноле в воде при рН 7 максимальная адсорбция (в расчете на 1 г) наблюдалась на гидроксилированных силикагелях при диаметре пор 5-14 нм, а на гидрофобизированных - при 14-36 нм. При введении электролита (ЙаС1) в раствор сдвигает максимум адсорбции на гидроксилированных силикагелях в сторону еще более узких пор. При адсорбции на гидрофобизированных силикагелях этого сдвига не происходит. Изучены также кинетика и рН-зависимость адсорбции.
Силикагели широко используют в качестве носителей адсорбированных ферментов и других белков, а также для очистки растворов белков [1-3]. Для изучения влияния химии поверхности и пористой структуры на адсорбцию белков была рассмотрена адсорбция цитохрома С на двух сериях образцов гидроксилированных и триметилсилили-рованных силикагелей с диаметрами пор от 2,5 до 250 нм. Цитохром С был выбран потому, что он является основным белком и хорошо адсорбируется на силикагелях, поверхность которых, как известно, обладает кислотными свойствами [4].
Экспериментальная часть
В работе использовали цитохром С (Sigma, код С 2037); изоэлектрическая точка pi 9,7, гидродинамический диаметр глобулы d = 3,4 нм [2]. Структурные характеристики взятых для исследования отечественных силикагелей, приведены в табл. 1. Удельные поверхности S были измерены по адсорбции криптона [5]. Объем пор V б^1л определен по капиллярной конденсации бензола, а для самого широкопористого образца - по насыпному весу. Средний диаметр пор D был рассчитан по формуле D = 4 V/S. Средний размер зерен силикагеля составлял около 40 мкм. Для получения I серии образцов селикагели промывали концентрированной соляной кислотой (до исчезновения
Т а б л и ц а 1 Структурные характеристики силикагелей
Марка силикагеля S, м2/г V, см3/г Dc, нм
КСМ-5 800 0,50 2,5
КСС-3 600 0,75 5,0
КСК-2 340 1,20 14
КСК-Ц1) 120 1,10 36
КСК-Ц2) 70 0,88 50
МСА-2500 13 0,60 240
ионов железа), водой (до исчезновения ионов хлора) и высушивали при 180° в течение 6 ч. Для получения II серии образцов силикагели модифицировали триметилхлорсиланом по методике [6]. Для определения адсорбции к навескам силикагелей добавляли по 100 мкл изопропано-ла, так как триметилсилилированные образцы не смачиваются водой, а затем по 5 мл растворов белка в 0,02 М фосфатном буфере. В результате концентрация изопропа-нола в растворе составила 2%. Пробирки периодически встряхивали до установления равновесия. Для выявления роли электролита в адсорбции белка в те же пробирки добавляли по 1 мл 6 М хлористого натрия, вследствие чего концентрация последнего в растворе составила 1 моль/л. Для измерения кинетики адсорбции периодически проводили определение адсорбции при непрерывном перемешивании в течение 2 ч. Адсорбцию рассчитывали по изменению оптической плотности растворов белка при длине волны 400 или 420 нм. Для изучения влияния электролита и рН раствора на адсорбцию белка была измерена адсорбция из 2%-го изопропанола в 0,02 М фосфатных буферных растворах с рН от 2,0 до 10,4. В те же растворы после установления равновесия добавляли хлористый натрий до установления конечной концентрации 1 моль/л.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 приведена зависимость адсорбции цитохрома С на гидроксилированных силикагелях (в расчете на 1 г силикагеля) от их удельной поверхности. Адсорбцию проводили из 2%-го изопропанола в 0,02 М фосфатном буфере с рН 7,0. Максимум адсорбции наблюдается на силикагелях с удельной поверхностью 340 и 600 м2/г и средним диаметром пор 14 и 5 нм соответственно (рис. 1, кривая 1). Очевидно, что максимальная адсорбция происходит на гидроксилированных силикагелях с размером пор примерно в 1,5-3 раза превышающим гидродинамический размер глобул белка. Введение электролита (хлористого натрия) до концентрации 1 моль/л приводит к частичной десорбции белка (рис. 1, кривая 2). Причина десорбции заключается, вероятно, в конкуренции ионов натрия с положительными зарядами глобул белка за сорб-ционные места - отрицательно заряженные силанольные
Рис. 1. Зависимость адсорбции А (мг/г) цитохрома С от удельной поверхности £ (м /г) гидроксилированных силикагелей: 1 - из раствора 2%-го изопропанола в 0,02 М фосфатном буфере с рН 7,0; 2 - из того же раствора, содержащего 1 моль/л хлористого натрия (исходные концентрации белка 0,2 мг/мл, навески силикагелей по 10 мг, объем раствора 5 мл)
Рис. 2. Зависимость адсорбции А (мг/г) цитохрома С от удельной поверхности £ (м2/г) триметилсилилированных силикагелей (условия адсорбции и обозначения приведены в подписи к рис. 1)
группы поверхности. При этом положение максимума адсорбции сдвигается в область еще более узких пор. Средние диаметры пор этих силикагелей составляют 5 и 2,5 нм, удельные поверхности - 600 и 800 м2/г соответственно. Вероятно, присутствие электролита сжимает ионные атмосферы вокруг глобул белка около заряженной поверхности силикагелей, что делает относительно более узкие поры доступными для проникновения молекул белка.
Несколько по-другому выглядит зависимость адсорбции от размера пор на гидрофобизированных силикагелях (рис. 2). В отсутствие хлористого натрия (рис. 2, кривая
1) максимальная адсорбция наблюдается на силикагелях со средним диаметром пор 36 и 14 нм и средней удельной поверхностью 120 и 340 м/г соответственно. Размер пор этих силикагелей в 3-10 раз превышает размер глобул белка, в случае гидроксилированных силикагелей -только в 1,5-3 раза. Причиной относительно меньшей доступности для адсорбции белка узких пор гидрофоби-зированных силикагелей по сравнению с гидроксилиро-ванными является, вероятно, различие в характере взаимодействий белка, определяющих адсорбцию, с поверхностью. Если адсорбция цитохрома С на гидроксилиро-ванных силикагелях во многом зависит от дальнодей-с твующих сил электростатического притяжения ионов, то адсорбция белка на триметилсилилированных силикагелях - от короткодействующих дисперсионных сил. Введение хлористого натрия в растворы белка приводит к увеличению адсорбции белка на гидрофобизированных силикаге-лях (рис. 2, кривая 2), что обусловлено усилением гидрофобных взаимодействий, происходящих вследствие увеличения концентрации электролита. При этом введение электролита в раствор белка не изменяет положение максимума адсорбции на гидрофобных силикагелях.
Кинетические кривые зависимости адсорбции цитохро-ма С на гидроксилированном и триметилсилилированном образцах силикагеля с диаметром пор 14 нм и удельной поверхностью 340 м/г приведены на рис. 3. Видно, что на гидроксилированном образце адсорбционное равновесие устанавливается в несколько раз быстрее, чем на гид-рофобизированном. Из таких кинетических зависимостей были рассчитаны величины адсорбции амакс и константы скорости адсорбции [7] для силикагелей с удельной поверхностью 74 и 340 м2/г. Эти данные приведены в табл. 2, откуда следует, что равновесные величины адсорбции амакс на гидрофобизированных образцах заметно больше, чем на гидроксилированных, а константы скорости адсорбции к примерно в 2 и 4 раза меньше.
Зависимость адсорбции цитохрома С от рН раствора на гидроксилированном силикагеле с удельной поверхностью 74 м/г в интервале рН от 2 до 10,4 представлена на рис. 4. При относительно небольшой ионной силе растворов (в 2°/о-м изопропаноле из 0,02 М буфера) наблюдается четко выраженный максимум адсорбции при рН 8,6, что примерно на одну единицу рН ниже, чем изоэлект-рическая точка цитохрома р1 9,7 (рис. 4, кривая 1). Эти данные хорошо согласуются с известным фактом, что максимум адсорбции белков находится обычно вблизи их
Т а б л и ц а 2
Адсорбция «макс, и константы скорости адсорбции к, мг"1-л-мин"1 на силикагелях КСК-1 (74 м2/г) и КСК-2 (340 м2 /г)
Образцы КСК-1 КСК-2
амакс к амакс к
Гидроксилированный 92 207 133 313
Гидрофобизированный 119 93 147 76
А, мг/г 160 г
0 50 100 150
Время, мин
Рис. 3. Кинетика адсорбции цитохрома С на силикагеле КСК-2 (340 м2/г): 1 - гидроксилированном, 2 - триметилсилилиро-ванном. Адсорбция из 2%-го изопропанола в 0,02 М фосфатном буфере с рН 7,0. Исходные концентрации 0,06 мг/мл, навески 2 мг, объем раствора 5 мл
А, мг/г 120 г
0 2 4 6 8 10
pH
Рис. 4. Зависимость адсорбции А (мг/г) цитохрома С на гидроксилированном силикагеле (74 м2/г) от рН растворов; 1 - из 2%-го изопропанола в 0,02 М фосфатном буфере; 2 - из тех же растворов, содержащих 1 моль/л хлористого натрия (исходные концентрации 0,06 мг/мл, навески 2 мг, объем раствора 5 мл)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Полторак О.М., Пряхин А.Н., Чухрай Е.С. // Вестн.
Моск. ун-та.. Сер. 2. Химия. 1977. 18. С. 125.
2. Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В. // Хроматография
биополимеров на макропористых кремнеземах. Л., 1986.
3. Хохлова Т.Д., Никитин Ю.С., Ворошилова О.И. //
Журн. ВХО им. Д.И.. Менделеева. 1989. 39. С. 363.
4. Айлер Р. Химия кремнезема. М., 1982.
5. Экспериментальные методы в адсорбции и хроматогра-
фии. М.., 1990.
рН
Рис. 5. Зависимость адсорбции А (мг/г) цитохрома С на триметилсилилированном силикагеле (74 м1/г) от рН растворов (условия адсорбции и обозначения приведены в подписи к рис. 4 )
изоэлектрических точек [ 8, 9 ]. Это обусловлено проявлением вклада в адсорбцию гидрофобных взаимодействий. Небольшой сдвиг положения этого максимума в область значений рН, немного более низких, чем значения р1 свидетельствует о проявлении при этом электростатических взаимодействий положительно заряженных глобул белка с отрицательно заряженной при рН 8,6 поверхностью сили-кагеля. Адсорбция довольно резко падает при уменьшении рН раствора. Введение хлористого натрия в раствор до установления концентрации 1 моль/л приводит к частичной десорбции цитохрома С при любых значениях рН растворов ( рис. 4, кривая 2 ).
В растворах с малой ионной силой (при рН от 3,0 до 10,4) на триметилсилилированном силикагеле наблюдается высокая степень адсорбции белка, мало зависящей от рН ( рис. 5, кривая 1). Только при рН 2,0 происходит значительное уменьшение адсорбции. При значениях рН от 2,0 до 7,0 введение хлористого натрия в раствор немного усиливает адсорбцию (рис. 5, кривая 2). При относительно высоких значениях рН (8,6 и 10,4) введение электролита заметно уменьшает адсорбцию. Причина может заключаться в разрушении модифицирующего триметилсилильного покрытия при высоких рН из-за большой растворимости кремнезема [4]. Полученные данные позволяют оптимизировать химию и геометрию поверхности силикагелей, а также условия их применения в адсорбции белка.
6. Лисичкин Г.В., Кудрявцев Г.В., Сердан А.А. и др. Моди-
фицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии. М., 1986.
7. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Мардалейшвили М.Н. и
др. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1987. 28. С. 230.
8. Norde W., MacRitchie F., Novika G., Lyklema J. // J. Colloid
Interface Sei. 1986. 112. P. 447.
9. Любинский Г.В. // Укр. биохим. журн. 1984. 56. №4.
С. 390.
Поступила в редакцию 05.03.02
