CC BY
13
Научная статья/Research Article
УДК 58.084.1+633.791
DOI: 10.36718/1819-4036-2024-5-27-33
Ольга Владимировна Бычкова1 в, Ольга Николаевна Мироненко2, Анастасия Викторовна Небылица3, Юлия Романовна Желонкина4, Елена Павловна Мякишева5
из.^Алтайский центр прикладной биотехнологии Алтайского государственного университета, Барнаул, Россия [email protected] [email protected] [email protected] [email protected] [email protected]
АДАПТАЦИИ РЕГЕНЕРАНТОВ HUMULUS LUPULUS L. К УСЛОВИЯМ EX VITRO
Цель исследования - отработка схемы двухступенчатой адаптации растений регенерантов хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) к условиям ex vitro с использованием гидропонной установки. Задачи: изучение влияния способа фиксации регенерантов хмеля в гидропонной системе; определение длительности этапа адаптации на гидропонике; подбор состава субстрата на втором этапе адаптации. Объект исследования - стерильная культура хмеля обыкновенного трех сортов: Цивильский, Флагман и Таурус, после завершения этапа укоренения in vitro на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга (MS), содержащей глюкозу (20 г/л) и ИМК (0,5 мг/л). Определена длительность этапа адаптации хмеля, укорененного в условиях in vitro, на гидропонной системе приливно-отливного типа, определяемая по устойчивому поддержанию тургора листьями и активному росту побегов - 18-21 день. Изучено влияние способа фиксации регенерантов хмеля в гидропонной системе: использование рассадных кассет с субстратом из перлита и вермикулита (1: 1) показало на 25 % выше выживаемость растений по сравнению с бессубстратными кюветами с вкладышами из полиэтиленовой пленки. Показано, что в условиях гидропонной установки, независимо от способа фиксации, высота побегов увеличивалась на 36,048,3 %. Корневая система у адаптируемых в кассетах с субстратом образцов была лучше развита и характеризовалась большим количеством корней 2-го порядка длиной не менее 4 см. Последующий этап адаптации в большинстве торфосодержащих субстратов обеспечивает 100 % выживаемость и получение посадочного материала высокого качества. Представлены рекомендации по выращиванию посадочного материала хмеля после двухэтапной адаптации.
Ключевые слова: адаптация ex vitro, гидропонная установка, посадочный материал, регене-ранты, хмель обыкновенный, Humulus lupulus L.
Для цитирования: Адаптации регенерантов Humulus lupulus L. к условиям ex vitro / О.В. Бычкова [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2024. № 5. С. 27-33. DOI: 10.36718/1819-4036-2024-5-27-33.
Благодарности: исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 2364-10040.
Olga Vladimirovna Bychkova,H Olga Nikolaevna Mironenko2, Anastasia Viktorovna Nebylitsa3, Yulia Romanovna Zhelonkina4, Elena Pavlovna Myakisheva5
12,3,45Aitai Center for Applied Biotechnology, Altai State University, Barnaul, Russia
© Бычкова О.В., Мироненко О.Н., Небылица А.В., Желонкина Ю.Р., Мякишева Е.П., 2024 Вестник КрасГАУ. 2024. № 5. С. 27-33. Bulliten KrasSAU. 2024;(5):27-33.
ВестникКрасГАУ. 2024. № 5 (206)
ADAPTATION OF HUMULUS LUPULUS L. REGENERANTS TO EX VITRO CONDITIONS
The purpose of the study is to develop a scheme for two-stage adaptation of regenerated plants of common hop (Humulus lupulus L.) to ex vitro conditions using a hydroponic installation. Objectives: to study the influence of the method of fixing hop regenerants in a hydroponic system; to determine the duration of the adaptation stage in hydroponics; to select the substrate composition at the second stage of adaptation. The object was a sterile culture of common hop of three varieties: Tsivilsky, Flagman and Taurus, after completion of the in vitro rooting stage on a nutrient medium according to the Murashige-Skoog recipe (MS) containing glucose (20 g/l) and IBA (0.5 mg/l). The duration of the adaptation stage of hops rooted in vitro in a tidal-type hydroponic system was determined, identified by the stable maintenance of turgor by leaves and active growth of shoots - 18-21 days. The influence of the method of fixing hop regenerants in a hydroponic system was studied: the use of seedling cassettes with a substrate of perlite and vermiculite (1: 1) showed a 25 % higher survival rate of plants compared to substrate-free cuvettes with liners made of polyethylene film. It was shown that under hydroponic installation conditions, regardless of the fixation method, the height of the shoots increased by 36.0-48.3 %. The root system of the samples adapted in cassettes with substrate was better developed and was characterized by a large number of 2nd order roots with a length of at least 4 cm. The subsequent stage of adaptation in most peat-containing substrates ensures 100 % survival and the production of high-quality planting material. Recommendations for growing hop planting material after two-stage adaptation are presented.
Keywords: ex vitro adaptation, hydroponic facility, planting material, regenerants, common hop, Humulus lupulus L.
For citation: Adaptation of Humulus lupulus L. regenerants to ex vitro conditions / O. V. Bychkova [et al.] // Bulliten KrasSAU. 2024;(5): 27-33 (In Russ.). DOI: 10.36718/1819-4036-2024-5-27-33.
Acknowledgments: the study was funded by the Russian Science Foundation № 23-64-10040.
Введение. Выращивание растений в условиях in vitro влечет за собой ряд морфофизио-логических и биохимических изменений в условиях очень высокой влажности воздуха, низкой освещенности, постоянной температуры, очень низкой турбулентности воздуха. Зачастую отмечается недостаточная концентрация CO2, зависящая от источников углерода, регуляторов роста и водного потенциала питательной среды, этилена и других летучих веществ и т. д. К тому же условия могут меняться от типа сосуда и степени его закупорки. В связи с этим адаптация к септическим условиям и акклиматизация регенерантов требует большего внимания, чем растения, выращенные в естественных условиях [1, 2].
После переноса в условия ex vitro растениям требуется некоторое время, чтобы «исправить» аномалии, вызванные культивированием in vitro [3, 4]. Растения должны перестроиться со смешанного, а зачастую гетеротрофного типа питания на автотрофный. Помимо этого происходит адаптация фотосинтетического аппарата. Для стабилизации водного баланса и эффективной регуляции транспирации необходимо развитие кутикулы, эпикутикулярного воска и повышение функциональности устьичного аппарата. Как
правило, корневая система, сформированная в условиях in vitro, характеризуется отсутствием корневых волосков и корней второго порядка [5]. В связи с этим для успешного роста и развития необходимо новообразование корней, имеющих характерное морфологическое строение ин-тактных растений.
Таким образом, на последнем, ключевом этапе микроразмножения для растений-регенеран-тов необходимо создание условий, при которых они смогут перестроиться к внезапным изменениям условий окружающей среды для дальнейшего полноценного роста и развития.
Большинство растений адаптируют в теплицах, подбирая оптимальный субстрат (органический, минеральный или смешанный), дозы обработки фунгицидами, поскольку повышенная влажность в начале адаптации ведет к бурному развитию грибков на растениях и поверхности субстрата, дополнительно проводят обработку абс-цизовой кислотой и/или обогащают CO2 и т. д. [6]. В качестве альтернативы ряд исследователей предлагает использование гидропонной установки на этапе адаптации растений-регенерантов к условиям ex vitro [5, 7, 8]. Замена субстрата жидкой средой и автоматический режим освещения и контроля подачи питательного раствора обеспе-
чивают высокую производительность при создании больших объемов посадочного материала. Разные эколого-морфологические характеристики культур обусловливают необходимость индивидуального подбора условий адаптации.
Хмель обыкновенный (Hamulus lupulus L.) является мезогигрофитной многолетней травянистой лианой, которая культивируется как эфирномасличная, техническая и лекарственная культура. В производственных целях сорта размножают вегетативно, и усовершенствование технологических процессов производства саженцев является очень актуальным.
Цель исследования - отработка схемы двухступенчатой адаптации растений-регене-рантов хмеля обыкновенного к условиям ex vitro с использованием гидропонной установки.
Задачи: изучение влияния способа фиксации регенерантов хмеля в гидропонной системе; определение длительности этапа адаптации на гидропонике; подбор состава субстрата на втором этапе адаптации.
Объект и методы. Объектом служила стерильная культура хмеля обыкновенного трех сортов: Цивильский, Флагман и Таурус, после завершения этапа укоренения in vitro на питательной среде по прописи Мурасиге-Скуга (MS),
*
м
С]
с
А
На втором этапе адаптации растения пересаживали в рассадные горшки объемом 500 мл с заранее подготовленными и простерилизован-ными субстратами. Оценивали 10 вариантов субстрата следующего состава (в скобках указаны объемные доли): 1 - чернозем; 2 - верховой
содержащей глюкозу (20 г/л) и ИМК (0,5 мг/л). Адаптация растений-регенерантов проходила в два этапа, на первом использовали гидропонную установку приливно-отливного типа. Растения отмывали от агара в дистиллированной воде (рис. 1, А) и закрепляли в кассеты с полиэтиленовыми вкладышами без субстрата (рис. 1, Б) либо помещали в рассадные кассеты объемом 95-120 мл с субстратом из перлита и агровер-микулита (1 : 1) (рис. 1, В). Для поддержания повышенной влажности первые 5-7 сут растения укрывали прозрачной полиэтиленовой пленкой. Гидропонную установку заправляли питательным раствором по прописи % МS, модифицированной по содержанию КН2РО4, рН раствора контролировали ежедневно. Режим подачи раствора: 5 мин подача, 20 мин перерыв. Освещение в режиме 16 ч день / 8 ч ночь. Окончание этапа определяли по совокупности двух показателей: стойкое поддержание тургора листьями и интенсивный рост побегов. По завершении этапа на гидропонной установке оценивали следующие параметры: количество побегов 1-го и 2-го порядков (шт.), высота главного побега (см), количество корней (шт.), средняя длина корней (см).
торф Юаввтап ТБ1 (торф I); 3 - чернозем : перлит (3 : 1); 4 - чернозем : песок речной (3 : 1); 5 - чернозем : перегной (3 : 1); 6 - торф I : перегной (3 : 1); 7 - торф I : песок (3 : 1); 8 - торф I : перлит (3 : 1); 9 - чернозем : торф верховой раскисленный Сибирский «БиоМастер» (торф II) :
Рис. 1. Регенеранты H. lupulus L. на гидропонной установке: А - после укоренения in vitro перед высадкой; Б - высаженные в кювету с полиэтиленовыми вкладышами; В - высаженные в рассадные кассеты
Вестниц КрасГАУ. 2024. № 5 (206)
перлит (1 : 1 : 1); 10 - торф I : чернозем : перегной : песок (3 : 3 : 1 : 1). Горшки размещались в вегетационной комнате с досвечиванием в режиме 16 ч день / 8 ч ночь. Полив осуществлялся по мере подсыхания земляного кома. Визуальную оценку проводили спустя 3 недели: оценивали развитие корневой системы, формирование
корневого кома, количество побегов, рассчитывали среднюю высоту побегов.
Результаты и их обсуждение. Перед началом адаптации высота регенерантов хмеля in vitro независимо от сорта составляла 13,814,6 см. Мериклоны имели сформированную корневую систему и развитую систему побегов в количестве от 1 до 3 с 6-7 узлами (рис. 2).
Рис. 2. Высота побегов хмеля обыкновенного до и после адаптации на гидропонной установке: А - в рассадных кассетах; Б - в кюветах с полиэтиленовыми вкладышами
Период адаптации составил 18-21 сут. В условиях гидропонной установки высота побегов увеличивалась на 36,0-48,3 %. Способ фиксации оказывал влияние как на ростовые характеристики хмеля, так и на выживаемость. Регенеран-ты, адаптируемые в кюветах, показали худший результат по развитию побегов и корневой системы (рис. 3). Так, в кюветах прирост побегов составил в среднем 8,9 см, а в рассадных кассетах - на 19,3 % больше (11,1 см). Корневая сис-
тема у всех адаптируемых в кассетах образцов была лучше развита и характеризовалась большим количеством корней 2-го порядка, величина самого длинного корня составляла 4 см и более (рис. 3, А). При использовании рассадных кассет не было потери растительного материала - выживало 100 % растений-регенерантов, при использовании кювет без субстрата процент адаптированных растений был ниже - 75 %, наиболее слабые растения погибали.
Рис. 3. Развитие регенерантов хмеля сорта Флагман на гидропонной установке: А - в рассадных кассетах; Б - в кюветах с вкладышами
После 3 недель адаптации независимо от типа фиксации регенерантов на гидропонике средняя высота побегов была максимальной у сорта Таурус - 28,3 и 24,3 см, минимальной -22,6 и 21,7 см у сорта Флагман. В то же время последний сорт при адаптации в кассетах обладал высокой кустистостью, формируя до 15 побегов 2-го порядка, средняя высота которых составляла 12,4 см (рис. 3, А).
Согласно литературным данным, высокий уровень приживаемости растений (90-100 %) на этапе адаптации ex vitro обеспечивает высаживание в субстраты растений с развитыми in vitro корнями [9]. Однако некоторые авторы предлагают укоренять и адаптировать микрорастения одновременно [10]. Для трудноукореняющихся растений это единственный способ адаптации растений к условиям ex vitro.
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о нецелесообразности адаптации регенерантов хмеля со слаборазвитой корневой системой. Доля жизнеспособных регенерантов после акклиматизации на гидропонике не превышала 15 % независимо от способа фиксации (рассадная кассета или кювета с вкладышами).
После адаптации на гидропонной установке растения пересаживались в рассадные горшки в подготовленные смеси. При этом не было необходимости накрывать только что высаженные растения пленкой для поддержания высокой влажности, было достаточно опрыскивания во-
дой из распылителя однократно в течение трех суток. Состав большинства субстратов способствовал росту и развитию растений, 8 из 10 типов смесей показал 100 % приживаемость. В варианте торф : перегной в соотношении 3 : 1 не удалось адаптировать ни одного растения; в смеси чернозем : перегной (3 : 1) доля погибших образцов составила 20 %.
Средняя высота побегов в зависимости от состава субстрата варьировала от 33,7 (чернозем : перегной, 3 : 1) до 63,7 см (чернозем : песок, 3 : 1). Количество побегов у одного растения составляло в среднем от 3,3 (чернозем : перегной, 3 : 1) до 8,0 шт. (чернозем). Развитие корневой системы происходило на всех субстратах. Достаточно плотный корневой ком сформировали растения в следующих субстратах: чернозем : торф (рис. 4, А); чернозем : перлит (3 : 1); чернозем : песок (3 : 1); торф : перлит (3 : 1); чернозем : торф II : перлит (1 : 1 : 1).
Для дальнейшего использования адаптированных регенерантов как посадочного материала лимитирующим фактором является развитие корневой системы, чем развитие надземной части. В природных условиях хмель как многолетняя травянистая лиана умеренного климата вегетирует только в теплый сезон и к зиме формирует мощные зимующие почки в прикорневой зоне. В течение всего периода живой остается только подземная часть, состоящая из главных корневищ и боковых корней [11].
Рис. 4. Хмель после двухэтапной адаптации: А - корневая система саженцев, сформированная на торфе I; Б - корневая система саженцев, сформированная на смеси чернозема, торфа II, перлита; В - общий вид адаптированного растения
После адаптации с целью получения крепко- дует срезать до высоты 2-3 междоузлий, бла-
го посадочного куста рекомендуется присыпать корневую шейку на 1-3 см, благодаря чему происходит утолщение побега и закладка новых почек. Стебли, сформированные in vitro, сле-
годаря чему развиваются новые побеги, регенерирующие из почек de novo, более крепкие, с крупными листьями (рис. 4, В).
Вестни^КрасГЯУ 2024. № 5 (206)
Заключение. В ходе отработки схемы двух-этапной адаптации растений хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) к условиям ex vitro с использованием гидропонной установки показана нецелесообразность адаптации регенеран-тов со слаборазвитой корневой системой - их выживаемость на гидропонике не превышала 15 %. Определена длительность этапа адаптации на гидропонной системе, которая характеризуется устойчивым поддержанием тургора листьями и активным ростом побегов - 1821 день. Показано, что в условиях гидропонной установки высота побегов увеличивалась на 36,0-48,3 %. Изучено влияние способа фиксации регенерантов хмеля в гидропонной системе: использование рассадных кассет с субстратом из перлита и вермикулита (1 : 1) показало на 25 % выше выживаемость растений по сравнению с бессубстратными кюветами с вкладышами из полиэтиленовой пленки. Последующий этап адаптации в большинстве торфосодержа-щих субстратов обеспечивает 100 % выживаемость и получение посадочного материала высокого качества.
Список источников
1. Acclimation of Plantlets to Ex Vitro Conditions: Effects of Air Humidity, Irradiance, CO2 Concentration and Abscisic Acid (a Review) / J. Pospisilova [et al.] // Acta Horticulturae, 2007. Vol. 748. P. 29-38.
2. Влияние светодиодного освещения на адаптацию растений-регенерантов мяты водной в климатической камере / И.В. Князева [и др.] // Вестник КрасГАУ. 2023. № 10. С. 41- 47. DOI: 10.36718/1819-4036-202310-41-47.
3. Hazarika B.N. Morpho-physiological disorders in in vitro culture of plants // Scientia Horticulturae, 2006. Vol. 108. P. 105-120. DOI: 10.1016/j.scienta.2006.01.038.
4. Isah T. Adjustments to in vitro culture conditions and associated anomalies in plants // Acta biologica cracoviensia. Series Botanica, 2015. Vol. 57/2. P. 9-28. DOI: 10.1515/abcsb-2015-0026.
5. Адаптация растений-регенерантов с использованием гидропоники / Н.А. Вечерни-на [и др.] // Известия Алтайского государственного университета, 2008. № 3. С. 7-10.
6. Acclimatization of tissue cultured plantlets: from laboratory to land Acclimatization of tissue cultured plantlets: from laboratory to land / Sh. Chandra [et al.] // Biotechnol. Lett., 2010. Vol. 32. P. 1199-1205. DOI: 10.1007/s10529-010-0290-0.
7. Адаптация регенерантов Rhododendron hybridum к условиям ex vitro / А.А. Эрст [и др.] // Научные ведомости. 2012. № 9 (128). Вып. 19. С. 44-48.
8. Зайцева Ю.Г., Амброс Е.В., Новикова Т.И. Укоренение и адаптация регенерантов морозоустойчивых представителей рода Rhododendron к условиям ex vitro // Turcza-ninowia, 2018. Т. 21 (1). С. 144-152. DOI: 10.14258/turczaninowia.21.1.13.
9. Krasinskaya T., Kukhartchyk N., Matushe-vich V. The effect of ion exchange substrate and succinic acid on ex vitro adaptation of the cherry rootstock VSL-2 (Prunus fruticosa Pall. x P. lannesiana Carr.) // Acta Horticulturae, 2008. Vol. 795. P. 401-408.
10. Кухарчик Н.В. Размножение плодовых растений в культуре in vitro. Минск: Беларуская навука, 2016. 208 с.
11. Перспективная ресурсосберегающая технология производства хмеля: метод. рекомендации. М.: Росинформагротех, 2008. 52 с.
References
1. Acclimation of Plantlets to Ex Vitro Conditions: Effects of Air Humidity, Irradiance, CO2 Concentration and Abscisic Acid (a Review) / J. Pospisilovâ [et al.] // Acta Horticulturae, 2007. Vol. 748. P. 29-38.
2. Vliyanie svetodiodnogo osvescheniya na adap-taciyu rastenij-regenerantov myaty vodnoj v klimaticheskoj kamere / I.V. Knyazeva [i dr.] // Vestnik KrasGAU. 2023. № 10. S. 41- 47. DOI: 10.36718/1819-4036-2023-10-41 -47.
3. Hazarika B.N. Morpho-physiological disorders in in vitro culture of plants // Scientia Horticulturae, 2006. Vol. 108. P. 105-120. DOI: 10.1016/j.scienta.2006.01.038.
4. Isah T. Adjustments to in vitro culture conditions and associated anomalies in plants // Acta biologica cracoviensia. Series Botanica, 2015. Vol. 57/2. P. 9-28. DOI: 10.1515/abcsb-2015-0026.
5. Adaptaciya rastenij-regenerantov s ispol'zova-niem gidroponiki / N.A. Vechernina [i dr.] //
Izvestiya Altajskogo gosudarstvennogo univer-siteta, 2008. № 3. S. 7-10.
6. Acclimatization of tissue cultured plantlets: from laboratory to land Acclimatization of tissue cultured plantlets: from laboratory to land / Sh. Chandra [et al.] // Biotechnol. Lett., 2010. Vol. 32. P. 1199-1205. DOI: 10.1007/s10529-010-0290-0.
7. Adaptaciya regenerantov Rhododendron hybri-dum k usloviyam ex vitro / A.A. 'Erst [i dr.] // Nauchnye vedomosti. 2012. № 9 (128). Vyp. 19. S. 44-48.
8. Zajceva Yu.G., Ambros E.V., Novikova T.I. Ukorenenie i adaptaciya regenerantov moro-zoustojchivyh predstavitelej roda Rhododen-
dron k usloviyam ex vitro // Turczaninowia, 2018. T. 21 (1). S. 144-152. DOI: 10.14258/ turczaninowia.21.1.13.
9. Krasinskaya T., Kukhartchyk N., Matushe-vich V. The effect of ion exchange substrate and succinic acid on ex vitro adaptation of the cherry rootstock VSL-2 (Prunus fruticosa Pall. x P. lannesiana Carr.) // Acta Horticulturae, 2008. Vol. 795. P. 401-408.
10. KuharchikN.V. Razmnozhenie plodovyh raste-nij v kul'ture in vitro. Minsk: Belaruskaya navu-ka, 2016. 208 s.
11. Perspektivnaya resursosberegayuschaya the-nologiya proizvodstva hmelya: metod. Reko-mendacii. M.: Rosinformagroteh, 2008. 52 s.
Статья принята к публикации 16.04.2024 / The article accepted for publication 16.04.2024. Информация об авторах:
Ольга Владимировна Бычкова1, старший научный сотрудник, кандидат сельскохозяйственных наук
Ольга Николаевна Мироненко2, ведущий научный сотрудник, кандидат биологических наук Анастасия Викторовна Небылица3, лаборант-исследователь Юлия Романовна Желонкина4, лаборант-исследователь Елена Павловна Мякишева5, младший научный сотрудник
Information about the authors:
Olga Vladimirovna Bychkova1, Senior Researcher, Candidate of Agricultural Sciences Olga Nikolaevna Mironenko2, Leading Researcher, Candidate of Biological Sciences Anastasia Viktorovna Nebylitsa3, Research Assistant Yulia Romanovna Zhelonkina4, Research Assistant Elena Pavlovna Myakisheva5, Junior Researcher
