CC BY
101
© Коллектив авторов, 2019
Кузьмина У.Ш.1, Зайнуллина Л.Ф.1, Садовников С.В.1, Вахитов В.А.1, Бахтиярова К.З.2, Вахитова Ю.В.1
NMDA-рецепторы регулируют гены ключевых иммунных функций в лимфоцитах больных рассеянным склерозом
1 Институт биохимии и генетики - обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр РАН», 450054, Уфа, Россия
2 ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 450000, Уфа, Россия
Рассеянный склероз (РС) - аутоиммунное демиелинизирующее воспалительное заболевание центральной нервной системы. Помимо аутоиммунных механизмов, значительная роль в разрушении миелина, гибели нейронов и олигодендроцитов отводится нейромедиатору глутамату. Показано, что глутамат, продуцируемый активированными макрофагами и микроглией, посредством метабо- и ио-нотропных рецепторов запускает эксайтотоксические программы, что, как полагают, вносит вклад в формирование и поддержание нейродегенерации при РС. В последнее время стали появляться данные о том, что глутамат может выступать в роли иммуномодулятора, участвуя в контроле функций инфильтрованных в очаг воспаления Т-клеток. Кроме того, иммуномодуляция может осуществляться на уровне периферических Т-лимфоцитов при связывании глутамата с ионотропными рецепторами, в частности NMDA-подтипа. С целью установления роли NMDA-рецепторов в регуляции функций иммунокомпетентных клеток в данной работе проведен анализ экспрессионного профиля монону-клеаров, полученных из периферической крови пациентов с РС на фоне блокады NMDA-рецепторов с использованием коммерческого набора Human Signal Transduction Pathway Finder PCR Array. Показано, что действие антагониста NMDA-рецепторов (+)-МК801 в иммунных клетках, полученных от больных РС, приводит к изменению экспрессии генов, которые объединяются в 3 тесно взаимосвязанные и перекрывающиеся кластера: апоптоз, фосфорилирование, система цитокинов и хемокинов. Полученные данные позволяют предположить, что NMDA-рецепторы глутамата на уровне транс-криптома могут участвовать в модуляции ключевых функций мононуклеаров, а также в регуляции процессов хемотаксиса иммунных клеток у больных РС.
Ключевые слова: рассеянный склероз; NMDA-рецепторы; анализ транскриптома; мононуклеары периферической крови
Статья поступила 19.04.2018. Принята в печать 16.05.2018.
Для цитирования: Кузьмина УШ., Зайнуллина Л.Ф., Садовников С.В., Вахитов В.А., Бахтиярова К.З., Вахитова Ю.В. NMDA-рецепторы регулируют гены ключевых иммунных функций в лимфоцитах больных рассеянным склерозом. Иммунология. 2019; 40 (1): 27-34. doi: doi: 10.24411/0206-4952-2019-11003.
Финансирование. Работа выполнена в рамках госзадания Института биохимии и генетики - обособленного структурного подразделения ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр РАН» (№ АААА-А16-116020350033-8). Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Биомика» (Отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель», Уфа, Россия).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Kuzmina U.Sh.1, Zainullina L.F.1, Sadovnikov S.V.1, Vakhitov V.A.1, Bakhtiyarova K.Z.2, Vakhitova Yu.V.1
NMDA-receptors regulate the genes of key immune functions in lymphocytes of multiple sclerosis patients
1 Institute of Biochemistry and Genetics - Subdivizion of the Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Science, 450054, Ufa, Russia
2 Bashkir State Medical University, 450000, Ufa, Russia
Multiple sclerosis is an autoimmune demyelinating inflammatory disorder ofthe central nervous system. In addition to autoimmune mechanisms neurotransmitter glutamate plays a significant role in the destruction of myelin, oligodendrocyte and neuronal death. It was shown that glutamate produced by activated macrophages and microglia by ionotropic and metabotropic receptors mediates excitotoxic process which contributes to the formation and maintenance of neurodegeneration in MS. Recently the evidences were found that glutamate may act as an immunomodulator by control of functions of infiltrated T-cells in inflammation tissues. Furthermore, immunomodulation may be carried out by the glutamate ionotropic receptors, in particular the NMDA-subtype, at the level of peripheral T-lymphocytes. The aim of this
Для корреспонденции
Вахитова Юлия Венеровна -доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заведующая лабораторией молекулярной фармакологии и иммунологии Института биохимии и генетики -обособленное структурное подразделение ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр РАН», Уфа, Россия E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5022-0402
study was the investigation of the role of NMDA-receptors in the regulation of immunocompetent cells functions by the comparative analysis of the genes expression profile in peripheral blood mononuclear cells from multiple sclerosis patients using a commercial kit Human Signal Transduction Pathway Finder PCR Array. It has been shown that in peripheral blood mononuclear cells from multiple sclerosis patients the antagonist NMDA-receptors (+)-МК801 caused the alteration of expression of genes which are composed to the closely related and overlapping clusters of biological processes such as apoptosis, phosphorylation, cytokine and chemokine signaling. These data suggest that the NMDA-receptors could be involved in the modulation of some of the key functions of mononuclear cells, as well as in the regulation of chemotaxis of immune cells in patients with multiple sclerosis.
Keywords: multiple sclerosis; NMDA-receptors; transcriptome analysis; peripheral blood mononuclear cells
Received 19.04.2018. Accepted for publication 16.05.2018.
For citation: Kuzmina U.Sh., Zainullina L.F., Sadovnikov S.V., Vakhitov V.A., Bakhtiyarova K.Z., Vakhitova Yu.V. NMDA-receptors regulate the genes of key immune functions in lymphocytes of multiple sclerosis patients. Immunologiya. 2019; 40 (1): 27-34. doi: 10.24411/0206-4952-2019-11003. (in Russian)
Acknowledgments. The work is done in the framework of the state assignment OFITS IBG RAS (No. AAAA-A16-116020350033-8). The studies were performed using equipment of the center "Bionica" (Department of biochemical research methods and nanobiotechnology RCCP Agidel, Ufa).
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
For correspondence
Vakhitova Yulia V. -PhD, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Head of the Laboratory of Molecular Pharmacology and Immunology, Institute of Biochemistry and Genetics - Subdivizion of the Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Science, Ufa, Russia E-mail: [email protected] https://orcid.org/0000-0002-5022-0402
Введение
Рассеянный склероз (РС) - хроническое прогрессирующее аутоиммунное демиелинизирующее нейродеге-неративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС), поражающее преимущественно лиц молодого трудоспособного возраста и неизбежно ведущее к их инвалидизации. Существующие на сегодняшний день знания о РС позволяют рассматривать его патогенез как сложный многокомпонентный процесс, ведущую роль в котором играют аутоиммунные механизмы, обусловливающие развитие воспаления в ЦНС и последующую демиелинизацию нервных волокон, гибель нейронов и олигодендроцитов [1]. Согласно современным представлениям, нейродегенерация присутствует уже на ранних стадиях РС и может протекать параллельно с развитием воспаления и приводить к атрофии нервных волокон и нейронов, обусловливая нарастающую инвалидизацию больных [2]. Развитие нейродегенера-тивных процессов при РС (аксональной дегенерации и гибели нейронов) может быть обусловлено также продукцией иммунокомпетентными клетками крови и ЦНС таких токсичных молекул, как глутамат, активные формы кислорода и азота [3]. Глутамат, продуцирующийся в избытке различными клетками нервной и иммунной систем при РС, в настоящее время рассматривается в качестве одной из основных причин повреждения аксонов, нейронов и олигодендроцитов [4]. Имеющиеся литературные данные свидетельствуют об участии глутамата в механизмах нейровоспаления, осуществляемом, в том числе за счет регуляции функций как поступивших в мозг аутореактивных Т-клеток, так и периферических Т- лимфоцитов [5].
Посредством ионотропных рецепторов, главным образом КМБЛ-подтипа, глутамат запускает эксай-тотоксические программы, что, как полагают, вносит вклад в формирование и поддержание нейродегена-рации при РС [6]. Отметим, однако, что функциональное значение рецепторов глутамата в патогенезе РС практически не исследовано. По данным ряда
авторов, антагонисты ММЭЛ-рецепторов мемантин и (+)-МК801 снижают выраженность неврологических нарушений у животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (ЭАЭ), не препятствуя при этом развитию демиелинизации, однако уменьшают воспаление в ЦНС вследствие ограничения проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) для цитокинов и Т-лимфоцитов [7, 8]. В то же время антагонисты ЛМРЛ-рецепторов более эффективно, чем антагонисты КМБЛ-рецепторов, устраняют неврологический дефицит, но не оказывают влияния на развитие воспаления в ЦНС [9]. Кроме того, на модели ЭАЭ показано существование протективного иммунного механизма, опосредованного периферическими Т-клетками, направленного, как полагают, на снижение токсического действия глутамата в ЦНС [5].
К настоящему времени доказана экспрессия ионо-тропных рецепторов глутамата на поверхности Т-клеток человека, а также установлена их роль в регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток. Так, показано, что рецепторы глутамата участвуют в регуляции секреции цитокинов и механизмов дифференцировки субпопуляций СБ4+ Т-лимфоцитов, контроле клеточного цикла, пролиферации и апоптоза, изменений мембранного потенциала клеток, модуляции активности ионных каналов, экспрессии генов, усилении образования свободных радикалов, интегрин-опосредованной адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса [10, 11]. Важно отметить, что в настоящий момент в доступной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению роли КМБЛ-рецепторов, экс-прессированных на клетках иммунной системы, в функционировании Т-лимфоцитов больных с РС. С целью установления значения КМБЛ-рецепторов в регуляции функций иммунокомпетентных клеток в данной работе проведен сравнительный анализ экспрессионного профиля мононуклеаров периферической крови, полученных от пациентов с РС на фоне блокады КМБЛ-рецепторов.
Методы
Доноры. В исследование было включено 9 больных с достоверным диагнозом РС (ремиттирующий тип течения заболевания), согласно критериям, предложенным в [12]. Средний возраст доноров составил 38,5 ± 11,5 года. Выраженность неврологического дефицита у больных РС была определена врачом-неврологом на момент взятия крови на основе шкалы инвалидизации Куртцке в модификации Weiner и Elisson [13] Expanded Disability Status Scale (EDSS). Средний показатель по шкале EDSS составил 3,0 ± 1,2 балла (от 1 до 5 баллов), что говорит о преобладании числа пациентов с умеренной степенью инвалидизации. Ко времени забора крови у всех пациентов наблюдалась стадия ремиссии заболевания, подтвержденная неврологом, на основании клинического осмотра и заключений о результатах магнитно-резонансной томографии головного мозга. Все больные РС, участвующие в исследовании, получали иммуномодулирующую терапию препаратами интерферона ß-Ы. У всех доноров было получено письменное информированное согласие. Работа получила одобрение в Локальном этическом комитете при Институте биохимии и генетики - обособленном структурном подразделении ФГБНУ «Уфимский федеральный исследовательский центр РАН», Уфа, Россия.
Фракцию мононуклеаров выделяли из периферической венозной крови доноров - больных РС. Выделение клеток проводили по стандартной методике центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3) [14].
Клетки стимулировали через Т-клеточный рецептор моноклональными антителами (МКА) против CD3 ^CD3 МКА, 2,5 мкг/мл; клон OCT3, eBioscience, США) и CD28 (aCD28 МКА, 1,25 мкг/мл; клон CD28.2; BD Pharmingen, США) и культивировали в течение 4 ч (контрольная группа). Мононуклеары опытной группы инкубировали с неконкурентным антагонистом NMDA-рецепторов (+)-MK801 (100 мкМ; Tocris, США) 5 мин, далее клетки отмывали фосфатно-солевым буфером и стимулировали комплексом аCD3/CD28 также в течение 4 ч, после чего выделяли образцы тотальной РНК.
Анализ экспрессионного профиля генов, уровень мРНК которых регулируется NMDA-рецепторами, проводили с помощью коммерческого набора Human Signal Transduction Pathway Finder PCR Array (SABioscienses, США). Образцы тотальной РНК выделяли из 2-106 клеток с использованием экстрагирующего раствора TRI Reagent (MRC, США) в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя. Последующие выделение и очистку проводили с помощью коммерческого набора Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, США). Количество и качество выделенных образцов РНК контролировали с помощью спектрофотометра NanoDrop 3000 (Thermo Scientific, США), а также электрофорезом в 1% агарозном геле. кДНК получали из 2 мкг суммарной РНК реакцией обратной транскрипции с использованием 0,5 мкг oligo(dT)12-18-праймеров и 40 единиц активности обратной транскрип-тазы RevertAid™ Reverse Transcriptase (Thermo Scientific, США). Для проведения ПЦР в режиме реального вре-
мени использовали набор RT2 SYBR Green/Fluor qPCR Mastermix (SABioscienses, США) в соответствии с протоколом производителя на приборе iQ™5 Multicolor RealTime PCR Detection System (BioRad, США). Результаты GT-ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.4 (SABioscienses, США), доступного на сайте производителя (www. pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). После нормализации по положительным контролям [5 генов «домашнего xозяйства»: B2M (Beta-2-microglobulin), HPRT1 (Hypoxanthine phosphoribosyltransferase), RPL13A (Ribosomal protein L13a), GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), ACTB (Actin-beta)], были отобраны гены со статистически значимыми изменениями уровня мРНК. Гены, уровень транскриптов который изменялся не менее чем в 1,5 раза, далее верифицировали методом количественной GT-ПЦР в режиме реального времени (6 доноров - больнык РС) c использованием 2,5* реакционной смеси ПЦР-Микс («Синтол», Россия), содержащей интеркалирующий краситель SYBR Green I. Результаты GT-ПЦР нормализовали по уровню экспрессии гена «домашнего xозяйства» HPRT1. Изменения в уровняx мРНК генов рассчитывали с использованием значений пороговый циклов в специализированной программе REST Tool V 2.0.7 (Corbertt Research, CША).
Функциональный анализ in silico. Функциональный кластерный анализ групп дифференциально экспресси-рующжся генов (ДЭГ) проводили с помощью биоинформационной онлайн-программы DAVID [Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery; www. david.abcc.ncifcrf.gov]. Программа DAVID объединяет ряд биологически баз данный (BIOCARTA, KEGG, PANTHER, REACTOME), в который аккумулирована геномная, протеомная, xимическая, функциональная информация; она прежде всего предназначена для интерпретации данный геномного секвенирования и транскрипционного профилирования [15]. Для функционального анализа мы использовали следующие значения параметров кластеризации: высокая классификационная жесткость (High Classification Stringency), уровень обогащения EASE < 0,01. Алгоритм EASE (Expression Analysis Systematic Explorer) использует для определения значения /-модифицированный точный тест Фишера, который применяется для проверки нулевой гипотезы о том, что список генов содержит лишь случайное количество элементов, ассоциированный с конкретной функциональной категорией. Затем полученные уровни значимости p были скорректированы программой DAVID с поправкой на множественные сравнения Бенжамини-Хоxберга [16] и использованы для дальнейшей работы.
Результаты
Изменения транскриптома антиген-стимулиро-ванный клеток больнык РС, индуцированные воздействием антагониста NMDA-рецепторов (+)-МК801, анализировали с использованием коммерческого набора Human Signal Transduction Pathway Finder PCR Array,
Функциональная кластеризация дифференциально экспрессирующихся генов в мононуклеарах больных рассеянным склерозом при блокаде ЫМОЛ-рецепторов
Биологический процесс (коэффициент обогащения); ген/относительный уровень мРНК Термин генных онтологий (GO)
Апоптоз (5,68) БСЬ2Л1/0,21 ± 0,01 (р = 0,00) ЕЛБ/0,45 ± 0,11 (р = 0,04) ЛЛ/Р/0,39 ± 0,04 (р = 0,01) БЖС3/0,15 ± 0,02 (р = 0,03) CSF2/0,17 ± 0,02 (р = 0,02) I.12/0,34 ± 0,02 (р = 0,01) МУС/0,36 ± 0,03 (р = 0,01) С£КШБ/0,28±0,03 (р = 0,02) 0Л0045Л/0,20 ± 0,05 (р = 0,00) ИБР90ЛЛ2/0,26 ± 0,03 (р = 0,00) Антиапоптоз (00:0006916), р* = 1,14-Ю-4 Регуляция активации апоптоза (00:0042981), р* = 1,20-10-3 Регуляция программированной клеточной смерти (00:0043067), р* = 2,60-10-3 Регуляция клеточной смерти (00:0010941), р* = 6,59-Ю-4
Фосфорилирование (2,76) CSF2/0,17 ± 0,02 (р = 0,02) С.0КШБ/0,28 ± 0,03 (р = 0,02) ИЛ2/0,34 ± 0,02 (р = 0,01) ^БР3/0,29 ± 0,02 (р = 0,00) 0Л0045Л/0,20 ± 0,05 (р = 0,00) Негативная регуляция фосфорилирования (00:0042326), р* = 0,06 Негативная регуляция метаболизма фосфора (00:0010563), р* = 0,06 Негативная регуляция метаболизма фосфата (00:0045936), р* = 0,06
Система цитокинов и хемокинов (2,69) Ж?/0,45 ± 0,11 (р = 0,04) СС.20/0,30 ± 0,02 (р = 0,04) CSF2/0,17 ± 0,02 (р = 0,02) ^БР3/0,29 ± 0,02 (р = 0,00) ИЛ2/0,34 ± 0,02 (р = 0,01) ИЛ8/0,27 ± 0,06 (р = 0,01) Цитокин- и хемокин-опосредованный сигнальный путь (00:0019221), р* = 0,02 Цитокиновая активность (00:0005125), р* = 0,15; Экстраклеточное пространство (00:0005615), р* = 0,15 Взаимодействие «цитокин - цитокиновый рецептор» ^04060), р* = 0,08 Активация лейкоцитов (00:0045321), р* = 0,09 Клеточная активация (00:0001775), р* = 0,14
Дифференциально экспрессирующиеся гены, не вошедшие в кластеры FASN/0,15 i 0,02 (p = 0,00) PTCH1/0,31 i 0,03 (p = 0,03) ODC1/0,32 i 0,0б (p = 0,00) FOS/0,34 i 0,03 (p = 0,04) EN1/0,34 i 0,04 (p = 0,02) HOXA1/0,40 i 0,0б (p = 0,03) WISP1/5,06 i 0,95 (p = 0,04)
Примечание. Данные по экспрессии генов представлены в виде M ± SEM; p - достоверность различий уровня мРНК по сравнению с контрольной группой. GO - идентификатор функциональной категории (биологического процесса) по классификации базы данных Gene Ontology; hsa - код метаболического пути по классификации базы данных KEGG Pathway; p* - уровень значимости с поправкой на множественные сравнения Бенджамини-Хохберга, характеризующий правильность отнесения данного набора генов к определенному биологическому процессу [16]; коэффициент обогащения - среднее геометрическое значений p* членов в соответствующем аннотаци-онном кластере, обозначающее уровень биологической значимости данного функционального кластера.
содержащего иммобилизованные олигонуклеотиды для 84 генов. Сравнение экспрессионного профиля генов в экспериментальных группах «TCR-активированные лимфоциты доноров - больных РС + (+)-MK801» и «TCR-активированные лимфоциты доноров - больных РС» показало снижение уровня мРНК большинства генов (19 из 20), а увеличение экспрессии выявлено лишь для одного транскрипта (см. таблицу).
С использованием онлайн-ресурса DAVID проведена функциональная кластеризация групп дифференциально экспрессирующихся генов во фракции монону-клеаров при блокаде NMDA-рецепторов. Анализ групп генов, дифференциально экспрессирующихся в активи-
рованных иммунных клетках доноров - больных РС при действии антагониста NMDA-рецепторов, указывает на ассоциацию транскриптов с такими категориями клеточных процессов, как апоптоз, фосфорилирование, система цитокинов и хемокинов (см. таблицу). В этой экспериментальной группе отдельные гены (FASN, PTCHI, ODCI, FOS, ENI, HOXAI, WISPI) не распределены по категориям молекулярных функций. Подчеркнем, что продукты многих генов, изменивших экспрессию, могут участвовать в нескольких процессах, и для некоторых генов их функция в иммунокомпетентных клетках неизвестна.
Обсуждение
Результаты данной работы свидетельствуют о принадлежности генов, ответивших на действие антагониста NMDA-рецепторов в мононуклеарах больных РС, к таким биологическим процессам, как апоптоз (BCL2A1, FAS, NAIP, BIRC3, CSF2, ИЛ2, MYC, CDKN1B, GADD45A, HSP90AA2), фосфорилирование (CSF2, CDKN1B, ИЛ2, IGFBP3, GADD45A), система цитоки-нов и хемокинов (FAS, CCL20, CSF2, IGFBP3, ИЛ2, ИЛ8) (см. таблицу). Ранее нами было показано, что действие антагониста NMDA-рецепторов в Т-клетках, полученных от здоровых доноров, приводит к изменению экспрессии генов, которые объединяются в 4 тесно взаимосвязанных и перекрывающихся кластера: клеточная активация, апоптоз, клеточная пролиферация и дифференциация клеток [17], что свидетельствует о схожести паттернов биологических процессов, регулируемых данным подтипом рецепторов глутамата в Т-лимфоцитах здоровых лиц и больных РС.
В своей работе A.K. Kemppinen и соавт. [18] систематизировали результаты полногеномных исследований экспрессии генов в периферических иммунных клетках больных РС, полученные несколькими исследовательскими группами. Оказалось, что большинство дифференциально экспрессирующихся генов входят в функциональные кластеры, ассоциированные с цитокиновым сигналингом (ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-10, ИЛ-4, TNF1, ИЛ-2, ИЛ-15), глюкокортикоидными рецепторами, NF-kB-, p38-, PPARa/RXRa-, SAPK/JNK-, PI3K/AKT - регулируемыми сигнальными каскадами, механизмами онкогенеза и др. Аналогичное исследование, в котором проведен анализ агрегированных данных об экспрессионных профилях периферических иммунных клеток больных РС, показало участие большинства дифференциально экспрессирующихся генов в процессах воспаления, регуляции иммунных функций, апоптоза, адгезии лимфоцитов, сплайсинга РНК [19-21]. Отмечено также изменение экспрессии ряда генов, белковые продукты которых вовлечены в механизмы цитокинового и хемокинового сигна-линга [22, 23]. R. Bomprezzi и соавт. [24] наряду с генами, задействованными в контроле иммунных функций и межклеточных взаимодействий, отмечают также изменения уровней транскриптов, участвующих в контроле клеточного цикла. Согласно данным, полученным в результате анализа транскриптома лимфоцитов больных РС, > 80% выявленных генов относились к связанным с апоптотическими сигнальными путями, причем как про-, так и противоапопто-тическими, что отражает дисбаланс между устойчивостью и чувствительностью лимфоцитов к апоптозу при РС [25].
Анализ имеющихся в литературе сведений о генах и сигнальных путях, ответивших на блокаду антагонистом (+)-МК801, позволил предположить их вовлеченность в патогенез РС. Остановимся подробнее на некоторых из них.
Общеизвестно, что дисрегуляция программированной клеточной смерти, в частности за счет ослабления апоптоза активированных аутореактивных Т-клеток и, как следствие, недостаточной их элиминации, является важным звеном патогенеза аутоиммунных заболеваний [26]. У больных РС наблюдается снижение спонтанной гибели клеток, резистентность периферических Т-лимфоцитов к ^а^-опосредованному апоптозу, сочетающаяся с повышенной экспрессией антиапопто-тических белков, преимущественно принадлежащих к семейству Bcl-2, и подавлением экспрессии проа-поптотических белков (Bax и некоторых каспаз). Гены BIRC3 и NAIP кодируют белки - ингибиторы апоптоза BIRC3 (cIAP-2, HIAP-1) и NAIP (белок - ингибитор нейронального апоптоза) соответственно. Белок BIRC3 экспрессируется в лимфоцитах, его антиапоптотическая активность обусловлена непосредственным ингибиро-ванием каспаз 3, 7 и прокаспазы 9. Повышенная экспрессия BIRC3 в митоген-стимулированных Т-клетках больных с ремитирующим типом течения РС коррелирует с манифестацией заболевания и резистентностью Т-клеток к апоптозу [27]. В работе A.L. Hebb и соавт. [28] установлено увеличение уровня мРНК гена NAIP в Т-клетках больных ремиттирующим и первично-прогрессирующим типом течения заболевания, причем в случае оценки содержания мРНК этого гена в лимфоцитах больных, получающих патогенетическую терапию, авторы отмечали снижение данного параметра.
Выявленное нами снижение экспрессии некоторых антиапоптотических генов (BIRC3, NAIP, BCL2A1) в периферических иммунных клетках доноров - больных РС может быть одним из механизмов, способствующих увеличению чувствительности клеток к апоптозу при действии антагониста NMDA-рецепторов.
Ген CCL20 кодирует хемокин, являющийся лиган-дом хемокинового рецептора CCR6. Взаимодействие CCL20 со своим рецептором регулирует хемоаттракцию к эндотелию CCR6-экспрессирующих клеток, включая незрелые дендритные клетки, эффекторные T-клетки, в том числе Th17, T-клетки памяти и В-клетки [29]. Показано, что использование антител против CCL20 при ЭАЭ значительно снижало выраженность клинических проявлений и нейровоспаления [30]. Обнаружение повышенного уровня CCL20 в сыворотке пациентов с РС подчеркивает важную роль данного хемокина в патогенезе заболевания [31].
ИЛ-8 (CXCL8) - один из основных медиаторов воспалительного ответа, являющийся представителем семейства хемокинов CXC. ИЛ-8 индуцирует хемоаттракцию, миграцию и инфильтрацию нейтрофилов, моноцитов и Т-клеток к очагам воспаления, способствуя адгезии клеток крови к эндотелию сосудов [32]. В работе B.T. Lund и соавт. [33] установлено повышенное содержание CXCL8 в сыворотке больных РС, а также увеличение секреции ИЛ-8 CD14-шзитивными клетками периферической крови пациентов по сравнению со здоровыми донорами. Авторы полагают, что ИЛ-8 может опосредовать мобилизацию и последующую инфильтрацию моно-
цитов через ГЭБ и тем самым способствовать развитию воспаления в ЦНС. На моделях экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита животных показано, что блокада CXCR2 приводит к снижению инфильтрации полиморфно-ядерных лейкоцитов в ЦНС и меньшей выраженности патологических проявлений [34].
Полученные нами данные о подавлении экспрессии генов, кодирующих хемокины CCL20 и CXCL8 при действии (+)-МК801, могут свидетельствовать в пользу предположения о возможном протективном эффекте антагонистов NMDA-рецепторов в отношении одного из звеньев патогенеза РС.
Заключение
В данной работе мы провели исследование профиля мРНК генов, дифференциально экспрессирующихся в мононуклеарах больных РС при блокаде NMDA-рецепторов глутамата. Полученные результаты свидетельствуют о вовлечении ДЭГ, идентифицированных в иммунных клетках больных РС, в механизмы межклеточного взаимодействия, фосфорилирования и апоптоза. Это позволяет предположить, что NMDA-рецепторы глу-тамата на уровне транскриптома могут участвовать в мо-
■ Литература
1. Шмидт Т.Е., Яхно Н.Н. Рассеянный склероз : руководство для врачей. М. : МЕДпресс-информ, 2016.
2. Бойко А.Н., Петров С.В., Нестерова В.А., Гусев Е.И. Механизмы развития нейродегенеративного процесса при рассеянном склерозе - нейропротективное влияние препаратов бета-интерферона сегодня и нейротрофические факторы завтра. Журн. неврол. и психиатр. 2003; Спецвып. 2: 83-90.
3. Friese M.A., Schattling B., Fugger L. Mechanisms of neurodegeneration and axonal dysfunction in multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurol. 2014; 10: 225-38. doi: 10.1038/nrneurol.2014.37.
4. Levite M. Glutamate, T cells and multiple sclerosis. J. Neural Transm. (Vienna). 2017; 124: 775-98. doi: 10.1007/s00702-014-1167-5.
5. Schori H., Yoles E., Schwartz M. T-cell-based immunity counteracts the potential toxicity of glutamate in the central nervous system. J. Neuroimmunol. 2001; 119: 199-204.
6. Pitt D., Werner P., Raine C.S. Glutamate excitotoxicity in a model of multiple sclerosis. Nat. Med. 2000; 6: 67-70. doi: 10.1038/71555.
7. Paul C., Bolton C. Modulation of blood-brain barrier dysfunction and neurological deficits during acute experimental allergic encephalomyelitis by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist memantine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002; 302: 50-7.
8. Абдурасулова И.Н., Сердюк С.Е., Гмиро В.Е. Комбинированная блокада NMDA и GLUR1 AMPA рецепторов уменьшает тяжесть неврологических нарушений и длительность течения экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у крыс. Нейроиммунология. 2007; 1; 4-11.
9. Smith T., Groom A., Zhu B., Turski L. Autoimmune encephalomyelitis ameliorated by AMPA antagonists. Nat. Med. 2000; 6: 62-6. doi: 10.1371/journal.pone.0034933.
10. Зайнуллина Л.Ф., Ямиданов Р.С., Вахитов В.А., Вахитова Ю .В. NMDA-рецепторы - возможные компоненты депозависимо-го входа Ca2+ в T- лимфоциты человека. Биохимия. 2011; 76 (11): 1517-24.
11. Ganor Y., Levite M. The neurotransmitter glutamate and human T cells: glutamate receptors and glutamate-induced direct and potent effects on normal human T cells, cancerous human leukemia and
дуляции некоторых ключевых функций мононуклеаров, а также в регуляции процессов хемотаксиса иммунных клеток у больных РС. Ряд авторов подчеркивает необходимость изучения изменений в работе тех или иных генов в мононуклеарах периферической крови больных РС, поскольку они отражают интенсивность течения патологии и могут служить в качестве прогностических маркеров и, возможно, терапевтических мишеней [22].
Участие авторов. Кузьмина УШ. - сбор и обработка материала, проведение экспериментов, анализ полученных данных, написание текста; Зайнуллина Л.Ф. -проведение экспериментов, анализ полученных данных; Садовников С. В. - проведение экспериментов, анализ полученных данных; Вахитов В. А. - разработка концепции и дизайна исследования, написание текста, редактирование; Бахтиярова К.З. - медицинский осмотр и подбор пациентов для исследования, редактирование; Вахитова Ю.В. - разработка концепции и дизайна исследования, анализ полученных данных, написание текста, редактирование. Все авторы принимали участие в обсуждении результатов и утверждении окончательного варианта рукописи.
lymphoma T cells, and autoimmune human T cells. J. Neural Transm. (Vienna). 2014; 121 (8): 983-1006. doi: 10.1007/s00702-014-1167-5.
12. Thompson A.J., Banwell B.L., Barkhof F., Carroll W.M. et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurol. 2018; 17 (2): 162-73. doi: 10.1016/S1474-4422(17)30470-2.
13. Weiner H.L., Ellison H.L. A working protocol to be used as a guideline for trials in multiple sclerosis. Arch. Neurol. 1983; 40: 704-10.
14. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; 97: 77-89.
15. Huang W., Sherman B.T., Lempicki R.A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 2009; 4: 44-57. doi: 10.1038/nprot.2008.211.
16. Benjamini Y., Hochberg Y.J. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Stat. Soc. Ser. B Methodol. 1995; 57: 289-300.
17. Кузьмина У.Ш., Зайнуллина Л.Ф., Садовников С.В., Вахитов В. А. и др. NMDA-рецепторы регулируют гены ключевых иммунных функций в мононуклеарах периферической крови человека. Бюл. экспер. биол. 2018; 165 (2): 216-20.
18. Kemppinen A.K., Kaprio J., Palotie A., Saarela J. Systematic review of genome-wide expression studies in multiple sclerosis. BMJ Open. 2011; 1 (1). Article ID e000053.
19. Lindberg R.L., Kappos L. Transcriptional profiling of multiple sclerosis: towards improved diagnosis and treatment. Expert Rev. Mol. Diagn. 2006; 6: 843-55. doi: 10.1586/14737159.6.6.843.
20. Liu M., Hou X., Zhang P. Hao Y. et al. Microarray gene expression profiling analysis combined with bioinformatics in multiple sclerosis. Mol. Biol. Rep. 2013; 40: 3731-7. doi: 10.1007/s11033-012-2449-3.
21. Paraboschi E.M., Cardamone G., Rimoldi V., Gemmati D. et al. Meta-analysis of multiple sclerosis microarray data reveals dysregulation in RNA splicing regulatory genes. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16: 23 463-81. doi: 10.3390/ijms161023463.
22. Achiron A., Gurevich M., Friedman N., Kaminski N. et al. Blood transcriptional signatures of multiple sclerosis: unique gene expression of disease activity. Ann. Neurol. 2004; 55: 410-7. doi: 10.1002/ana.20008.
23. Iglesias A.H., Camelo S., Hwang D., Villanueva R. et al. Microarray detection of E2F pathway activation and other targets in multiple sclerosis peripheral blood mononuclear cells. J.Neuroimmunol. 2004; 150: 163-77. doi: 10.1016/j.jneuroim.2004.01.017.
24. Bomprezzi R., Ringnér M., Kim S., Bittner M.L. et al. Gene expression profile in multiple sclerosis patients and healthy controls: identifying pathways relevant to disease. Hum. Mol. Genet. 2003; 12: 2191-9. doi: 10.1093/hmg/ddg221.
25. Satoh J., Nakanishi M., Koike F., Miyake S. et al. Microarray analysis identifies an aberrant expression of apoptosis and DNA damage-regulatory genes in multiple sclerosis // Neurobiol. Dis. 2005; 18 (3): 537-50. doi: 10.1016/j.nbd.2004.10.007.
26. Macchi B., Marino-Merlo F., Nocentini U., Pisani V. et al. Role of inflammation and apoptosis in multiple sclerosis: comparative analysis between the periphery and the central nervous system. J. Neuroimmunol. 2015; 287: 80-7. doi: 10.1016/j.jneuroim.2015.08.016.
27. Sharief M.K., Semra Y.K. Upregulation of the inhibitor of apoptosis proteins in activated T lymphocytes from patients with multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 2001; 119; 350-7. doi: 10.1016/ S0165-5728(01)00365-4.
28. Hebb A.L., Moore C.S., Bhan V., Campbell T. et al. Expression of the inhibitor of apoptosis protein family in multiple sclerosis reveals a potential immunomodulatory role during
■ References
1. Shmidt T.E., Jahno N.N. Multiple sclerosis: a guide for doctors. 5th ed. Moscow: MEDpress-inform, 2016. (in Russian)
2. Boyko A.N., Petrov S.V., Nesterova V.A., Gusev E.I. Mechanisms of development of neurodegenerative processes in multiple sclerosis: neuroprotective influence of beta-interferons today and neurotrophic factors - tomorrow. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2003; (Spec No. 2): 83-90. (in Russian)
3. Friese M.A., Schattling B., Fugger L. Mechanisms of neurodegeneration and axonal dysfunction in multiple sclerosis. Nat. Rev. Neurol. 2014; 10: 225-38. doi: 10.1038/nrneurol.2014.37.
4. Levite M. Glutamate. T cells and multiple sclerosis. J. Neural Transm. (Vienna). 2017; 124: 775-98. doi: 10.1007/s00702-014-1167-5.
5. Schori H., Yoles E., Schwartz M. T-cell-based immunity counteracts the potential toxicity of glutamate in the central nervous system. J. Neuroimmunol. 2001; 119: 199-204.
6. Pitt D., Werner P., Raine C.S. Glutamate excitotoxicity in a model of multiple sclerosis. Nat. Med. 2000; 6: 67-70. doi: 10.1038/71555.
7. Paul C., Bolton C. Modulation of blood-brain barrier dysfunction and neurological deficits during acute experimental allergic encephalomyelitis by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist memantine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002; 302: 50-7.
8. Abdurasulova I.N., Serdyuk S.E., Gmiro V.E. The combined blockade of NMDA and GluR1 AMPA receptors decreases severity of neurologic disturbances and duration of the experimental allergic encephalomyelitis in rats. Neyroimmunologiya. 2007; (1): 4-11. (in Russian)
9. Smith T., Groom A., Zhu B., Turski L. Autoimmune encephalomyelitis ameliorated by AMPA antagonists. Nat. Med. 2000; 6: 62-6. doi: 10.1371/journal.pone.0034933.
10. Zainullina L.F., Jamidanov R.S., Vakhitov V.A., Vakhitova Yu.V. NMDA- receptors are possible components of the depot-dependent input of Ca2 + into human T-lymphocytes. Biokhimiya. 2011; 76 (11): 1517-24. (in Russian)
11. Ganor Y., Levite M. The neurotransmitter glutamate and human T cells: glutamate receptors and glutamate-induced direct and potent effects on normal human T cells, cancerous human leukemia and
autoimmune mediated demyelination. Mult. Scler. 2008; 14: 577-94. doi: 10.1177/1352458507087468.
29. Schutyser E., Struyf S., Van Damme J. The CC chemokine CCL20 and its receptor CCR6. Cytokine Growth Factor Rev. 2003; 14: 409-26.
30. Mony J.T., Khorooshi R., Owens T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front. Cell Neurosci. 2014; 8: 187. doi: 10.3389/fncel.2014.00187.
31. Jafarzadeh A., Bagherzadeh S., Ebrahimi H.A., Hajghani H. et al. Higher circulating levels of chemokine CCL20 in patients with multiple sclerosis: evaluation of the influences of chemokine gene polymorphism, gender, treatment and disease pattern. J. Mol. Neurosci. 2014; 53: 500-5. doi: 10.1007/s12031-013-0214-2.
32. Russo R.C., Garcia C.C., Teixeira M.M., Amaral F.A. The CXCL8/IL-8 chemokine family and its receptors in inflammatory diseases // Expert Rev. Clin. Immunol. 2014. Vol. 10, N 5. P. 593-619. doi: 10.1586/1744666X.2014.894886.
33. Lund B.T., Ashikian N., Ta H.Q., Chakryan Y. et al. Increased CXCL8 (IL-8) expression in multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 2004; 155 (1-2). 161-71. doi: 10.1016/j.jneuroim.2004.06.008.
34. Carlson T., Kroenke M., Rao P., Lane T.E. et al. The Th17-ELR1CXC chemokine pathway is essential for the development of central nervous system autoimmune disease. J. Exp. Med. 2008; 205; 811-23. doi: 10.1084/jem.20072404.
lymphoma T cells, and autoimmune human T cells. J. Neural Transm. (Vienna). 2014; 121 (8): 983-1006. doi: 10.1007/s00702-014-1167-5.
12. Thompson A.J., Banwell B.L., Barkhof F., Carroll W.M. et al. Diagnosis of multiple sclerosis: 2017 revisions of the McDonald criteria. Lancet Neurol. 2018; 17 (2): 162-73. doi: 10.1016/S1474-4422(17)30470-2.
13. Weiner H.L., Ellison H.L. A working protocol to be used as a guideline for trials in multiple sclerosis. Arch. Neurol. 1983; 40: 704-10.
14. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968; 97: 77-89.
15. Huang W., Sherman B.T., Lempicki R.A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protoc. 2009; 4: 44-57. doi: 10.1038/nprot.2008.211.
16. Benjamini Y., Hochberg Y.J. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Stat. Soc. Ser. B Methodol. 1995; 57: 289-300.
17. Kuzmina U.Sh., Zainullina L.F., Sadovnikov S.V., Vakhitov V.A. et al. NMDA- receptors regulates the genes of the key immune functions in human peripheral blood mononuclear cells. Byulleten' eksperimental'noi biologii i meditsiny. 2018; 165 (2): 216-20. (in Russian)
18. Kemppinen A.K., Kaprio J., Palotie A., Saarela J. Systematic review of genome-wide expression studies in multiple sclerosis. BMJ Open. 2011; 1 (1): e000053.
19. Lindberg R.L., Kappos L. Transcriptional profiling of multiple sclerosis: towards improved diagnosis and treatment. Expert Rev. Mol. Diagn. 2006; 6: 843-55. doi: 10.1586/14737159.6.6.843.
20. Liu M., Hou X., Zhang P. Hao Y. et al. Microarray gene expression profiling analysis combined with bioinformatics in multiple sclerosis. Mol. Biol. Rep. 2013; 40: 3731-7. doi: 10.1007/s11033-012-2449-3.
21. Paraboschi E.M., Cardamone G., Rimoldi V., Gemmati D. et al. Meta-analysis of multiple sclerosis microarray data reveals dysregulation in RNA splicing regulatory genes. Int. J. Mol. Sci. 2015; 16: 23 463-81. doi: 10.3390/ijms161023463.
22. Achiron A., Gurevich M., Friedman N., Kaminski N. et al. Blood transcriptional signatures of multiple sclerosis: unique gene expression of disease activity. Ann. Neurol. 2004; 55: 410-7. doi: 10.1002/ana.20008.
23. Iglesias A.H., Camelo S., Hwang D., Villanueva R. et al. Microarray detection of E2F pathway activation and other targets in multiple sclerosis peripheral blood mononuclear cells. J.Neuroimmunol. 2004; 150: 163-77. doi: 10.1016/j.jneuroim.2004.01.017.
24. Bomprezzi R., Ringnér M., Kim S., Bittner M.L. et al. Gene expression profile in multiple sclerosis patients and healthy controls: identifying pathways relevant to disease. Hum. Mol. Genet. 2003: 12: 2191-9. doi: 10.1093/hmg/ddg221.
25. Satoh J., Nakanishi M., Koike F., Miyake S. et al. Microarray analysis identifies an aberrant expression of apoptosis and DNA damage-regulatory genes in multiple sclerosis. Neurobiol Dis. 2005; 18 (3): 537-50. doi: 10.1016/j.nbd.2004.10.007.
26. Macchi B., Marino-Merlo F., Nocentini U., Pisani V. et al. Role of inflammation and apoptosis in multiple sclerosis: comparative analysis between the periphery and the central nervous system. J. Neuroimmunol. 2015; 287: 80-7. doi: 10.1016/j.jneuroim.2015.08.016.
27. Sharief M.K., Semra Y.K. Upregulation of the inhibitor of apoptosis proteins in activated T lymphocytes from patients with multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 2001; 119: 350-7. doi: 10.1016/ S0165-5728(01)00365-4.
28. Hebb A.L., Moore C.S., Bhan V., Campbell T. et al. Expression of the inhibitor of apoptosis protein family in multiple
sclerosis reveals a potential immunomodulatory role during autoimmune mediated demyelination. Mult. Scler. 2008; 14: 577-94. doi: 10.1177/1352458507087468.
29. Schutyser E., Struyf S., Van Damme J. The CC chemokine CCL20 and its receptor CCR6. Cytokine Growth Factor Rev. 2003; 14: 409-26.
30. Mony J.T., Khorooshi R., Owens T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 2014; 8: 187. doi: 10.3389/fncel.2014.00187.
31. Jafarzadeh A., Bagherzadeh S., Ebrahimi H.A., Hajghani H. et al. Higher circulating levels of chemokine CCL20 in patients with multiple sclerosis: evaluation of the influences of chemokine gene polymorphism, gender, treatment and disease pattern. J. Mol. Neurosci. 2014; 53: 500-5. doi: 10.1007/s12031-013-0214-2.
32. Russo R.C., Garcia C.C., Teixeira M.M., Amaral F.A. The CXCL8/IL-8 chemokine family and its receptors in inflammatory diseases. Expert Rev. Clin. Immunol. 2014; 10 (5): 593-619. doi: 10.1586/1744666X.2014.894886.
33. Lund B.T., Ashikian N., Ta H.Q., Chakryan Y. et al. Increased CXCL8 (IL-8) expression in multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 2004; 155 (1-2): 161-71. doi: 10.1016/j.jneuroim.2004.06.008.
34. Carlson T., Kroenke M., Rao P., Lane T.E. et al. The Th17-ELR1CXC chemokine pathway is essential for the development of central nervous system autoimmune disease. J. Exp. Med. 2008; 205: 811-23. doi: 10.1084/jem.20072404.
