CC BY
258
УДК 58.084
АДАПТАЦИЯ РЕГЕНЕРАНТОВ RHODODENDRON HYBRIDUM К УСЛОВИЯМ EX VTRO
АА. Эрст Т.И. Новикова А.В. Каракулов ЮГ. Зайцева
Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Россия, 630090, Новосибирск, ул. Золотодолинская, 101
E-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]
Показан эффективный способ адаптации растений-регенерантов Rhododendron hybridum hort. сорта Cunningham’s White к условиям ex vitro с использованием гидропонной установки. Применяемый двухстадийный способ адаптации обеспечивает хорошее развитие корневой системы реге-нерантов и их высокую приживаемость в почвенных субстратах.
Ключевые слова: Rhododendron hybridum, адаптация к условиям ex virto, гидропоника.
Введение
Адаптация растений-регенерантов к условиям ex vitro является самой критической стадией микроразмножения для многих видов растений. Проблемы на этом этапе напрямую связаны с целым рядом анатомических и физиологических особенностей листьев растений-регенерантов: 1) низкое количество кутикулярного воска и слабо развитая хлоренхима; 2) невысокая фотосинтетическая способность; 3) слабая деятельность устьичного аппарата приводит к потере большого количества воды и необратимому обезвоживанию растений-регенерантов [1]. Кроме того, у большинства регенерантов в условиях in vitro не происходит образования корней второго порядка и корневых волосков. Таким образом, формируется специфический «культуральный фенотип» растения [2]. Поэтому основной целью этапа адаптации регенерантов к условиям ex vitro является устранение названных «дефектов».
Процесс адаптации заключается в создании высокой влажности для надземной части растений с последующим ее понижением и подборе оптимальных условий для роста корней. Существенное число растений, выращенных in vitro, не выживают после перенесения их в нестерильные условия - вегетационные камеры и полевые условия. Такие условия имеют более низкие показатели влажности и освещенности, которые являются стрессом для растений. Кроме того, растения-регенеранты во время адаптации вынуждены переходить от миксотрофного к фотоавтотрофному способу питания.
Значительные усилия были приложены для оптимизации основных стадий микроразмножения, но процесс акклиматизации растений к нестерильным условиям, на данный момент изучен недостаточно. Следовательно, перенос растений в условия ex vitro является «узким местом» в процессе микроразмножения [1, 3].
Для адаптации рододендронов чаще всего используют теплицы, оранжереи или минитеплицы, где создается повышенная влажность. Создать условия для дальнейшего роста и развития не только надземной части, но и корневой системы удается за счет подбора субстратов. Используемые для рододендронов субстраты - перлит или торф - перлит в разных соотношениях [4, 5, 6], сфагновый мох [7], сфагновый мох : вермикулит [8], торф и песок : хвойная земля [9]. Схожие составы субстратов использованы и для адаптации других представителей семейства Ericaceae [10, 11, 12, 13]. Однако прямой перенос регенерантов в твердые субстраты может привести к потере материала, поскольку корни, сформировавшиеся в условиях in vitro, отличаются ломкостью и чувствительны к механическим повреждениям [14]. Использование гидропонных систем не только позволяет решить эту проблему, но и контролировать поступление необходимых питательных веществ и постепенное снижение относительной влажности [15].
Цель исследования - подобрать оптимальные условия для адаптации Rhododendron hybridum hort. сорта Cunningham’s White к условиям ex vitro c использованием гидропонной системы.
Объекты и методы исследования
Объект исследования - Rhododendron hybridum Hort. сорта Cunningham’s White. Культивирование in vitro проводили по описанной ранее методике [16]. Микропобеги укореняли на
безгормональной среде Андерсона [l7], с уменьшенным вдвое содержанием минеральных элементов, предварительно обрабатывая базальные части микропобегов раствором в-индолилмасляной кислоты (ИМК) 30 мг/л в течение 4 часов [9].
Адаптацию растений-регенерантов проводили на гидропонной установке, аналогичной системе «Минивит». Для этого растения отмывали от агара в дистиллированной воде и закрепляли в вегетационную кювету гидропонной установки. Период адаптации составил 20 суток. Гидропонную установку заполняли питательным раствором (30 л) по прописи V2 Андерсона, модифицированную по содержанию NaH2PO4 и NH4NO3.
Адаптированные на гидропонике растения высаживали в почвенный субстрат и выращивали в условиях теплицы.
Все эксперименты проводились в 2-з повторностях. Статистическая обработка результатов осуществлялась путем расчетов с использованием пакета статистического анализа приложения Microsoft Excel. В таблицах показаны средние арифметические величины и доверительные интервалы. Доверительность оцениваемых показателей принимали на уровне значимости Р<0.05 [іВ].
Результаты и их обсуждение
Эффективность использования гидропонных установок типа «Минивит-0,35» показана для земляники садовой, примулы пругоницкой, смородины золотистой, голубики топяной и др. [і9]. При этом установлено, что оптимальный рост растений достигается при использовании двухстадийной адаптации на гидропонике. Первые і0 суток использовали питательный раствор с увеличенной концентрацией фосфора, что обеспечивает рост корневой системы, последующие і0 суток - раствор с повышенным содержанием азота, что позволяет получить хорошо развитые побеги и листья. Для адаптации регенерантов Rhododendron hybridum мы использовали среду Андерсона, она богата фосфатами, поэтому на первом этапе адаптации применяли V2 Андерсона, оставив нередуцированной концентрацию NaH2PO4xH2O (380 мг/л) (раствор I). На втором этапе использовали также V2 Андерсона, но с полным содержанием NH4NO3 (400 мг/л) (раствор II) (табл. і).
Таблица і
Состав питательных сред, используемых для адаптации реге-нерантов Rhododendron hybridum Hort. сорта Cunningham’s
Первые 5-7 суток адаптации к условиям ex vitro создавали повышенную влажность, для этого растения накрывали прозрачной пленкой. Постепенное снижение влажности достигали за счет использования полиэтилена с перфорациями. Это позволило успешно пройти этап структурной перестройки листа (приобретение ксе-роморфной структуры, изменения в мезофилле листа) и избежать потерь рас-тений-регенерантов на заключительном этапе микроразмножения.
Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о закономерном увеличении всех параметров роста и развития регенерантов Rh. hybridum в период их адаптации (рис. 1а; 2). Интенсивно развивалась корневая система за счет роста уже имеющихся (в 1.5 раза), образования новых корней через 10 дней адаптации (в 1.3 раза) и развитию большого количества корней второго порядка. Побеги увеличились в длину в 1.4 раза.
White на гидропонной установке
Минеральные компоненты среды Андерсона Содержание минеральных компонентов в I растворе (і-і0 сутки адаптации), мг/л Содержание минеральных компонентов во II растворе (11-20 сутки адаптации), мг/л
NH4NO3 200 400
KNO3 240 240
CaCl2 X2H2O іВб 185
MgSO4 X7H2O 220 220
NaH2PO4xH2O 380 190
MnSO4 X4H2O 8.45 8.45
ZnSO4X7H2O 4.3 4-3
H3BO3 з.і 3.1
KI о.іб 0.15
CoCl2x6H2O о.оіз 0.013
CUSO4X5H2O о.оіз 0.013
Na2MoO4X2H2O 0.і2б 0.125
FeSO4X7H2O 27.85 27.85
Na2ЭДТАx2Н2О 37.25 37.25
Таблица 2
Характеристики развития регенерантов Rhododendron hybridum Hort. сорта Cunningham’s White до и после адаптации на гидропонной установке, n=20
Показатели роста и развития Перед адаптацией После адаптации Через б месяцев после адаптации
Высота растения, см 2.5±о.4 37±о.з 7.4±о.4
Количество корней, шт. 5.9±і.8 8.7±і.3 -
Средняя длина корней, мм і2.4±з.о і9.4±2.з -
Количество листьев, шт. 7.3±о.7 9.і±о.8 ll.2±l.l
Длина листа, мм 7.і±о.4 7.б±і.3 40.5±4.б
Ширина листа, мм 4.5±о.б 5.і±о.8 і8.б±2.і
Примечание: «-» - нет данных
Рис. 1. Внешний вид растений-регенерантов Rhododendron hybridum Hort. сорта Cunningham’s White на стадии адаптации к условиям ex vitro: а) до (слева) и после (справа) адаптации на гидропонной установке; б) через б месяцев после высадки в почвенный субстрат
Через 20 дней адаптации на гидропонной установке растения высаживали в почвенную смесь, состоящую из і/з верхового торфа, і/з дерновой земли и і/з органических материалов (хвойная земля, перепревшая сосновая кора). Растения содержали в условиях теплицы с октября по май. В целом хорошо развитая корневая система растений обеспечила их высокую приживаемость в почвенном субстрате. Замеры были сделаны через б месяцев. За этот период высота побега увеличилась более чем в 2 раза, заметно увеличился размер листовой пластинки. Лист приобрел вытянутую форму, длина его увеличилась в б раз, ширина в 3.5 раза (рис. іб).
Таким образом, использование гидропонной установки для адаптации растений-регенерантов Rh. hybridum оказалось эффективным на данном сложном, критическом этапе микроразмножения.
Рис. 2. Растения-регенеранты Rhododendron hybridum Hort. сорта Cunningham’s White во время адаптации на гидропонной установке
Способ адаптации с применением этой установки выгодно отличается от существующих способов по следующим показателям [20]:
- компактность установки в сочетании с возможностью одновременного выращивания до 1000 растений-регенерантов на площади 0.35 м2;
- универсальность установки, что позволяет адаптировать разные виды растений, причем одновременно;
- уменьшение трудоемкости процесса;
- 100% адаптация растений-регенерантов;
- высокая воспроизводимость полученных результатов.
Заключение
Таким образом, проведенные исследования показали, что двухстадийный прием адаптации растений-регенерантов Rhododendron hybridum hort. сорта Cunningham’s White к условиям выращивания ex vitro с использованием гидропонной установки характеризуется эффективностью и позволяет получать растения с хорошо развитой корневой системой. При этом первые 10 суток гидропонную установку заполняли раствором У2 Андерсона с полным составом NaH2PO4xH2O (380 мг/л), последующие 10 суток - У Андерсона с нередуцированным составом NH4NO3 (400 мг/л).
Список литературы
1. Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions / J. Pospisilova, I. Ticha, P. Kadlecek et al. // Biologia Plantarum. - 1999. - Vol. 42(2). - P. 481-497.
2. Гиголашвили Т.С., Родькин О.Н., Реуцкий В.Г. Условия микроклонирования формируют специфический культуральный фенотип // VII Междунар. Конф. «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда»: Тез. докл. - М., 1997. - С. 413.
3. Hazarika B.N. Acclimatization of tissue-cultured plants / / Current Science. - 2003. - Vol. 85, №12. -P. 1704-1712.
4. Doina C., Fira Al. Tissue culture and ex-vitro acclimation of Rhododendron sp. // Buletin USAMV-CN. - 2007. - Vol. 64, №1-2. - P. 39-43.
5. Almeida R., Goncalves S., Romano A. In vitro micropropagation of endangered Rhododendron ponti-cum L. subsp. baeticum (Boissier and Reuter) Handel-Mazzetti / / Biodiversity and Conservation. - 2005. -№14. - P. 1059-1069.
6. Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение рододендронов и их практическое использование. -Минск, 2009. - 188с.
7. Matysiak B. Effect of flight intensity on growth and chlorophyll fluorescence of Rhododendron microcuttings during acclimatization // Folia Horticulturae. - 2004. - Ann. 16/1. - P. 107-114.
8. Keith V.M., Brand M.H. Influence of culture age, cytokinin level and retyping on growth and incidence of brooming in micropropagated Rhododendrons // J. Environ. Hort. - 1995. - Vol. 13(2). - P. 72-77.
9. Васильева О.Г. Биолого-морфологические основы клонального микроразмножения некоторых представителей рода Rododendron L.: Автореф. диссер. ... к-та биол. наук. - 2009. - 20 с.
10. Protocol for micropropagation of Vaccinium vitis-idaea L. / A. Gajdosova, M.G. Ostrolucka, G. Libiakova, E. Ondruskova // Protocol for micropropagation of woody trees and fruits. - 2007. - P. 445-464.
11. Song G.-Q., Sink K.C. Blueberry (Vaccinium corymbosum L.) // Agrobacterium protocols. - 2006. -Vol. 2. - P. 264-272.
12. Evaluation of basal media for micropropagation of four highbush blueberry / T. Tetsumura, Y. Matsumoto, M. Sato et al. // Sci. Hortic. - 2008. - Vol. 119, №1. - P. 72-74.
13. Debnath S.C. In vitro culture of lowbush blueberry (Vaccinium angustifolium Ait.) // Proceedings of the ninth North American blueberry research and extension workers conference. - 2004. - Vol. 3, №1-2 and №3-4. - P. 393-407.
14. Supporting material influences the root growth and morphology of sweet potato plantlets cultured photoautotrophically / F.A. Zobayed, S.M. Zobayed, C. Kubota, T. Kozai // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. -1999. - Vol. 35. - P. 470-476.
15. In vitro regeneration and acclimatization of plants of Turmeric (Curcuma longa L.) in hydroponic system / E.V. Zapata, G.S. Morales, A.H. Lauzardo et al. // Biotechnologia Aplicada. - 2003. - Vol. 20. - P. 25-31.
16. Эрст А.А., Каракулов А.В. Размножение Rhododendron hybridum в культуре in vitro // Международная научно-практическая конференция, посвященная 100-летию со дня рождения З.И. Лучник «Декоративное садоводство Сибири. Проблемы и перспективы». - Барнаул, 2010. - С. 192-195.
17. Anderson W.S. Mass propagation by tissue culture: principls and techniques / / Proceedings of confer. On nursery production of fruit plants through tissue culture-applications and feasibility. - Maryland, 1980. - P. 1-10.
18. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М., 1990. - 352 с.
19. Адаптация растений-регенерантов с использованием гидропоники / Н.А. Вечернина, О.К. Таварткиладзе, И.Д. Бородулина, А.А. Эрст // Известия АлтГУ. - 2008. - №3 (55). - С. 7-10.
20. Вечернина Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений: монография. - Барнаул, 2004. - 205 с.
ADAPTATION OF REGENERANTS RHODODENDRON HYBRIDUM TO EX VITRO CONDITION
A.A. Erst
T.I. Novikova A.V. Karakulov Y.G. Zaytseva
The effective way of adaptation of regenerants Rhododendron hybridum Hort. Cunningham's White varieties to ex vitro conditions using hydroponic system is described. Two-stage process of the adaptation provides a well-developed root system regenerants and their high survival rate in soil substrates.
Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of RAS, Zolotodolinskaya St., 101, Novosibirsk, 630090, Russia
Key words: Rhododendron hybridum, adaptation ex vitro, hydroponics.
E-mail: [email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]
