CC BY
7ГТАМР:34.27.19
Ж.А. ОРЫНБАЕВА1*, З.Б. ТУЩЫШБАЕВА1, Н.Б. МОЛДАГУЛОВА2, Д.К. КУЛЖАНОВА1, Н.В. РУДАКОВ3
1 Абай атындагы ^азак улттык педагогикалык университетi, Алматы, ^азакстан
2Экостандарт.kz, Астана, ^азакстан 3Омбы табиги - ошакты инфекциялар ГЗИ, Омбы, Ресей *e-mail: jadi_astana@mail.ru
АДГЕЗИЯ ЭД1С1МЕН ПЕРСПЕКТИВТ1 ПРОБИОТИКАЛЬЩ
ШТАММДАРДЫ АЛУ
doi:10.53729/MV-AS.2023.03.14
ТYЙiн
Зерттеудщ максаты перспективт пробиотикалык штаммдарды yH жагдайында дайындалган: бие CYтi, кымыз, ш^бат, катык, айран CYткышкылды тагамдардан белш алу.
Пробиотикалык микроорганизмдердщ адгезивт касиетi асказан-iшек шырышты кабыгыныц эпителий жасушаларын байланыстыратын рецепторлар Yшiн патогендi жэне шiрiк бактериялармен бэсекелесу кабшеттшп тексерiлдi. Белсендi 16 CYткышкылды бактериялардыц iшiнен жогары жэне орташа керсетюштерге ие 12 штаммы iрiктелiп алынды. Bruker MALDI-TOF BIOTYPER жYЙесi аркылы идентификациялау барысында олар Lactobacillus туыстыгына жататын 7 тYрi аныкталды: L. plantarum, L.rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. brevis, L. bulgaricus жэнеL. acidophylus. Аныкталган 7 штаммныц адгезивт белсендшш жогары дэрежеш керсеттi.
Зерттеу нэтижесiнде алынган белсендi штаммдардан пробиотикалык консорциум Lactobacillus paracasei S-612, Lactobacillus plantarum S-106, Lactobacillus plantarum S-414, Lactobacillus rhamnosus S-811, Lactobacillus acidophylus S-1, Lactobacillus brevis S-2, Lactobacillus fermentum d-4 жиынтыгы к¥рылды. Пробиотикалык консорциум алкогольдi сусынмен закымдалган iшкi агза куыс мYшелерiн тYзету Yшiн пробиотикалык енiм жасау Yшiн тандалып алынды.
Кiлттi сездер: CYткышкылды бактериялар, лактобактериялар, пробиотиктер, адгезивт белсендiлiк, штаммдар.
Гылыми - зерттеу ж^мыстыц басты максаты алкогольдi сусындармен закымданган imxi агза куыс мYшелерiне оц эсер ететiн, болашакта пробиотикалык ешм алуда колданылатын пробиотикалык перспектив^ штаммдар алу болып табылады.
Пробиотиктердщ казiрri заманауи тужырымдамасы соцгы онжылдыкта каркынды дами бастады[1].
^азiргi уакытта ^азакстан халкы, бYкiл элем сиякты, д^рыс тамактануга жэне пайдалы енiмдердi колдану, оныц imiнде к¥рамында пробиотиктер бар енiмдердi тутынуга мYДделi. Осыган байланысты жаца пробиотикалык микроорганизмдердi iздеуге багытталган зерттеулер езектi болып отыр. Ашытылган функционалды тагамдарды дайындау Ymrn пробиотикалык штаммдар ретiнде аныкталган жэне сипатталган микроорганизмдердщ таза, емiршец штаммдары колданылады [2].
БYгiнгi тацда пробиотиктерге ^i микроорганизмдердi жаткызамыз. Ягни, адамныц негiзгi микрофлорасыныц екiлдерi ретiнде асказан-шек жолына жеткiлiктi мелшерде енген кезде белсендшгш, емiршецдiriн сактайды жэне денсаулыгына оц эсер етедi. Пробиотиктер ретшде бифидобактериялардыц эртYрлi тYрлерi колданылады (Bifidobacterium longum, B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. adolescentis, B. animalis), лактобактериялар (Lactobacillus rhamnosus, L. acidophilus, L. casei, L. bulgaricus, L. gasseri)жэне баскалары микроорганизмдер (lactococcus cremoris, L. lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii). Генетикалык эртYрлiлiктiц аркасында олар бiр-бiрiнен касиетщ^ бойынша айтарлыктай ерекшеленед^Бул гылыми-зерттеу жумысы пробиотиктердi медицина, ендiрiс саласында, ауылшаруашылыгындагы
езект мэселелердi шешу Yшiн жаца перспективт биологиялык препараттарды куру мэселелерiне арналган [3]. Бiрак бiздщ зерттеу жумысымыздыц алга койган тапсырмалары бойынша лактобактерия тукымдастарыныц бактерияларын зерттеу болып табылады.
Пробиотикалык бактериялар эртYрлi механизмдердi, ягни соныц iшiнде микробка карсы байланыстардыц, патогендiк бактериялардыц адгезиясыныц темендеуi аркылы энтеропатогендерге карсы корганыс релiн аткарады [4].
Пробиотиктердщ эсер ету механизмдерше патогендiк
микроорганизмдердщбэсекелестшнжою, есуiн тежеу жэне иммундык модуляция жатады. Олар шек эпителийiне жабыса алатын бактериялар болып табылгандыктан, асказан^шек жолында колониялары едэуiр белсендi тYPде болады да, осылайша симбионттар арасындаайкын артыкшылыктарга ие екенш керсетедi. Ас корыту жYЙесiне енетш кептеген бактериялар асказан селi мен ет ортасында тiршiлiгiн жояды да, осы факторларга тезiмдi микроорганизмдер ретшде пробиотиктер айкын ерекшелiктерiн керсетедi. Шырышты кабыктыц эпителийiне енiп, олар бэсекелеспк ерекшелiк деп аталатын процестщ нэтижесшде патогендiк микроорганизмдердщ есуiн тежеуге кабшета болып саналады. Тарихи тургыдан алганда, бул механизм пробиотиктердi емдiк эсерге керсететш негiзгi механизм ретiнде карастырады[5-7].Пробиотиктер Yшiн негiз ретiнде саналатын микроорганизмдер келесщей талаптарга сай болуы тшс: 1)патогендi жэне улы емес; 2) асказан^шек жолдарындагы кышкылдар мен ет кышкылдарына тезiмдi болу; 3) шектщ эпителий жасушаларына бекiтiлуi; 4)iшек жолы колонизациясы аркылы тез кебеюге; 5) шекте метаболиздену; 6)iшек нормофлорасын турактандыру; 7)лиофилизацияланган препараттарды алу процессiнде емiршецдiгiн сактауы [8].
Соцгы жылдарыкурамында пробиотикалык бактериялары бар ашытылган ешмдердщ пайдалы эсершщ гылыми дэлелдерiн алу максатында кептеген зерттеулер жYргiзiлдi
[9].Лактобактериялардыц асказан-шек жолдарыныц шырышты кабыгыныц бетiне жабысуы сэттi колонизациялануыныц бастапкы сатыларыныц бiрi болып саналады
[10].Зертханадагы адгезивтi кабшетш зерттеу эдiсi инвазияныц алдын алуда шешушi рел аткарады жэне дешек коздыргыштарыныц колонизациясы мен бактериялардыц бэсекеге кабшеттшпн аныктайды [11].Адгезивтi белсендiлiк эдiсi - бул бактериялык жасуша кабыргасыныц беткi компоненттерi мен жасуша бетшщ комплементарлы курылымы арасындагы езара эрекеттесу [12]. Зертханалык адгезивтi белсендiлiктi аныктау эдiсi потенциалды механизммен байланысты экзополисахаридтер, липидтер, кемiрсулар, мембранамен байланыскан рецепторлар жэне нуклеин кышкылдары ферменттер ендiрiсi болып табылады [13]. Адам денсаулыгына оц эсер беретiн, зертханалык штаммдар iшек куысындагы жасушаларэпителийiнежабысу кабiлетi жогары болгандыктан, патогендi микроорганизмдерден коргай алатын кабшет де жогарылай тYседi [14-15]. Адгезивт белсендiлiк эдiсi - микроорганизмдердщ кез-келген тыгыз субстраттарды, соныц шшде адам мен жануарлар улпаларын колонизациялауын камтамасыз ететiн кYPделi кеп компонента процесс.БYгiнгi кYнде адгезивтi белсендiлiктi зерттеу Yшiн организм иесiнiц жасушаларын in vitro жэне in vivo эдютер аркылы зерттеу усынылган. Алайда in vivo эдiстерiзертханалык жануарларды колдану аркылыштаммдардыц кеп мелшерiн зерттеу Yшiн ете кеп уакытты кажет ететiнiн, сонымен катар кымбат жэне жарамсыз екендшн дэлелдедi. Осыган байланысты бактериялардыц адгезивт белсендiлiгiн аныктауда in vitro эдiсiн колдану барысындажасушалар ретiнде жиi эритроциттер колданылады. Ал калыпты микрофлораныц мацызды функцияларыныц бiрi болып, оныц корганыс касиеттерш аныктайтын колонизацияга тезiмдiлiк пен адгезия болып табылады [16].
Микроорганизм микрофлорасыныц турактылыгы мен корганыс касиеттерi кебiнесе адгезивтi касиетке байланысты екенш атап еткен жен. Адгезияныц аркасында резиденттiк микрофлора колонизацияга тезiмдiлiк касиетш жYзеге асырады. Ягни, биотоптардыц бегде микроорганизмдермен коныстануына жол бермейдi жэне инфекциялык агенттерден корганыс тоскауылын жасайды. Баскаша айтканда, адгезияныц молекулалык механизмдерi патогендiк формалар Yшiн де, нормофлора екiлдерi Yшiн де эмбебап болып табылады.
Зерттеу материалдары мен эдктер1
Таза культураларды белш алу
Гылыми зерттеу жумысына 16 CYткышкылды культуралар Алматы жэне Астана калаларындагы YЙ жагдайындагы CYт енiмдерден, ягни бие CYтi, кымыз, катык, шубаттан белiнiп алынды. СYткышкылды бактерияларды есiру Yшiн арнайы HiMedia фирмасыныц MRS корекпк ортасы колданылды. Ягни, белiп алынган культураларды микроаэрофильдi жагдайда37°С температурадагы (redLINE RI-53, Германия) термостатка 48 сагатка инкубацияга койылды. Осы зерттеу жумысыныц максатында колданылатын эдiс халыкаралык стандартка(КО 8261, СYт жэне CYт енiмдерi. Микробиологиялык зерттеулер Yшiн сынамаларды, бастапкы суспензияларды жэне ондык суйылтуларды дайындау бойынша жалпы нускаулар)сэйкес болып табылады.
Жалпы белшш алынган, таза культуралар Bruker MALDI-TOF Biotyper жYЙесiн колдану аркылы идентифицикациядан етюзшдь Maldi-TOF MS Yлгiлерiнiц дайындалуыкелесщей болды: балгын жеке бiр колонияны MSP 96 жылтыратылган болат нысанага (Bruker Daltonik) тiкелей ауыстырып кеширдь Эрi карай 1 мл каныккан a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCA) matrix solution ерiтiндiсiмен жабылып, 50% ацетонитрилде -2.5% трифторуксусты кышкылында (Bruker Daltonik) жэне белме температурасында кептiрiлдi [17].
Зерттеу максаты бойынша эрбiр белiнiп алынган микроорганизмдерге адгезивтi белсендшгш аныктау эдiсi жYргiзiлдi. Микроорганизмдердщ адгезивт белсендiлiк эдюь микроорганизмдердщ катты беттерде жэне сезiмтал жасушаларда адсорбциялану кабшеп бар деген магынаны бiлдiредi. Жалпы культуралардыц адгезиясын in vitro жYЙесiнде адамныц 0 (1) (Rh+) формалинизацияланган эритроциттерiнде В.Брилис эдiстемесi бойынша зерттелдь Микроскопиялык зерттеу бойынша кем дегенде 5 керу ерiсiнде кемiнде 100 эритроциттердi санау жумысы жYргiзiлдi. Адгезияныцорташа керсеткiшi (АОК) бойынша адгезия коэффициент аныкталды. АОК бiр эритроциттщ бетше бекiтiлген микробтардыц орташа саны бойынша аныкталып, 5 керу ерiсiндегi барлык эритроциттер (кем дегенде 50 эритроцит) саны саналды. Адгезияныц 0-ден 1,0-ге дейiнгi АОК - нелге тец, ал 1,01 -2,0 - темен, 2,01-4,01 - орташа,4,0-денжогары деп саналады. ^арастырылган эритроциттердiц жалпы санынан эритроциттердщ пайызы есептелдi.
Адам эритроциттерiнiц суспензиясын дайындау.
Адгезивтi белсендiлiктi аныктау эдiсiн колдану Yшiн (I) Rh+ топтагы (9 мл) адам каны алынды.Алынган канныц салмагы 18,9609 г, ал дистилденген судыц салмагы 18,9609 г етш екi пробиркага бiрдей салмакта елшенiпекi пробирка центрифуга iшiне карама-карсы койылды. Тек эритроциттердi таза белш алу Yшiн 0,9% натрий хлорид ((NaCl) массалык Yлесi ю (NaCl)~ 0,9%) ерiтiндiсiнiц он есе келемiмен Yш рет жуылып, 10 минут 1500 айналымда (Centrifuge CM-6M) центрифугалау эдiсi аркылы сол ерiтiндiдекайта суспензияланды. ^ан Yлгiсiнiц Yстiнен сары су белшш, астыцгы белiкте эритроциттер жиналды. Осылайша (I) Rh+ топтагы кан Yлгiсi тазаланып таза эритроцит алынды.
Адгезивт белсендiлiк эдiсi бойынша 0,5 % эритроцит дайындалды. Ол Yшiн стерилденген 50 мл натрий хлорид ерiтiндiсi алынып, одан 0,250 мкл натрий хлорид ерiтiндiсiн алып тастап, YCTi^ 250 мкл эритроцит куйып араластырылды. Дайын болган 0,5 % эритроцит ерiтiндiсiмен штаммдарды енгiзу жумыстары жYргiзiлдi.
Эрi карай реакцияFаGT204-0096D сериядагы U-тэрiздi иммунологиялык реакцияларга арналган какпагы бар 96 сацлаулыплашка колданылды. Плашканыц сацлауларына дайындалган тутас суспензия енпзшш отырды. Плашкага0,250 мкл натрий хлорид ерiтiндiсiн толтырып шыгып, эр сацлауга енгiзетiн штаммдардыц атаулары белгiленiп алынды. Титрлеу аркылы плашкадан 1:4, 1:6, 1:8, 1:16 етш 0,25 мкл алып тасталынып отырды. Эрi карай барлык плашканыц сацлауларына 0,5 % эритроцит 0,25 мкл-дан енпзшдь Дайын болган эритроцит ерiтiндiлерi араласкан штаммдары барплашканы37°С температурага термостатка 3 сагатка, эрi карай калыпты температурадагы 4°С тоцазыткышка 24 сагатка койылды.
Зерттеу нэтижелер1 жэне оларды талкылау
Бiр тэулiктен соц плашкадагы штаммдардыц 0,5% эритроцит ерiтiндiсiмен эрекеттескен нэтижесi алынды. Зерттеу барысындаадгезивт белсендiлiктi аныктау штаммдармен жумыс iстеу киындыкты тудырды. Себебi алынган нэтиже бойынша оларда 0,5% -дык эритроцит ерiтiндiсiмен титiрлегендегi эритроцит тунбасы кейбiр штаммдарда агып кетш отырды. Кейбiр штаммдар (I) Rh+ топтагы канмен араласканда эритроцитке жабысып туратындыгын кeрсеттi. Сонымен катар, зерттеуге PremiereЕ5микроскопы аркылы микроскопиялык талдау жасалынды.Микроскопиялык талдауда эритроциттердi керу слайд эйнеп аркылы iске асырылды. Ягни, бул эйнек белгiлi бiр калыцдыгы тепстелген жиегi бар 76 х 26 стандартты eлшемдегi шыны эйнек. Эдетте шыныныц бетi тегiс жэне бiркелкi калыцдыгы 1 мм болып келедь Зерттелiп отырган Yлгiмен шыны арасында кeпiршiктерiнiц болуына жол бермейдi.
Сурет 1 - де боялмаган (I) Rh+ топ канынан бeлiнiп алынган таза боялмаган эритроциттер берiлген. Боялмаган эритроциттер зертханалык шыны эйнекке тамшуырмен тамызу аркылы жасалып микроскопияда бакыланды. Ал сурет 2 - де эритроцитке CYткышкылды бактериялар жабыскан (S-106 штамы) бейнесi берiлген.
Ягни, S-106 штамы 0,5 % эритроцит ерiтiндiсiмен эрекетке тYCкен кезде Фуксин (C2oHi9N3'HCL) бояуымен боялып микроскоп аркылы аныкталды. Зерттеуге алынган 16 CYткышкылды бактерияларды зерттей отырып, кесте 1-де жогары, орташа, темен жабыскактык эсерлерi бар штаммдар эртYрлi кeрсеткiште аныкталды. Жэне де зерттеу жумыстыц нэтижесш накты аныктау максатында зерттеуге алынган барлык штаммдар адгезивтi белсендiлiкке Yш кайтара тексерiлiп жасалынды.
Кесте 1 - Штаммдардыц адгезивтшк к© эсетюштер!
№ Штаммдардыц атауы Адгезияныц орташа ^рсете™! (АОК) Нэтижелер1
1 2 3 4
1 Lactobacillusparacasei S- 612 4,0 ± 1,6 Жогары
2 LactobacillusplantarumS- 106 4,0 ± 1,0 Жогары
3 Lactobacillus brevis S- 149 2,1 ± 0,5 Орташа
4 LactobacillusplantarumS-74 0,6± 0,1 Белсендшп жок
5 LactobacillusplantarumS- 414 4,0 ± 1,8 Жогары
6 Lactobacillus sakeiS-21 2,8 ± 1,5 Орташа
7 Lactobacillus rhamnosusS-811 4,1 ± 1,6 Жогары
8 Lactobacillus lactisS- 819 1,0 ± 1,0 Элаз
9 Lactobacillusfermentumm -5 3,0 ± 1,0 Орташа
10 Lactobacillus pentosus S-805 1,3 ± 0,2 Элс1з
11 Lactobacillus acidophylusS-1 4,5 ± 1,4 Жогары
1- ^cre жaлFacы
1 2 3 4
12 Lactobacillusbrevis S -2 4,2 ± 1,7 ЖoFapы
13 Lactobacillus pentosusS - 4 1,5 ± 0,25 Элciз
14 Lactobacillus lactisd-2 2,5 ± 1,0 Оpтaшa
15 Lactobacillus caseid-3 2,0± 1,08 Оpтaшa
16 Lactobacillusfermentumd-4 4,0 ± 1,4 ЖoFapы
Еcкepтy: AOK: 0-1,0 -бeлceндiлiгi жoк; 1,0-2,0 -элciз; 2.01-4.01 -opтaшa; > 4,0 - жoFapы
fflTaMMgapgwrç agre3HBTmiriH 3epTTey B. Bpunuc agicreMeci GoHbiHmaagaMHbirç 0 (1) (Rh+) TOÖWHHR эpнтpoцнттepiн in vitro apKbinbi «Ypri3ingi. HaTH«eciHge Gapnbi; mTaMMgap apTYpni agre3HBTiniK KacueTm Kepcerri. Bipa;, 3epTTeyre anwHFaH 16 cYTKbimKbingbi GaKTepHflnapgbirç imÍHeH 7 mTaMM «oFapw, 5 mTaMM opTama, 3 mTaMM anci3 agre3HBTiniKTi, an 1 mTaMM0e.nceHgi.mri «o; eKeHiH KepceTTi. Bapnbi; mTaMMgapgwrç agre3uaFa
KepceTKimTepimrç MaHgepi 1 Kecrege KenTipinreH.
^opuTHHgu
3epTTey GapwcbiHga anwHFaH HaTH«enepre CYñeHe oTbipbin, cYTKbimKbingbi eHiMgepgeH Genirnn anHHFaH mTaMMgapgbirç agre3HAcbiHbirç e3repyi GaKTepHflnapgbirç ecy opTacbiHa GañnaHHCTH eKeHgiri GañKanagbi. ^fhh, pH KbimKbingbi; opTacbiHbirç e3repyi, TeMnepaTypa «aHe ge t.6. GañnaHbicTbi. ^aHe ge Gyn agaMHbirç mhkpoöth экonoгнacнн 3epTTey canacwHga 3epTTenreH ManiMeTTepMeH, ageGuerrepMeH pacranagbi. Agre3HBTiniK GenceHginiKTi aHbiKTay npoÖHOTHKanwK mTaMMgapgwrç acepiH GaKwnayga eTe Marçbi3gbi KepceTKim Gonwn TaGwnagw.
3epTTenreH mTaMMgapgwrç HaTH«eciHge anwHFaH GenceHgi mTaMMgapgaH npoGuoTHKanbi; кoнcopцнyм (Lactobacillus paracasei S-612, Lactobacillus plantarum S-106, Lactobacillus plantarum S-414, Lactobacillus rhamnosus S-811, Lactobacillus acidophylus S-1, Lactobacillus brevis S-2, Lactobacillus fermentum d-4) «hhhthfh K¥pwngw.
3epTTey GapwcwHga anbiHFaH HaTH«enepre CYHeHceK, ac;a3aH-imeK «ongapw MHKpo^nopacwH «aHe anKoronbgi cycwHMeH 3a;wMganFaH imKi aF3a ;ywc Mymeneprn KanwnKa KenTipyge TaFaMFa GenceHgi ;ocna peTiHge KongaHyFa GonaTHH Gipereñ кoнcopцнyмgbI a3ipney YmiH MYMKiHgiK Gepegi.
3fle6neTTep:
1 Lilly D.M., Stillwell R.H. Probiotics: Growth promoting factors produced by microorganisms. Science. 1965 Feb 12;147(3659):747-8(doi: 10.1126/science.147.3659.747)
2 .ara$ A.C., CanapGeKOBa A.A., AxMegoBa 3.P., KangwöeROBa r.A., KaHTypeeBa r.O. Saccharomyces cerevisiae aGopureHgi mTaMgapgwrç apTYpni MaHgepiHe Te3ÍMginiriHe «aHe epÍTKÍmTepre gereH mhkpoöth agre3HacbiH 3epTTey. MuRpoGuonorua «aHe BHpyconorua, №2 (41) 2023 (doi: 10.53729/MV-AS.2023. 02.14)
3 Mercenier A., Pavan S., Pot B. Probiotics as biotherapeutic agent: present khuwledge and future prospects. CurrPharmDes. 2013;9(2):175-91(doi: 10.2174/1381612033392224)
4 KaHoHKHHa M.C., OoMeHKo H.A., HepHyxa H.M., Mameнцeвa H.r. MeTogw cene^HH
npoôuoTHHecKHx MHKpoopraHH3MoB c bhcokhmh agre3HBHHMH cBoHcTBaMH. KnuHunecKoe nuraHue MeTa6onu3M 2023.Tom 4, (1): 19-28 (doi.org/10.17816/clinutr321901)
5 Julio Plaza-Diaz, Francisco Javier Ruiz-Ojeda,Mercedes Gil-Campos, and Angel Gil Mechanisms of Action of Probiotics/ 2019 Jan; 10(Suppl 1): S49-S66 (doi: 10.1093/advances/nmy063)
6 Larsen N, Vogensen FK, Gobel RJ, Michaelsen KF, Forssten SD, Lahtinen SJ, Jakobsen M. Effect of Lactobacillus salivarius Ls-33 on fecal microbiota in obese adolescents. Clin Nutr 2013 Dec;32(6):935-40 (doi: 10.1016/j.clnu.2013.02.007)
7 De la Fuente-Nunez, Meneguetti BT, Franco OL, Lu TK. Neuromicrobiology: how microbes influence the brain. ACS Chem Neurosci 2018 Feb 21;9(2):141-150 (doi: 10.1021/acschemneuro.7b00373)
8 Rather IA, Bajpai VK, Kumar S, Lim J, Paek WK, Park YH. Probiotics and atopic dermatitis: an overview. Front Microbiol 2016 Apr 12;7:507 (doi: 10.3389/fmicb.2016.00507)
9 Саубенова М.Г., Олейникова Е.А., Чижаева А.В., Алыбаева А.Ж., Айтжанова А.А., Амангелдi А.А., Потороко И.Ю. Микробиота человека и болезни цивилизации: в поисках выхода. Микробиология жэне вирусология №3 (38) 2022 (doi: 10.53729/MV-AS.2022.03.01)
10 Keita Nishiyama., Makoto Sugiyamа., Takao Mukai. Adhesion Properties of Lactic Acid Bacteria on Intestinal Mucin. Microorganisms 2016, 4, 34; (doi:10.3390/microorganisms4030034)
11 Du, Y., Li, H., Shao, J., Wu, T., Xu, W.L., Hu, X., Chen, J. Adhesion and colonization of the probiotic Lactobacillus plantarum HC-2in the intestine of Litopenaeus vannamei are associated with bacterial surface proteins. Front. Microbiol. 2022 Apr 13;13:878874(doi:10.3389/fmicb.2022.878874)
12 Alpe, D., Kuleasan, H. Determination of competition and adhesion abilities of lactic acid bacteria against gut pathogens in awhole-tissue model. Biosci.Microbiota. Food Health 2020, 39 (4), 250-25 (doi: 10.12938/bmfh.2020-033)
13 Vasquez, A., Forsgren, E., Fries, I., Paxton, R.J., Flaberg, E., Szekely, L., Olofsson, T.C. Symbionts as major modulators of insecthealth: Lactic acid bacteria and honeybees. PLoS ONE 2012,7, e33188 (doi.org/10.1371/journal.pone.0033188)
14 Wang R.., Jiang. L., Zhang M., Zhao L.., Hao Y.L., Guo H.Y., Sang Y., Zhang H. and Ren F.Z. The adhesion of Lactobacillus salivarius REN to a human intestinal epithelial cell line requires s-layerproteins,Sci. Rep., 2017,7, 44029 (doi: 10.1038/srep44029)
15 Sun Z.L.., Huang L.H.., Kong J., Hu S.M., Zhang X.W. and Kong W.T. In vitro evaluation of Lactobacillus crispatus K313 and K243: high-adhesion activity and anti-inflammatory effect on Salmonella braenderup infected intestinal epithelial cell,Vet. Microbiol., 2012 Sep 14; 159(1-2):212-20 (doi: 10.1016/j.vetmic.2012.03.043)
16 Масирбаева А.Д., Сайфудин, Б.К. Амирашева А.Ш., Жантлесова С.Д., Ерденбекова М.Б., Талапбек Ш., БайсариеваА.М. Клиническое применение пробиотиков ипребиотиков. Микробиология жэне вирусология №1 (40) 2023 (doi:10.53729/MV-AS.2023.01.04)
17 Абитаева Г.К., Сармурзина З.С., Бисенова Г.Н., Мусабаева Б.К., Тултабаева Т.Ч. Профилактикалык максаттагы сусындарды эзiрлеуге арналган пробиотикалык штаммдардыц сипаттамасы. Микробиология жэне вирусология №4 (39) 2022 (doi: 10.53729/MV-AS.2022.04.11)
Ж.А. ОРЫНБАЕВА1*, З.Б. ТУНГУШБАЕВА1 ,Н.Б. МОЛДАГУЛОВА2, Д.К. КУЛЖАНОВА1, Н.В. РУДАКОВ3 1Казахский национальный педагогический университет им.Абая, Алматы, Казахстан
2 Экостандарт.kz, Астана, Казахстан 3Омский НИИ природно-очаговых инфекций, Омск, Россия *e-mail: jadi_astana@mail.ru
ПОЛУЧЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ
МЕТОДОМ АДГЕЗИИ
doi:10.53729/MV-AS.2023.03.14
Аннотация
Целью исследования является выделение перспективных пробиотических штаммов из кисломолочных продуктов домашнего приготовления: кобыльего молока, кумыса, шубата, катыка, кефира.
Адгезивные свойства пробиотических микроорганизмов были проверены на способность слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта конкурировать с патогенными и гнилыми бактериями за рецепторы, связывающие эпителиальные клетки. Из 16 активных молочнокислых бактерий отобраны 12 штаммов с высокими и средними показателями. В ходе идентификации с помощью системы BIOTYPER Bruker MALDI-TOF были идентифицированы 7 видов, которые относятся к роду Lactobacillus: L. plantarum, L.rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. brevis, L. bulgaricus и L. acidophylus. 7 выявленных штаммов показали высокую степень адгезивной активности.
Из активных штаммов, полученных в результате исследования, был создан пробиотический консорциум Lactobacillus paracasei s-612, Lactobacillus plantarum S-106, Lactobacillus plantarum S-414, Lactobacillus rhamnosus S-811, Lactobacillus acidophylus S-1, Lactobacillus brevis S-2,
Lactobacillus fermentum d-4. Пробиотический консорциум был выбран для создания пробиотического продукта для коррекции полых органов внутреннего организма, поврежденных алкогольным напитком.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, лактобактерии, пробиотики, адгезивная активность, штаммы.
IRSTI: 34.27.19
Zh.A. ORYNBAYEVA1*, Z.B. TUNGUSHBAEVA1, N.B. MOLDAGULOVA2,
D.K. КULZHANOVA1, N.V. RUDAKOV3 1Kazakh National Pedagogical University named after Abai, Almaty, Kazakhstan 2Ecostandart.kz, Astana, Kazakhstan 3Omsk Research Institute of Natural Focal Infections, Omsk, Russia *To contact the author:jadi_astana@mail.ru
OBTAINING PROMISING PROBIOTIC STRAINS BY THE ADHESION METHOD
doi:10.53729/MV-AS.2023.03.14
Abstract
The aim of the study is to isolate promising probiotic strains from fermented dairy products of homemade: mare's milk, koumiss, shubat, katyk, kefir.
The adhesive properties of probiotic microorganisms were tested for the ability of the gastrointestinal mucosa to compete with pathogenic and rotten bacteria for receptors binding epithelial cells. 12 strains with high and average indicators were selected from 16 active lactic acid bacteria. During identification using the BIOTYPER Bruker MALDI-TOF system, 7 species that belong to the Lactobacillus family were identified: L. plantarum, L.rhamnosus, L. casei, L. paracasei, L. brevis, L. bulgaricus and L. acidophylus. 7 identified strains showed a high degree of adhesive activity.
The probiotic consortium Lactobacillus paracasei s-612, Lactobacillus plantarum S-106, Lactobacillus plantarum S-414, Lactobacillus rhamnosus S-811, Lactobacillus acidophylus S-1, Lactobacillus brevis S-2, Lactobacillus fermentum d-4 was created from the active strains obtained as a result of the study. The probiotic Consortium was selected for creation of a probiotic product for the correction of hollow organs of the internal body damaged by an alcoholic beverage.
Keywords: lactic acid bacteria, lactobacilli, probiotics, adhesive activity, strains.
The main goal of the research work is to obtain promising strains of probiotics that have a positive effect on the internal organs of the cavity affected by alcoholic beverages, which will be used in the future in the production of probiotic products.
The current modern concept of probiotics began to develop rapidly in the last decade[1].
Currently, the people of Kazakhstan, like the rest of the world, are interested in proper nutrition and the use of healthy products, including the consumption of products containing probiotics. In this regard, research aimed at finding new probiotic microorganisms is becoming relevant. For the preparation of fermented functional foods, pure, viable strains of microorganisms identified and described as probiotic strains are used [2].
Today, we attribute live microorganisms to probiotics. That is, as representatives of the main human microflora, when entering the gastrointestinal tract in sufficient quantities, it retains activity, vitality and has a positive effect on health. Various types of bifidobacteria are used as probiotics (Bifidobacterium longum, B. breve, B. infantis, B. bifidum, B. adolescentis, B. animalis), lactobacilli (Lactobacillus rhamnosus, L. acidophilus, L. casei, L. bulgaricus, L. gasseri) and other microorganisms (lactococcus cremoris, L. lactis, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Saccharomyces boulardii). Due to the genetic diversity, they differ significantly from each other in properties. This research work is devoted to the development of probiotics in the field of medicine, production, the creation of new promising biological drugs to solve pressing
237
problems in agriculture [3]. But according to the tasks set by our research work, it is the study of bacteria of the Lactobacillus family.
Probiotic bacteria play a protective role against enteropathogens by reducing various mechanisms, including antimicrobial bonds, adhesion of pathogenic bacteria [4].
The mechanisms of action of probiotics include the elimination of competition from pathogenic microorganisms, inhibition of growth, and immune modulation. Since they are bacteria that can attach to the intestinal epithelium, their colonies are quite active in the gastrointestinal tract and thus indicate that they have clear advantages between symbionts. Many bacteria that enter the digestive system destroy their life in the environment of gastric juice and bile, and probiotics show clear features as microorganisms resistant to these factors. Penetrating into the epithelium of the mucous membrane, they are considered capable of inhibiting the growth of pathogenic microorganisms as a result of a process called competitive specificity. Historically, this mechanism is considered as the main mechanism by which probiotics exhibit therapeutic effects [5-7]. Microorganisms that are considered the basis for probiotics must meet the following requirements: 1) non-pathogenic and toxic; 2) resistant to acids and bile acids in the gastrointestinal tract; 3) attachment to epithelial cells of the Intestine; 4) fast reproduction by colonization of the intestinal tract; 5) intestinal metabolization; 6) stabilization of intestinal normoflora; 7) preservation of viability in the process of obtaining lyophilized drugs [8].
In recent years, many studies have been conducted in order to obtain scientific evidence of the beneficial effect of fermented products containing probiotic bacteria [9]. The adhesion of lactobacilli to the surface of the gastrointestinal mucosa is considered one of the initial stages of successful colonization [10]. The method of studying adhesive capacity in the laboratory plays a key role in the Prevention of invasion and also determines the colonization of intestinal pathogens and the competitiveness of bacteria [11]. The adhesive activity method is the interaction between the surface components of the bacterial cell wall and the complementary structure of the cell surface [12]. The method for determining laboratory adhesive activity is the production of enzymes of exopolysaccharides, lipids, carbohydrates, membrane-bound receptors and nucleic acids associated with the potential mechanism [13]. As laboratory strains have a high ability to attach to the epithelium of cells in the intestinal cavity, which has a positive effect on human health, their ability to protect against pathogenic microorganisms is also increased [14-15]. The adhesive activity method is a complex multicomponent process that ensures that microorganisms colonize any dense substrates, including human and animal tissues. To date, it is proposed to study the cells of the host of an organism using in vitro and in vivo methods to study adhesive activity. However, in vivo methods have proven to be very time-consuming, as well as expensive and unsuitable, to study a large number of strains using laboratory animals. In this regard, in the process of using the in vitro method in determining the adhesive activity of bacteria, red blood cells are often used as cells. And one of the most important functions of normal microflora is resistance to colonization and adhesion, which determines its protective properties [16]
It should be noted that the stability and protective properties of the microflora of the microorganism largely depend on the adhesive property. Thanks to the adhesion, the resident microflora implements the property of resistance to colonization. That is, it prevents the settlement of biotopes by foreign microorganisms and creates a protective barrier against infectious agents. In other words, the molecular mechanisms of adhesion are universal for both pathogenic forms and representatives of normoflora.
Materials and methods of research
Separation of pure cultures
For research work, 16 lactic acid cultures were isolated from domestic dairy products in Almaty and Astana, namely mare's milk, kumys, katyk, shubat.
For the cultivation of lactic acid bacteria, a special MRS nutrient medium from HiMedia was used. That is, the extracted cultures were incubated for 48 hours on a thermostat at a temperature of 37°C (redLINE RI-53, Germany) in microaerophilic conditions. The method used for the
purpose of this research work is based on the international standard (ISO 8261, milk and dairy products. General guidelines for the preparation of samples, primary suspensions and decimal dilutions for microbiological research).
Total isolated, pure cultures were identified using the Bruker MALDI-TOF biotype system. The preparation of the Maldi-TOF MS samples was as follows: fresh dried an individual single colony with direct transfer to a polished steel target MSP 96 (Bruker Daltonik). Next, 1 ml of saturated a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCA) was covered with matrix solution and dried in 50% acetonitrile -2.5% trifluoruxusic acid (Bruker Daltonik) and at room temperature [17].
For the purpose of the study, a method was carried out to determine the adhesive activity of each isolated microorganism. The method of adhesive activity of microorganisms means that microorganisms have the ability to adsorb on hard surfaces and sensitive cells. The adhesion of general cultures in 0 (1) (Rh+) formalinized human erythrocytes in the in vitro system was studied by the method of V. Brilis. According to a microscopic study, work was carried out to count at least 100 red blood cells in at least 5 visual fields. The adhesion coefficient according to the average adhesion indicator (AOC) is determined. AOC was determined by the average number of microbes attached to the surface of one erythrocyte, and the number of all erythrocytes (at least 50 erythrocytes) in the 5 field of view was counted. AOK of adhesion from 0 to 1.0 is considered zero, and 1.01 -2.0 is considered low, 2.01 - 4.01 is considered medium, and 4.0 is considered high. From the total number of red blood cells considered, the percentage of red blood cells was calculated.
Preparation of a suspension of human erythrocytes.
To use the method for determining adhesive activity, human blood of the (I) Rh+ Group (9 ml) was taken. The resulting blood weighed 18.9609 G, and the distilled water weighed 18.9609 G, and the two test tubes were placed opposite each other in a centrifuge, weighing the same weight. For pure red blood cells only, 0.9% Sodium Chloride ((NaCl) mass fraction ro (NaCl)~ 0.9%) was washed three times with ten times the volume of the solution and re-suspended in the same solution by centrifugation method for 10 minutes at 1500 revolutions (Centrifuge CM-6m). Yellow water was released over the blood sample and red blood cells were collected in the underside. Thus, a blood sample of the (I) Rh+ group was cleaned and a pure erythrocyte was obtained.
According to the adhesive activity method, 0.5% erythrocyte was prepared. To do this, 50 ml of sterilized sodium chloride solution was taken, 0.250 ml of sodium chloride solution was removed from it and mixed with 250 ml of erythrocyte. Work was carried out on the introduction of strains with a prepared 0.5% erythrocyte solution.
Further, a 204-0096d Series U-shaped plate with a cap for immunological reactions was used for the reaction. A whole prepared suspension was inserted into the holes of the plashka. Fill the plate with 0.250 microns of sodium chloride solution and mark the names of the strains that are introduced into each hole. From the plashka by titration 1:4, 1:6, 1:8, 1:16 0.25 |iL was removed. Further, 0.5% erythrocytes of 0.25 ^L were injected into all the pores of the plashka. The prepared sheet with strains mixed with erythrocyte Solutions was placed in the thermostat at a temperature of 37 ° C for 3 hours, and then in the refrigerator at a normal temperature of 4 ° C for 24 hours.
Results and discussion
After a day, the results of 0.5% erythrocyte solution interaction of strains in the plashka were obtained. In the course of the study, the determination of adhesive activity caused difficulties in working with strains. Because according to the results obtained, erythrocyte sedimentation on titration with 0.5% erythrocyte solution was leaked in some strains. Some strains (I) have shown that Rh+ sticks to the erythrocyte when mixed with Group blood. In addition, the study was subjected to microscopic analysis using the Pgemiege5 microscope. In microscopic analysis, the vision of red blood cells was realized through a slide glass. That is, this glass is a glass of standard size 76 x 26 with a flattened edge of a certain thickness. Usually the glass surface is smooth and
has a uniform thickness of 1 mm. Prevents the presence of bubbles between the glass and the sample under study.
Figure 1 - unpainted erythrocyte
Figure 2 - Erythrocyte attached to lactic acid bacteria (S-106 strain )
Figure 1 shows pure unpainted red blood cells isolated from the blood of the unpainted (I) RH+ group. Unpainted red blood cells were made by dripping with a pipette into a laboratory glass glass and observed under microscopy. And Figure 2 shows an image of lactic acid bacteria attached to the erythrocyte (strain S-106).
That is, the S-106 strain was detected under a microscope by staining with Fuchsin (C2oHi9N3*HCL) when exposed to 0.5% erythrocyte solution. By examining 16 lactic acid bacteria taken for the study, strains with high, medium, low stickiness effects were identified in Table 1 in a different indicator. In order to accurately determine the results of the study, all strains taken for the study were tested for adhesive activity in three rounds.
Table 1-indicators of adhesion of strains
№ Name of strains Average adhesion index (AAI) Results
1 Lactobacillusparacasei S- 612 4,0 ± 1,6 high
2 LactobacillusplantarumS- 106 4,0 ± 1,0 high
3 Lactobacillus brevis S- 149 2,1 ± 0,5 moderate
4 LactobacillusplantarumS-74 0,6± 0,1 no activity
5 LactobacillusplantarumS- 414 4,0 ± 1,8 high
6 LactobacillussakeiS-21 2,8 ± 1,5 moderate
7 Lactobacillus rhamnosusS-811 4,1 ± 1,6 high
8 LactobacilluslactisS- 819 1,0 ± 1,0 weak
9 Lactobacillusfermentumm -5 3,0 ± 1,0 moderate
10 Lactobacilluspentosus S-805 1,3 ± 0,2 weak
11 Lactobacillus acidophylusS-1 4,5 ± 1,4 high
12 Lactobacillusbrevis S -2 4,2 ± 1,7 high
13 Lactobacillus pentosusS - 4 1,5 ± 0,25 weak
14 Lactobacilluslactisd-2 2,5 ± 1,0 moderate
15 Lactobacilluscaseid-3 2,0± 1,08 moderate
16 Lactobacillusfermentumd-4 4,0 ± 1,4 high
Note: AAI: 0-1.0 -no activity; 1.0-2.0-weak; 2.01 - 4.01-moderate; > 4.0 - high.
The study of the adhesion of strains was carried out in vitro using erythrocytes of Group 0 (1) (Rh+) of a person according to the methodology of V. Brilis. As a result, all strains showed different adhesion properties. But, out of 16 lactic acid bacteria taken in the Study, 7 strains showed high, 5 strains showed moderate, 3 strains showed weak adhesion, and 1 strain showed no activity. The values of the adhesion indicators of all strains are presented in Table 1.
Conclusion
Based on the results obtained during the study, it is observed that the change in adhesion of strains isolated from lactic acid products depends on the growth environment of bacteria. That is, the pH depends on the change in the acidic environment, temperature, etc. And this is confirmed by the data and literature studied in the field of studying the microbial ecology of humans. Determination of adhesion activity is a very important indicator in the control of exposure to probiotic strains.
From the active strains obtained as a result of the studied strains, A Probiotic consortium (Lactobacillus paracasei S-612, Lactobacillus plantarum S-106, Lactobacillus plantarum S-414, Lactobacillus rhamnosus S-811, Lactobacillus acidophylus S-1, Lactobacillus brevis S-2, Lactobacillus fermentum d-4) was formed.
Based on the results obtained during the study, it is possible to develop a unique consortium that can be used as an active additive to food in the normalization of the microflora of the gastrointestinal tract and the internal organs of the cavity damaged by an alcoholic drink.
References:
1 Lilly D.M., Stillshhell R.H. Probiotics: Groshhth promoting factors produced by microorganisms. Science. 1965 Feb 12;147(3659):747-8(doi: 10.1126/science.147.3659.747)
2 Latif A.S., Saparbekova A.A., Ahmedova Z.R., Kaldybekova G., Kantureeva G.O. Saccharomyces cerevisiae aborigendi shtamdardyrç artYrli manderine tezimdiligine zhane eritkishterge degen mikrobty adgezij asyn zertteu. Mikrobiologij a zhane virusologij a, №2 (41) 2023 (doi: 10.53729/MV-AS.2023. 02.14)
3 Mercenier A., Pavan S., Pot B. Probiotics as biotherapeutic agent: present khushhledge and future prospects. CurrPharmDes. 2013; 9(2):175-91(doi: 10.2174/1381612033392224)
4 Kanochkina M.S., Fomenko I.A., Chernuha I.M., Mashenceva N.G. Metody selekcii probioticheskih mikroorganizmov s vysokimi adgezivnymi svojstvami. Klinicheskoe pitanie i metabolizm 2023. Tom 4, (1): 19-28 (doi.org/10.17816/clinutr321901)
5 Julio Plaza-Diaz, Francisco Javier Ruiz-Ojeda,Mercedes Gil-Campos, and Angel Gil Mechanisms of Action of Probiotics/ 2019 Jan; 10(Suppl 1): S49-S66 (doi: 10.1093/advances/nmy063)
6 Larsen N, Vogensen FK, Gobel RJ, Michaelsen KF, Forssten SD, Lahtinen SJ, Jakobsen M. Effect of Lactobacillus salivarius Ls-33 on fecal microbiota in obese adolescents. Clin Nutr 2013 Dec;32(6):935-40 (doi: 10.1016/j.clnu.2013.02.007)
7 De la Fuente-Nunez, Meneguetti BT, Franco OL, Lu TK. Neuromicrobiology: hosh microbes influence the brain. ACS Chem Neurosci 2018 Feb 21;9(2):141-150 (doi: 10.1021/acschemneuro.7b00373)
8 Rather IA, Bajpai VK, Kumar S, Lim J, Paek ShhK, Park YH. Probiotics and atopic dermatitis: an overvieshh. Front Microbiol 2016 Apr 12;7:507 (doi: 10.3389/fmicb.2016.00507)
9 Saubenova M.G., Olejnikova E.A., Chizhaeva A.V., Alybaeva A.Zh., Ajtzhanova A.A., Amangeldi A.A., Potoroko I.Ju. Mikrobiota cheloveka i bolezni civilizacii: vpoiskah vyhoda. Mikrobiologija zhane virusologija №3 (38) 2022 (doi:10.53729/MV-AS.2022.03.01)
10 Keita Nishijama., Makoto Sugijama., Takao Mukai. Adhesion Properties of Lactic Acid Bacteria on Intestinal Mucin. Microorganisms 2016, 4, 34; (doi:10.3390/microorganisms4030034)
11 Du, Y., Li, H., Shao, J., Shhu, T., Hu, Shh.L., Hu, H., Chen, J. Adhesion and colonization of the probiotic Lactobacillus plantarum HC-2in the intestine of Litopenaeus vannamei are associated shhith bacterial surface proteins. Front. Microbiol.2022 Apr 13;13:878874(doi:10.3389/fmicb.2022.878874)
12 Alpe, D., Kuleasan, H. Determination of competition and adhesion abilities of lactic acid bacteria against gut pathogens in ashhhole-tissue model. Biosci.Microbiota. Food Health 2020, 39 (4), 250-25 (doi: 10.12938/bmfh.2020-033)
13 Vásjauez, A., Forsgren, E., Fries, I., Pahton, R.J., Flaberg, E., Szekely, L., Olofsson, T.C. Symbionts as major modulators of insecthealth: Lactic acid bacteria and honeybees. PLoS ONE 2012,7, e33188 (doi.org/10.1371/journal.pone.0033188)
14 Shhang R.., Jiang. L., Zhang M., Zhao L.., Hao Y.L., Guo H.Y., Sang Y., Zhang H. and Ren F.Z. The adhesion of Lactobacillus salivarius REN to a human intestinal epithelial cell line rejauires s-layerproteins,Sci. Rep., 2017,7, 44029 (doi: 10.1038/srep44029)
15 Sun Z.L.., Huang L.H.., Kong J., Hu S.M., Zhang H.Shh. and Kong Shh.T. In vitro evaluation of Lactobacillus crispatus K313 and K243: high-adhesion activity and anti-inflammatory effect on Salmonella
braenderup infected intestinal epithelial cell, Vet. Microbiol., 2012 Sep 14;159(1-2):212-20 (doi: 10.1016/j.vetmic.2012.03.043)
16 Masirbaeva A.D., Sajfudin, B.K. Amirasheva A.Sh., Zhantlesova S.D., Erdenbekova M.B., Talapbek Sh., Bajsarieva A.M. Klinicheskoe primenenie probiotikov i prebiotikov. Mikrobiologija zhane virusologija №1 (40) 2023 (doi:10.53729/MV-AS.2023.01.04)
17 Abitaeva G.K., Sarmurzina Z.S., Bisenova G.N., Musabaeva B.K., Tultabaeva T.Ch. Profilaktikaly^ ma^sattary susyndardy azirleuge arnalran probiotikaly^ shtammdardyq sipattamasy. Mikrobiologija zhane virusologija №4 (39) 2022 (doi: 10.53729/MV-AS.2022.04.11)
