CC BY
207
УДК 577.1 13.3 + 615.281.9
5'-Фосфонаты AZT: достижения и перспективы в лечении и профилактике ВИЧ-инфекции
А. Л. Хандажинская*, Е. А. Широкова
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 18.02.2013
РЕФЕРАТ AZT (Зидовудин, Ретровир), несмотря на его многочисленные недостатки, остается одним из ключевых препаратов, используемых для профилактики и терапии ВИЧ-инфекции как в виде монотерапии, так и в составе ВААРТ. Стратегия поиска новых эффективных и безопасных соединений, направленная на создание латентных форм (депо-форм) на основе AZT, принесла первые положительные результаты. Так, натриевая соль 5'-Н-фосфоната AZT (Никавир, фосфазид) показала клинические преимущества перед AZT, прежде всего значительно меньшую токсичность и лучшую переносимость. Никавир может эффективно использоваться для профилактики передачи ВИЧ от матери ребенку, а также в качестве альтернативного препарата при непереносимости Зидовудина. Доклинические испытания еще одного фосфоната, 5'-аминокарбонилфосфоната AZT, показали, что при его приеме происходит высвобождение AZT, причем фармакокинетические параметры AZT указывают на пролонгированность фармакологического действия. Анализ совокупности доклинических токсикологических и фармакологических данных позволил рекомендовать 5'-аминокарбонилфосфонат AZT для клинических исследований.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА терапия ВИЧ, депо-формы, 5'-фосфонаты AZT, Никавир, доклинические исследования.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОТ-ВИЧ - обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека; AZT -3'-азидо-3'-дезокситимидин; 3ТС - (-)-Р-Ь-2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин; L-FTC - (-)-Р-Ь-2',3'-дидезокси-3'-тиа-5-фторцитидин; ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия; LD50 - средняя летальная доза; AUC - площадь под кривой зависимости концентрации препарата в крови от времени; MRT - время удержания субстанции в тест-ткани; CL - общий клиренс; V - стационарный объем распределения; F -биодоступность.
ВВЕДЕНИЕ
В последней четверти прошлого столетия СПИД стал одной из главных угроз здоровью человека. Многолетние усилия ученых привели к созданию множества веществ с анти-ВИЧ-активностью, которые можно разделить на несколько групп: 1) нуклеозид-ные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транс-криптазы ВИЧ (ОТ-ВИЧ); 2) ингибиторы протеазы; 3) ингибиторы интегразы и 4) ингибиторы связывания и проникновения вируса в клетку. Самую многочисленную группу анти-ВИЧ-препаратов, применяемых в медицинской практике, представляют нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ), наиболее известные из которых - З'-азидо-З'-дезокситимидин (AZT, Зидовудин, Ретровир), (-)-Р-Ь-2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин (ЗТС, Ламиву-дин), (-)-Р-Ь-2',3'-дидезокси-3'-тиа-5-фторцитидин ^^ТС, Эмрицитабин), 2',3'-дидезоксиинозин (ddI, Диданозин) и др. [1]. Механизм действия этих ингибиторов включает внутриклеточное трифосфорилиро-
вание с последующим специфическим блокированием синтеза вирусной ДНК, катализируемого ОТ-ВИЧ. Однако все НИОТ имеют серьезные недостатки. Фармакокинетические свойства и низкая эффективность внутриклеточных превращений (например, только 0.3% AZT преобразуется в клетках в соответствующий трифосфат) обуславливают использование высоких доз препаратов, что, в свою очередь, приводит к росту токсичности. Кроме того, вследствие высокой изменчивости вируса происходит быстрое развитие вирусной резистентности [2, 3], что также снижает эффективность терапии.
Клинические последствия токсичности AZT включают многочисленные гематологические эффекты, подавление функционирования клеток костного мозга, заболевания печени, миопатии и др. [4, 5]. Из-за митохондриальной токсичности AZT больные СПИДом страдают от гиперлактатемии и липо-дистрофии [6, 7]. Быстрое выведение AZT требует ежедневного трехразового приема препарата. После
длительного курса AZT становится неэффективным из-за развития у вируса резистентности к нему [8, 9]. Тем не менее, несмотря на все побочные эффекты, AZT остается наиболее широко применяемым препаратом.
Используемые в настоящее время схемы комплексной лекарственной терапии (высокоактивная антиретровирусная терапия, ВААРТ) позволяют контролировать репликацию ВИЧ в большей степени, чем индивидуальные препараты, но и для них нужны новые эффективные и нетоксичные компоненты.
Один из способов увеличения эффективности антивирусного препарата состоит в синтезе депо-формы (латентной формы), т.е. такого производного, которое, подвергаясь химическим или ферментативным превращениям в организме, высвобождает активное соединение [10]. Создание депо-форм - это хороший способ снижения токсичности НИОТ за счет как улучшения фармакокинетических параметров, так и уменьшения сродства к митохондриальным белкам-транспортерам. Такой подход использовали во многих лабораториях мира при поиске новых анти-ВИЧ-агентов. Примерами успешного применения депо-форм НИОТ в практической медицине являются Виреад (Viread®, тенофовир дизопроксилфумарат) и Никавир (Nikavir®, натриевая соль 5'-Н-фосфоната AZT, фосфазид) [11, 12].
НИКАВИР (ФОСФАЗИД) - ПЕРВЫЙ УСПЕХ В СОЗДАНИИ ДЕПО-ФОРМ AZT
Никавир был лицензирован в Российской Федерации в 1999 году как препарат для лечения больных СПИДом и профилактики ВИЧ-инфекции [13-15]. Никавир получен в результате многолетних исследований по синтезу и изучению противовирусных агентов, проводимых под руководством А.А. Краевского в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгель-гардта РАН [16, 17]:
0 NaO-P-O
1
Н
1 =
N3
5'-Н-Фосфонат AZT синтезировали в 1989 году и проверили на клеточных культурах, инфицированных ВИЧ-1 [16], однако результаты тестов, проведенных в разных лабораториях, значительно отличались. Сначала сообщалось, что в культуре клеток MT-4 фосфазид 1 показал умеренную анти-ВИЧ-активность и более низкую токсичность, чем AZT
[18, 19], при этом его индекс селективности был выше, чем у AZT. Позже, однако, фосфазид проверили на трех различных клеточных линиях (МТ-4, CEM-SS и CEM-X 174) и обнаружили, что его активность была примерно на порядок меньше, чем у AZT [20]. В другой публикации [21] сообщалось, что в клеточных культурах С8 и JM анти-ВИЧ-активность соединения 1 была в 10-20 раз ниже, чем у AZT. Напротив, согласно [22], индексы селективности Н-фосфоната 1 были в 1.5 и 15 раз выше соответственно, чем у AZT (использовали штаммы IIIB и HXB2 ВИЧ в монону-клеарных клетках крови). Несмотря на эти противоречивые и несколько спорные данные, изучение фос-фазида было продолжено, что позволило выявить его преимущества перед AZT в опытах на лабораторных животных [23].
Фармакокинетические исследования фосфази-да показали его основное отличие от AZT: фармакокинетический профиль AZT после перорального приема фосфазида был существенно более плавным, чем при приеме самого AZT (С и t ~ 0.13 мг/л и
11 v max max '
2 - 2.5 ч соответственно против 1.2 мг/л и 0.5-0.8 ч у AZT). Меньшая пиковая концентрация AZT, наблюдаемая после приема фосфазида, не снижала противовирусную эффективность, но могла способствовать снижению токсичности. Это отличие проявилось в клинической практике, где наблюдали устойчивый положительный терапевтический эффект (снижение вирусной нагрузки, восстановление иммунитета и уменьшение опасности развития сопутствующих заболеваний). Фосфазид хорошо переносится взрослыми и детьми. В ходе лечения фосфазидом не было выявлено побочных эффектов, обычно наблюдавшихся при приеме AZT, таких, как рвота, тошнота, головная боль, диарея, миалгия, анемия, тромбоцитопения и нейтроцитопения [17].
Существенная терапевтическая эффективность и безопасность фосфазида отмечена у ВИЧ-инфицированных пациентов, получающих ВААРТ. Хорошо показали себя различные сочетания Никавира: с Диданозином и Невирапином [24], с Диданозином и Ритонавиром/Саквинавиром [25], с Ламивудином и Эфавиренцем или ингибитором протеазы (Атаза-навиром или Лопинавиром/Ритонавиром) [26] и др. Перечисленные схемы ВААРТ оказались более эффективными при сопутствующих заболеваниях -анемиях, хронических гепатитах В и С [27], циррозе печени и туберкулезе [28], чем схемы, включающие Ретровир или Комбивир. Безопасность Никавира при туберкулезе и заболеваниях печени вирусной этиологии является его существенным преимуществом, потому что большинство пациентов, зараженных ВИЧ, страдают от данных оппортунистических инфекций [27, 28].
Другое клиническое применение фосфазида - химиопрофилактика передачи ВИЧ от инфицированных женщин их детям во время беременности, родового и послеродового периодов. Фосфазид не влияет на течение беременности у ВИЧ-инфицированных женщин, на зрелость и жизнеспособность плодов. AZT из фосфазида эффективно проникает через плаценту, в результате чего в пуповине и крови матери поддерживаются его одинаковые концентрации. Использование Никавира во время беременности в сочетании с Ретровиром или Невирапином в родах и послеродовом периоде эффективно предотвращает вертикальную передачу ВИЧ [29, 30]. В некоторых случаях Ретровир был заменен на Никавир из-за низкого уровня гемоглобина в крови беременных женщин. Во всех случаях препарат хорошо переносился, а гематологические показатели восстанавливались.
Таким образом, низкая токсичность и хорошая переносимость фосфазида делают его привлекательным компонентом различных вариантов ВААРТ. Он может эффективно использоваться для профилактики передачи ВИЧ от матери ребенку, в терапии ВИЧ-инфекции, особенно при сопутствующем хроническом вирусном гепатите, а также для предотвращения заражения медперсонала. Неслучайно, в последней редакции Протоколов лечения больных ВИЧ-инфекцией [31] фосфазид рекомендован в качестве одного из компонентов предпочтительных схем антиретровирусной терапии первого ряда.
5 -АМИНОКАРБОНИЛФОСФОНАТЫ КАК НАПРАВЛЕНИЕ ДЛЯ ПОИСКА НОВЫХ ДЕПО-ФОРМ Агт
В продолжение работы по созданию фосфонатных депо-форм AZT были изучены соединения различного типа [32-37], но самой перспективной оказалась группа 5'-аминокарбонилфосфонатов AZT, замещенных по ПН-фрагменту различными функциональными группами (С6Н13, НОСН2СН2, Н2ПСН2СН2, Ме2ПСН2СН2, Ме3№СН2СН2, Ме, Н, С4Н9, PhСH2СH2) [38-40]:
О о
Противовирусные эксперименты в клетках МТ-4, зараженных ВИЧ, показали, что 5'-аминокарбонил-фосфонаты AZT ингибировали вирусную репликацию на порядок менее эффективно, чем AZT. В то же
время их токсичность, за исключением метиламид-ного производного, была значительно ниже, чем у AZT. Все синтезированные фосфонаты оказались устойчивыми в биологических жидкостях (сыворотка крови человека, цельная кровь собаки). Предварительная оценка фармакокинетических параметров после перорального приема собаками 5'-аминокар-бонилфосфонатов AZT показала, что все соединения могли метаболизироваться до AZT. Характер кривых зависимости концентрации высвобожденного AZT в плазме крови от времени был сходным у всех изученных амидов. Пиковые концентрации С AZT для фосфонатов, несущих по ПН-фрагменту остатки С6Н13, С4Н9, PhСH2СH2, а также незамещенного амида 2 составляли 2.0, 0.8, 0.9 и 3.7 мг/л соответственно. Таким образом, в пределах этой группы 5'-аминокар-бонилфосфонат AZT 2 был самым эффективным донором AZT. Это соединение изучено более подробно.
5'-АМИНОКАРБОНИЛФОСФОНАТ Агт
Эксперименты в клеточных культурах
Изучение противовирусной активности 5'-аминокар-бонилфосфоната AZT 2 на культуре лимфобластоид-ных клеток человека МТ-4 показало, что его противовирусная активность примерно на порядок уступает активности AZT и в 3-4.5 раза ниже, чем у фосфазида. Однако его токсичность снижалась в еще большей степени (в 34-50 и 12.5-15 раз соответственно), благодаря чему фосфонат 2 обладал более высоким химиотерапевтическим индексом, чем AZT и фосфазид [38-40].
Эффективность проникновения в клетки фос-фоната 2 была в 10-100 раз ниже, чем AZT, и приблизительно в 6 раз ниже, чем у фосфазида [23, 39]. Это позволяет предположить, что понижение анти-ВИЧ-активности и токсичности в культуре клеток МТ-4 по сравнению с показателями для AZT и фосфазида отражает уменьшение эффективности проникновения в клетки, т.е. существует прямая зависимость между проникновением фосфона-та 2, фосфазида и AZT в культивируемые клетки и противовирусными свойствами этих соединений. Необходимо отметить, что обе депо-формы достаточно стабильны при испытании в культуре клеток, в то время как в организме они эффективно превращаются в AZT [39].
Исследование стабильности
Стабильность фосфоната 2 в 100% сыворотке крови человека оказалась сопоставимой со стабильностью фосфазида: время полужизни ^1/2) обоих соединений превышает 6 ч [39]. В то же время в цельной крови собаки при 37°С фосфонат 2 был существенно более устойчивым, чем фосфазид (£ > 24 ч против 3 ч).
ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ПРИ ОДНОКРАТНОМ ВВЕДЕНИИ [41]
Беспородные собаки (средний вес 22 ± 3.4 кг)
В результате фармакокинетического изучения препарата 2 (капсулы № 2; 250, 500 и 1000 мг или 10, 20 и 40 мг/кг) установлено, что большая его часть мета-болизируется до фармакологически активного AZT. Фармакокинетические параметры высвобожденного AZT после однократного перорального приема собаками фосфоната 2 приведены в табл. 1.
Сравнение фосфоната 2 с AZT и фосфазидом (табл. 2) показало, что пиковая концентрация AZT при приеме фосфоната 2 в плазме была ниже, тогда как накопление AZT и время выведения были более длительными. Фармакокинетические параметры AZT, образующегося из фосфоната 2, были близки к параметрам фосфазида (С в 2.5 раза меньше, АиС в 2 раза меньше, но t и другие параметры больше). Максимальная концентрация AZT после пе-
рорального приема фосфоната 2 достигалась через 4 ч, что в 2 раза больше, чем при приеме AZT, и на 1 ч больше, чем у фосфазида (табл. 2).
Заслуживает внимания, что значения t1/2 и tmax AZT у собак увеличивались в следующем порядке: AZT < фосфазид < 5'-аминокарбонилфосфонат AZT, что позволяет рассматривать 5'-аминокарбонилфос-фонат AZT 2 как депо-форму AZT пролонгированного действия.
В плазме крови собак после внутривенного введения субстанции фосфоната 2 в дозе 50 мг (2-5 мг/кг веса тела) AZT не был зафиксирован. Фармакокинетические параметры исходного 2 составляли: AUCt = 2.19 мг-ч/л, t1/2 = 0.35 ч, MRT = 0.74 ч, CL = 16.8 л/ч, = 12.4 л.
Биодоступность 5'-аминокарбонилфосфоната 2 после перорального приема в использованных дозах составляла 4.7%, а биодоступность AZT после перорального приема 2-8%, что в 2 раза меньше, чем у фосфазида. Биодоступность AZT при пероральном
Таблица 1. Фармакокинетические параметры 5'-аминокарбонилфосфоната 2 и его основного метаболита AZT после однократного перорального приема собаками капсул 5'-аминокарбонилфосфоната 2 в дозах 10, 20 и 40 мг/кг массы тела
Доза 2, мг Тестируемое вещество Фармакокинетические параметры
C , max’ мг/л t , max’ ч AUC, мг-ч/л ч MRT, ч C /AUC, max' ’ 1/ч
10 2 0.31 ± 0.09 1.5 ± 0.25 0.47 ± 0.15 0.62 ± 0.1 2.43 ± 0.04 0.662 ± 0.066
AZT 0.36 ± 0.24 4.7 ± 1.0 2.87 ± 1.56 4.57 ± 1.46 8.90 ± 5.34 0.119 ± 0.033
20 2 0.51 ± 0.18 1.6 ± 0.2 0.98 ± 0.44 0.81 ± 0.2 2.65 ± 0.16 0.561 ± 0.122
AZT 0.69 ± 0.49 5.0 ± 1.7 6.0 ± 3.3 9.7 ± 4.3 12.0 ± 2.6 0.107 ± 0.023
40 2 0.51 ± 0.26 1.75 ± 0.27 1.25 ± 0.86 0.59 ± 0.2 2.87 ± 0.49 0.478 ± 0.117
AZT 0.98 ± 0.56 6.0 ± 1.3 10.4 ± 6.1 7.0 ± 2.5 12.2 ± 1.4 0.100 ± 0.016
Примечание. Здесь и в табл. 2 и 3: AUC( - площадь под кривой «концентрация-время»;
MRT - время удержания субстанции в тест-ткани; tmax - время достижения максимальной концентрации; Cmax - максимальная концентрация субстанции; /и - период полувыведения.
Таблица 2. Сравнение фармакокинетических параметров AZT после однократного перорального приема собаками 5'-аминокарбонилфосфоната AZT 2, фосфазида 1 или АZТ в дозах, эквивалентных 20 мг AZT/кг массы тела
Соединение C , max’ мг/л t , max’ ч AUCt, мг-ч/л ч MRT, ч CL, л/ч
2 0.74 ± 0.03 5 9.2 ± 0.2 9.6 ± 0.2 13.9 ± 0.2 27 ± 2.6
1 1.89±0.07 4 16.6 ± 0.3 7.2 ± 0.3 10.4 ± 0.5 15 ± 0.7
AZT 9.77 ± 0.3 2.5 58.8 ± 1.1 5.2 ± 0.5 7.5 ± 0.4 4.2 ± 0.3
приеме самого AZT была в 6 раз выше, чем в случае фосфоната 2. Однако высокое значение АиС при приеме AZT связано с избыточной пиковой концентрацией в плазме, которая очень быстро понижается. Это вызывает токсичность и быстрое появление штаммов вируса, устойчивых к воздействию препарата. Напротив, при приеме фосфоната 2 перепад между максимальной и минимальной концентрацией AZT в крови существенно менее выражен, что может способствовать снижению токсичности и замедлению возникновения резистентности.
Кролики породы шиншилла (средний вес 3 ± 0.4 кг) [41]
Изучение фармакокинетики фосфоната 2, водный раствор которого вводили в желудок кроликов, также подтвердило, что он является депо-формой AZT. AZT не найден в периферической крови кроликов (как и собак), которым фосфонат 2 вводили внутривенно, - единственным обнаруженным продуктом был исходный фосфонат 2 [17]. Это подтверждает гипотезу о том, что AZT образуется во время абсорбции исходного соединения [17].
Сравнение фармакокинетических параметров AZT и фосфоната 2 после однократного перораль-ного приема кроликами фосфоната 2 в дозах 7, 70 и 200 мг/кг веса показало, что AZT присутствовал в крови во всех случаях. При этом характер кривых «концентрация-время» и соотношения AZT и исходного 2 практически не менялись при изменении дозы [39].
Результаты сравнения фармакокинетических свойств AZT после перорального приема кроликами однократной дозы AZT, фосфазида 1 или фосфоната 2 приведены в табл. 3. Следует отметить, что форма кривой зависимости концентрации AZT, высвобожденного из фосфоната 2, была существенно более гладкой, величины С AZT, высвобожденного из фосфазида 1 или фосфоната 2, отличались только в 2 раза, а величины АиС обоих фосфонатов были довольно близкими.
Крысы линии Вистар и мыши линии BALB/c
При пероральном введении крысам (масса тела 200 ± 7 г) фосфоната 2 в дозе 20 мг/кг исходный фосфонат 2 в плазме крови не определялся. Доступным для определения был только его метаболит - AZT, имеющий следующие фармакокинетические параметры: AUC0_t = 2.27 мг-ч/л, MRT = 6.54 ч, tmax = 4 ч, Cmax = 0.4 мг/л, t = 2.45 ч и Cmax/AUCt = 0.176 ч-1.
При внутрибрюшинном введении крысам (масса тела 250 ± 10 г) фосфоната 2 в дозе 20 мг/кг, наоборот, в плазме определялся главным образом сам фосфонат 2 и следовые количества его метаболита AZT. Фармакокинетические параметры фосфоната 2 составляли: AUC0-t = 8.02 мг-ч/л, MRT = 0.82 ч, CL = 0.45 л/ч, t1/2 = 0.42 ч и Vss = 0.37 л. Заслуживает внимания тот факт, что после внутрибрюшинно-го введения мышам фосфоната 2 в дозе 6 г/кг веса в крови выявлен не только исходный фосфонат 2, но и 3.5% AZT.
Таким образом, 5'-аминокарбонилфосфонат AZT 2 высвобождает AZT после введения различными способами (перорально, внутрижелудочно или внутри-брюшинно) экспериментальным животным (мыши, крысы, кролики и собаки) в широком диапазоне доз (7-6000 мг/кг веса) [17]. Фармакокинетические параметры фосфоната 2 и высвобождаемого из него AZT различаются в плазме крови разных видов животных. Эти различия могут быть связаны с особенностями метаболизма у различных животных и/или со способами введения препарата.
Линейность фармакокинетики фосфоната 2 по его основному метаболиту AZT позволяет приблизительно рассчитать дозу для человека по результатам, полученным на животных. Так, при однократном пероральном приеме 600 мг фосфоната 2 можно ожидать, что концентрация AZT в плазме крови человека составит 100-115 нг/мл при достаточно пологой фармакокинетической кривой, что существенно превосходит минимальную концентрацию AZT при регулярном (трижды в день по 200 мг) пероральном приеме Зидовудина [42].
Таблица 3. Сравнение фармакокинетических параметров AZT после однократного перорального приема кроликами 5'-аминокарбонилфосфоната AZT 2, фосфазида 1 или АZТ в дозах, эквивалентных 200 мг AZT/кг массы тела
Соединение C , max’ t , max’ AUCt, t1/2 MRT, CL/F,
мг/л ч мг-ч/л ч ч л/ч
2 3.75 ± 0.01 3.5 25.12 ± 1.08 3.66 ± 0.74 4.72 ± 0.08 44.22 ± 1.95
1 7.38 ± 3.08 2.0 22.99 ± 10.17 1.42 ± 0.12 3.02 ± 0.12 54.95 ± 22.85
AZT 39.64 ± 4.24 1.0 88.5 ± 25.5 2.13 ± 0.71 2.10 ± 0.30 9.40 ± 2.70
фармакокинетические параметры при многократном введении
5'-АМИнОКАРБОнИЛФОСФОнАТА AZT [41]
Результаты многократного приема 5'-аминокарбо-нилфосфоната AZT также выглядят многообещающими.
Эксперименты на кроликах показали, что после курсового перорального введения (раствор - 1 г в 4-5 мл воды, прием через 6 и 18 ч в течение 5 дней) фосфоната 2 AZT постепенно накапливается в крови (рисунок). Кроме того, после последней дозы (96 ч после начала эксперимента) AZT детектировался в крови через 66 ч (162 ч от начала эксперимента) [17].
Собакам (средний вес 10.2 ± 1 кг) препарат 2 вводили перорально (600 мг натощак в течение 7 дней с интервалом 24 ч). AZT определялся в плазме на протяжении всего интервала между приемами фосфоната 2. Одинаковые значения С0 (0.17 ± 0.07 мг/л) и Стіп (0.17 ± 0.07 мг/л) на 7-й день курсового введения препарата говорят о достижении равновесного состояния. Значение квазистационарной концентрации составило 0.96 мг/л. Флуктуация уровней AZT в плазме в равновесной стадии (2.82 ± 0.26) была вполне приемлемой.
На 7-й день курсового перорального введения капсул фосфоната 2 отмечалось накопление AZT в организме собак, что выражалось в увеличении значений АиС (в 1.3 раза по сравнению с первым днем приема) и С . (в 1.7 раза по сравнению с первым днем), а также в удлинении t (с 2.7 до 4 ч) и возрастании С
^ шах ' ' 1 тах
(с 2.45 до 2.75 мг/л плазмы крови).
распределение В тканях [41]
Важный этап фармакокинетических исследований -изучение тканевой доступности новых лекарствен-
ных средств. В результате процессов распределения лекарственное средство транспортируется в зону действия, где оно взаимодействует со структурами, определяющими эффект препарата. Определение величины тканевой доступности позволяет количественно оценить интенсивность проникновения действующего вещества в периферические ткани и орган-мишень.
Распределение AZT, метаболита фосфоната 2, изучали в органах и тканях, отличавшихся степенью кровоснабжения, в органах, обеспечивающих выведение, и в органе - зоне потенциального действия. Были исследованы хорошо васкуляризированные (печень, почки, селезенка, легкие), умеренно васку-ляризированные (скелетные мышцы) и слабо васку-ляризированные ткани (брыжейка). AZT обнаружили во всех этих органах и тканях, причем его распределение по органам характеризовалось значительной гетерогенностью. Предел количественного определения составлял 10 нг/мл. После однократного перорального введения фосфоната 2 в дозе 100 мг/кг тела AZT определялся в плазме крови и органах крыс в течение 12 ч. При этом тканевая доступность AZT в сильно васкуляризированных органах (печень, селезенка, легкие, почки) была значительно выше, чем в скелетной мускулатуре и брыжейке.
Снижение концентрации AZT в основном носило монофазный характер. Полупериод выведения после перорального введения составил 3.9 ч (плазма крови).
После однократного перорального введения фос-фоната 2 в дозе 200 мг/кг исходное соединение не определялось в суточной моче и кале, что может быть обусловлено интенсивной биотрансформацией препарата на фазе всасывания. Обнаружен только
*
5
К
Г
та
а
н
I
ф
I
О
Высвобождение AZT после многократного приема фосфоната 2 кроликами
[17]
Время, ч
основной метаболит AZT, который выводится в незначительных количествах (4.11 и 0.04% соответственно от введенной дозы препарата).
ТОКСИЧнОСТЬ [41]
Результаты исследования токсичности на мышах подтвердили предположение о том, что медленное накопление в крови и более медленное выведение AZT, высвобожденного из фосфоната 2, по сравнению с AZT, введенным непосредственно и высвобожденным при введении фосфазида, может привести к уменьшению токсичности. Действительно, фосфо-нат 2 является малотоксичным препаратом, что подтверждается результатами опытов по определению острой токсичности (мыши линии BALB/c и крысы Вистар) и хронических экспериментов (крысы Ви-стар, беспородные собаки). Однократное введение препарата мышам и крысам в испытанных токсических дозах (2000-50000 мг/кг) сопровождалось кратковременным возбуждением животных, сменявшимся угнетенным состоянием, вялостью и адинамией. Средняя летальная доза (LD50) фосфоната 2 при вну-трибрюшинном введении мышам составила > 5 г/кг по сравнению с 1.5 и 2.3 г/кг для AZT и фосфазида соответственно. LD50 при однократном введении в желудок крысам превысила 40 г/кг.
Токсичность фосфоната 2 изучали в условиях хронического эксперимента на крысах, которым ежедневно в течение 3 мес. внутрижелудочно вводили этот препарат в дозе 133 и 266 мг/кг. Испытанные дозы препарата превышали высшую суточную терапевтическую дозу для человека в 10 и 20 раз (13.3 мг/кг веса). Оказалось, что соединение 2 в испытанных дозах хорошо переносится животными и не влияет на функциональное состояние основных органов и систем организма (по данным биохимических тестов), а также на гематологические показатели. Отсутствие токсических повреждений внутренних органов и местного раздражающего действия подтверждено при патоморфологическом исследовании, проведенном после окончания эксперимента.
Токсичность лекарственной формы фосфоната 2 (капсулы для приема внутрь по 200 мг) оценивали на собаках, которым в течение 4 нед. ежедневно внутрижелудочно вводили препарат в дозе 166 мг/кг (12.5-кратная высшая терапевтическая доза, рекомендованная для человека). Установлено, что данная лекарственная форма хорошо переносится животными и по данным биохимических тестов не влияет на функциональное состояние внутренних органов, а также на их гематологические показатели. Отсутствие токсических повреждений внутренних органов и местного раздражающего действия фосфоната 2 в виде капсул при длительном введении в желудок
собакам подтверждено результатами патоморфологических исследований.
Для оценки мутагенных свойств фосфоната 2 изучили его способность вызывать генные мутации в индикаторных штаммах Salmonella typhimurium в тесте Эймса, вызывать хромосомные аберрации в клетках костного мозга гибридных мышей F1(CBAxC57Bl6) и влиять на количество доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей. Показано, что фосфонат 2 в концентрации до 1 мг на чашку не вызывает статистически значимого увеличения числа ревертантов в тесте Эймса. В дозах, более чем в 50 раз превосходящих высшую терапевтическую дозу, рекомендованную для человека, фосфонат 2 не показал мутагенности в тестах in vivo: он не вызывал увеличения числа хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей и не влиял на количество доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей.
При ежедневном внутрижелудочном введении соединения 2 в дозе 133 мг/кг (10-кратная высшая терапевтическая доза, рекомендованная для человека) крысам Вистар (самцам в течение 10 нед., самкам -в течение 2 нед.) не установлено влияния препарата на репродуктивную функцию животных.
При ежедневном введении в желудок беременным крысам с 1 по 19 день гестации в дозе 133 мг/кг фосфонат 2 не влиял на увеличение массы тела беременных крыс, продолжительность беременности, количество желтых тел, мест имплантации, массу тела эмбрионов, их кранио-каудальный размер, показатели пред- и постимплантационной гибели плодов, а также постнатальное развитие крысят. Прием соединения 2 не вызывал каких-либо уродств или пороков развития эмбрионов, иными словами, оно не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием.
Аллергизирующие свойства фосфоната 2 были изучены на морских свинках. Установлено, что при 5-кратном внутрижелудочном введении препарата в сенсибилизирующих дозах, 133 и 266 мг/кг, и внутрижелудочном введении разрешающей дозы препарата 266 мг/кг на 14 и 21 день после сенсибилизации фосфонат 2 не вызывает анафилактического шока. Препарат в испытанных дозах и схемах сенсибилизации не проявляет аллергизирующего действия в реакции гиперчувствительности типа III у морских свинок. Кроме того, показано, что фосфонат 2 не влияет на реакцию подколенного лимфоузла у мышей.
В дозах 166 и 332 мг/кг (12.5- и 25-кратные высшие терапевтические дозы, рекомендованные для человека) фосфонат 2 не влияет на число ядросодержащих клеток в селезенке, а также на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. В наи-
большей из испытанных доз (332 мг/кг) фосфонат 2 несколько снижает первичный иммунный ответ у мышей F1(CBAxC57Bl6).
Таким образом, доказано, что 5'-аминокарбонил-фосфонат AZT 2 значительно менее токсичен, чем утвержденные лекарственные препараты Ретровир и Никавир, не обладает мутагенными и аллергизи-рующими свойствами, а также иммунотоксичностью, эмбриотоксичностью и тератогенностью, и не влияет на репродуктивную функцию животных.
заключение
Усилия многочисленных исследователей привели к тому, что были синтезированы более 100 новых потенциальных депо-форм, основанных на 5'-фос-фонатной модификации AZT, и проверена их анти-ВИЧ-активность. Никавир® является первым 5'-фосфонатом AZT, который стал использоваться в качестве анти-ВИЧ-препарата. В настоящее время закончены доклинические испытания еще одного фосфоната, 5'-аминокарбонилфосфоната AZT, и получены обнадеживающие результаты. Фармакокинетические исследования, проведенные на животных, показали, что при приеме внутрь фосфонат 2 в значительной степени превращается в AZT, причем
фармакокинетические параметры AZT указывают на пролонгацию его фармакологического действия.
Анализ совокупности доклинических токсикологических и фармакологических данных позволяет рекомендовать фосфонат 2 для клинических исследований. Фармакокинетические свойства этого соединения, по-видимому, позволят использовать созданный на его основе препарат раз в сутки, в отличие от Зидовудина, который применяется 2-3 раза в сутки. Из-за меньшей токсичности фосфонат 2 может применяться не только для профилактики вертикальной передачи ВИЧ, но также у детей и ВИЧ-инфицированных пациентов с нарушенной функцией печени.
Таким образом, 5'-аминокарбонилфосфонат AZT 2 имеет превосходный потенциал как альтернатива AZT и заслуживает дальнейшего исследования. •
Авторы благодарны М.К. Кухановой и С.Н. Кочеткову за полезные дискуссии и помощь в работе.
Работа поддержана РФФИ (грант № 12-04-00581) и Программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. De Clercq E. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. V. 1587. P 258275.
2. Groschel B., Cinatl J.H., Cinatl J., Jr. // Intervirology. 1997.
V. 40. P 400-407.
3. Antonelli G., Turriziani O., Verri A., Narcisco P, Ferri F., D'Offizi G., Dianzani F. // AIDS Res. Hum. Retrovir. 1996.
V. 12. P 223-228.
4. Chariot P., Drogou I., De Lacroix-Szmania I., Eliezer-Vanerot M.C., Chazaud B., Lombes A., Schaeffer A., Zafrani E.S. // J. Hepatol. 1999. V. 30. P. 156-160.
5. Gelmon K., Montaner J.S.G., Fanning M., Smith J.R.M., Falutz J., Tsoukas C., Gill J., Wells G., O'Shaughnessy M., Wainberg M., Ruedy J. // AIDS. 1989. V. 3. № 9. P 555-561.
6. Pan-Zhou X.-R., Cui L., Zhou X.-J., Sommadossi J.-P., Darley-Usmar V.M. // Antimicrob. Agents Chemother. 2000. V. 44. P. 496-503.
7. Chiao S.K., Romero D.L., Johnson D.E. // Curr. Opin. Drug Discov. Devc. 2009. V. 12. № 1. P. 53-60.
8. Kellam P., Boucher C.A., Larder B.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 1934-1938.
9. Ren J., Esnouf R.M., Hopkins A.L., Jones E.Y., Kirby I., Keeling J., Ross C.K., Larder B.A., Stuart D.I., Stammers D.K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9518-9523.
10. Stanczak A., Ferra A. // Pharmacol. Rept. 2006. V. 58. № 5.
P. 599-613.
11. Beaumont K., Webster R., Gardner I., Dack К. // Curr. Drug Metab. 2003. V. 4. № 6. P 461-485.
12. Calogeropoulou T., Detsi A., Lekkas E., Koufaki M. // Curr. Top. Med. Chem. 2003. V. 3. № 13. P l467-1495.
13. Khorlin A.A., Tarusova N.B., Dyatkina N.B., Kraevsky A.A.,
Bibilashvili R.Sh., Galegov G.A., Korneeva M.N., Nosik D.N., Maiorova S.N., Shobukhov V.M., Zhdanov V.V. 5'-Phosphonates of 2',3'-dideoxynucleosides. RF1548182, 1992; US5043437, 1991; EP0354246, 1994; Japan 0354246 Bl, 1995; Korean 106957, 1996.
14. Yurin O., Kravtchenko A., Serebrovskaya L., Golochvas-tova E., Burova N., Voronin E., Pokrovsky V. The phase 1 of the clinical trial of 'Phosphazid', the new reverse transcriptase inhibitor. 4th Intern. Congress on drug therapy in HIV-infection. Glasgow, UK, 1998. V. 12. № 4. P 240.
15. Юрин О.Г., Краевский А.А., Афонина Л.Ю., Балаганин В.А., Бурова Н.В., Воронин Е.Е., Колесник А.Н., Молодов И.Б., Мошкович Г.Ф., Покровский В.В. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. № 1. С. 43-45.
16. Тарусова Н.Б., Хорлин A.A., Краевский A.A. Корнилаева M.H., Носик Д.Н., Круглов Н.Б., Галегов Г.A., Бибилашвили Р.Ш. // Молекуляр. биология. 1989. T. 23. № 6. C. 1716-1724.
17. Khandazhinskaya A., Matyugina E., Shirokova E. // Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2010. V. 6. № 6. P. 1-14.
18. Krayevsky A.A., Tarussova N.B., Zhu Q.Y., Vidal P., Chou T.C., Baron P., Polsky B., Jiang X.J., Matulic-Adamic J., Rosenberg I., Watanabe K.A. // Nucleosides & Nucleotides. 1992. V. 11. № 2-4. P 177-196.
19. Tarussova N.B., Kukhanova M.K., Krayevsky A.A., Karamov E.V., Lukashov V.V., Kornyalaeva G.V., Rodina M.A., Galegov G.A. // Nucleosides & Nucleotides. 1991. V. 10. № 1-3. P 351-354.
20. Gosselin G., Perigaud C., Lefebvre I., Pompou A., Aubertin A.M., Kern A., Azabo T., Stawinski J., Imbach J.L. // Antiviral. Res. 1993. V. 22. № 2-3. P. 143-153.
21. McGuigan C., Bellevergue P., Jones B.C.N.M., Mahmood N., Hay A.J., Petrik J., Karpas A. // Antivir. Chem.
Chemother. 1994. V. 5. P. 271-277.
22. Machado J., Salomon H., Olivera M., Tsoukas C., Krayevsky A., Wainberg M. // Nucleosides & Nucleotides. 1999. V. 18. № 4-5. P. 901-906.
23. Skoblov Yu., Karpenko I., Shirokova E., Popov K., Andronova V., Galegov G., Kukhanova M. // Antiviral. Res. 2004. V. 63. № 2. P. 107-113.
24. Кравченко А.В., Саламов Г.Г., Богословская Е.Г., Сергиенко О.Г., Покровский В.В. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2001. № 4. С. 32-35.
25. Кравченко А.В., Ситдыкова Ю.Р., Серебровская Л.В., Богословская Е.В., Иванова Л.А., Покровский В.В. // Инфекционные болезни. 2003. Т. 1. № 1. С. 14-19.
26. Кравченко А.В., Канестри В.Г., Ганкина Н.Ю. // Инфекционные болезни. 2011. Т. 9. № 4. С. 64-69.
27. Ганкина Н.Ю., Кравченко А.В., Куимова У.А., Канестри В.Г. // Инфекционные болезни. 2010. Т. 8. № 1. С. 14-18.
28. Пантелеев А.М., Голиусова М.Ю., Кабанов В.И. // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессия. 2010. № 2. С. 75-79.
29. Иванова Э.С., Шмагель Н.Г, Воробьева Н.Н. // Вопр. вирусологии. 2010. Т. 55. № 2. С. 31-34.
30. Ivanova E.S., Shmagel N.G., Vorobyova N.N. // Nikavir in Chemoprevention Regimens of Vertical HIV Transmission / Ed. Fyson Hanania Kasenga, Publ.: InTech, DOI: 10.5772/24428.
31. Покровский В.В., Юрин О.Г., Кравченко А.В., Беляева В.В., Канестри В.Г., Афонина Л.Ю., Ермак Т.Н., Бурав-цова Е.В., Шахгильдян В.И., Козырина Н.В., Нарсия РС. и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. Приложение. 2012. № 6. С. 1-28.
32. Khandazhinskaya A.L., Shirokova E.A., Karpenko I.L., Zakirova N.F., Tarussova N.B., Krayevsky A.A. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2000. V. 19. № 10-12. P. 1795-1804.
33. Pokrovsky A.G., Pronyaeva T.R., Fedyuk N.V., Khandazhinskaya A.L., Shirokova E.A., Tarussova N.B., Karpenko I.L.,
Krayevsky A.A. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids.
2001. V. 20. № 4-7. P. 767-769.
34. Khandazhinskaya A.L., Shirokova E.A., Jasko M.V.,
Yanvarev D.V., Ivanov A.V., Pronyaeva T.R., Fedyuk N.V., Pokrovsky A.G., Kukhanova M.K. // Collection Symp. Ser.
2002. V. 5. P. 93-98.
35. Shirokova E.A., Jasko M.V., Khandazhinskaya A.L., Yanvarev D.V., Skoblov Y.S., Pronayeva T.R., Fedyuk N.V., Pokrovsky A.G., Kukhanova M.K. // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. 2003. V. 22. № 5-8. P. 981-985.
36. Shirokova E.A., Jasko M.V., Khandazhinskaya A.L., Ivanov A.V., Yanvarev D.V., Skoblov Yu.S., Mitkevich V.A., Bocharov E.V., Pronyaeva T.R., Fedyuk N.V., et al. // J. Med. Chem. 2004. V. 47. № 14. P. 3606-3614.
37. Куханова М.К. // Молекуляр. биология. 2012. Т. 46. № 6. C. 860-873.
38. Shirokova E.A., Khandazhinskaya A.L., Jasko M.V., Kukhanova M.K., Shipitsyn A.V., Pokrovsky A.G. Modified 5'-phos-phonate azidothymidine - potential anti-viral preparations.
US Pat. 7,999,099. EP1829885A1.
39. Khandazhinskaya A.L., Yanvarev D.V., Jasko M.V., Shipitzyn A.V., Khalizev V.A., Shram S.I., Skoblov Y.S., Shirokova E.A., Kukhanova M.K. // Drug Metab. Dispos. 2009. V. 37. № 3. P. 494-501.
40. Kukhanova M.K., Jasco M.V., Yanvarev D., Karpenko I., Shipitzyn A.V., Khandazhinskaya A.L. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf.). 2008. V. 52. P. 597-598.
41. Результаты доклинических испытаний представлены ЗАО «Производственно-коммерческая ассоциация АЗТ». Досье на регистрацию лекарственного препарата 6НР Вх.
№ 421549 от 23.12.2011.
42. Cato A. 3rd, Qian J., Hsu A., Levy B., Leonard J., Granneman R. // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. V. 42.
№ 7. P. 1788-1793.
