CC BY
88
5. Toptygina A. P. The lymphoid follicles - the immune response zon. Immunologiya. 2012; 33 (3): 162-9. (in Russian)
6. Leon B., Ballesteros-Tato A., Browning J. L., Dunn R., Randall T. D., Lund F. E. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nat. Immunol. 2012; 13(7): 681-90.
7. Talayev V. Yu., Plekhanova M. V., Zaichenko I. E., Babaykina O. N. Effect of vaccines on the expression of chemokine receptors on dendritic cells of newborns and adults in vitro. Immunologiya. 2013; 34(6): 318-23. (in Russian)
8. Saeki H., Wu M. T., Olasz E., Hwang S. T. A migratory population of skin-derived dendritic cells expresses CXCR5, responds to B lymphocyte chemoattractant in vitro, and co-localizes to B cell zones in lymph nodes in vivo. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 2808-14.
9. Yu P., Wang Y., Chin R. K., Martinez-Pomares L., Gordon S., Kosco-Vibois M. H. et all. B cells control the migration of a subset of dendritic cells into B cell follicles via cxc chemokine ligand 13 in a lymphotoxin-dependent fashion. J. Immunol. 2002; 168: 5117-23.
10. Tew J. G., Wu J., Fakher M., Szakal A. K., Qin D.. Follicular dendritic cells: beyond the necessity of Tcell help. Trends Immunol. 2001; 22: 361-7.
11. Katakai T., Suto H., Sugai M. et al. Organizer-like reticular
stromal cell layer common to adult secondary lymphoid organs. J. Immunol. 2008; 181: 6189-200.
12. Allen C. D., Ansel K. M., Low C., Lesley R., Tamamura H., Fujii N., Cyster J. G. Germinal center dark and light zone organization is mediated by CXCR4 and CXCR5. Nat. Immunol. 2004; 5: 943-52.
13. Wang C., Hillsamer P., Kim C. H. Phenotype, effector function, and tissue localization of PD-1 - expressing human follicular helper T cell subsets. BMC Immunol. 2011; 12: 53.
14. Duraiswamy J., Ibegbu C. C., Masopust D., Miller J. D., Araki K., Doho G. H. et al. Phenotype, function, and gene expression profiles of programmed death-1 (hi) CD8 T cells in healthy human adults. J. Immunol. 2011; 186(7): 4200-12.
15. Mueller Y. M., Makar V., Bojczuk P. M., WitekJ., Katsikis P. D. IL-15 enhances the function and inhibits CD95/Fas-induced apoptosis of human CD4+ and CD8+ effector-memory T cells. Int. Immunol. 2003; 15: 49-58.
16. Ma C. S., Deenick E. K., Batten M„ Tangye S. G. The origins, function, and regulation of T follicular helper cells. J. Exp. Med. 2012; 209(7): 1241-53.
17. Talayev V. Yu. The regulatory mechanisms of myeloid dendritic cell and Langerhans cell migration. Immunologiya. 2012; 33(2): 104-12. (in Russian)
Received 09.10.14
регуляция иммунитета
© коллектив авторов, 2015 удк 616.832-004.2-092:612.017.1]-078.33
Кузьмина У. Ш.1, Зайнуллина Л. Ф.1, Бахтиярова К. З.2, Вахитова Ю. В.1
nmda-рeцeпt0ры регулируют продукцию ^-17 cd4+ и cd8+ ^клетками при рассеянном склерозе
1ФгБУН Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, 450054, г Уфа, Россия; 2гБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, 450000, г. Уфа, Россия
Исследовано влияние неконкурентного антагониста NMDA-рецептор (+) МК801 на функциональную активность CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов здоровых лиц и больных рассеянным склерозом (РС) по их способности продуцировать интерлейкин (IL)-17 в ответ на экзогенную стимуляцию форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) и иономицином, а также на экспрессию гена, кодирующего транскрипционный фактор RORyt. Показано, что в условиях in vitro блокада NMDA-рецепторов не сопровождается изменением CD4+- и CD8+-клеток периферической крови у пациентов с РС здоровых лиц. Соотношение содержания CD4+/CD8+ у больных РС не имело значимых различий по сравнению с таковым у здоровых лиц. Инкубация клеток с антагонистом NMDA-рецепторов в присутствии индукторов статистически достоверно снижает количество IL-17-секретирующих CD4+-клеток как у больных, так и у здоровых лиц, причем эффект блокады более выражен в отношении клеток, полученных от больных PC. Схожие закономерности показаны и для IL-17-продуцирующих CD8+-клеток. В целом отметим, что у больных РС IL-17-продуцирующие CD4+- и CD8+-лимфоциты более чувствительны к действию антагониста NMDA-рецепторов. Кроме того, эффект блокады NMDA-рецепторов оказался более выраженным в отношении содержания CD8+IL-17+-клеток в обеих обследуемых группах. Установлено, что NMDA-рецепторы участвуют в контроле синтеза IL-17 на уровне регуляции транскрипции гена, кодирующего транскрипционный фактор RORyt.
Ключевые слова; рассеянный склероз; глутамат; NMDA-рецепторы; IL-17; CD4+, CD8+ T-лимфоциты; RORyt.
Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(1): 13-18.
Для корреспонденции: Вахитова Юлия Венеровна, juvv73@gmail.com For correspondence: Vakhitova Yuliya Venerovna, juvv73@gmail.com
Kuzmina U. Sh.1, Zainullina L. F.1, Bakhtiyarova K. Z.2, Vakhitova Yu. V.1
NMDA RECEPTORS REGULATE PRODUCTION OF IL-17 AND CD4+ CD8+ T CELLS IN MULTIPLE SCLEROSIS
'Institute of Biochemistry and Genetics Ufa Science Centre of the Russian Academy of Sciences, 450054, Ufa, Russia; department of Neurology, Bashkir State Medical University, 450000, Ufa, Russia
This study was conducted to investigate in vitro the effects of non-competitive NMDA receptor antagonists (+)-MK801 on ability of peripheral CD4+ and CD8+ T-lymphocytes from healthy volunteers and patients with multiple sclerosis (MS) to produce IL-17 as well as on expression of a gene encoding a transcription factor RORyt. Peripheral blood mononuclear cells (PBMS) obtained from healthy donors (15) and patients suffer from multiple sclerosis (12) were incubated with phorbol-myristate-acetate (10 ng/ml) plus ionomycin (1 |jg/ml) with or without (+)-MK801 (100 |jM). Intracellular content of IL-17 in stimulated CD4+ and CD8+ lymphocytes was assayed 4 h later. Analysis of RORC mRNA level in PBMS was performed 2 h later. Blockade of NMDA receptors is not accompanied by changes in the number CD4+ and CD8+ cells of patients with multiple sclerosis and healthy individuals. No significant differences in ratio of CD4+/CD8+ were found between MS patients and healthy subjects. Incubation of the cells with antagonist of NMDA receptors in the presence of inductors significantly reduced the amount of IL-17 - producing CD4+ cells in MS patients and healthy donors. Furthermore the more pronounced effect of blockade was shown in cells derived from MS patients. Similar patterns are demonstrated for IL-17 - producing CD8+ cells. In general, IL-17 - producing CD4+ and CD8+ lymphocytes from MS patients were more sensitive to NMDA receptor antagonist comparing to control subjects. Moreover, the effect of blockade of NMDA receptors has been more conspicuous in CD8+IL-17+ cells in both groups. Subsequent experiments have shown that NMDA receptors are involved in the control of IL-17 synthesis at the level of transcriptional regulation of the gene encoding the transcription factor RORyt.
Key words: multiple sclerosis; glutamate; NMDA receptors; IL-17; CD4+, CD8+ T- lymphocytes; RORyt
Citation: Immunologiya. 2015; 36(1): 13-18.
Введение. Рассеянный склероз (РС) - аутоиммунное деми-елинизирующее заболевание ЦНС, характеризующееся очаговой демиелинизацией, воспалением, аксональной дегенерацией, активацией глиальных клеток и усиленной инфильтрацией периферических Т-клеток в мозг. В зависимости от стадии заболевания патогенез РС включает в разной степени как периферический аутоиммунный компонент, инициированный иммунными клетками в крови и лимфоузлах, так и центральный воспалительный компонент - в ЦНС. Гистопатологическими признаками заболевания считают очаговую инфильтрацию как СD4+, так и СD8+ Т-клеток совместно с другими воспалительными клетками в белом веществе и демиелинизацию с явлениями аксонального повреждения. Считается, что важную роль в иммунопатогенезе РС играет нарушение баланса различных субпопуляций аутореактивных эффекторных цитокинпроду-цирующих СD4+ (1Ъ)- и СD8+ (Тс)-лимфоцитов [1].
К настоящему времени установлена гетерогенность СD4+-и СD8+-клеток. Как известно, дифференцировка наивных Т-хелперов при их взаимодействии с антигеном и активации в зависимости от особенностей антигена и его концентрации, особенностей презентации антигена, характера цитокиново-го микроокружения и различных эндогенных модуляторов может осуществляться по пути формирования ТЫ-, №2-, ТЫ7-, Т^-, Т&-, №9-клеток секретирующих определенный паттерн цитокинов. Аналогично наивные СD8+-лимфоциты дифференцируются с образованием функционально различающихся пулов цитокинпродуцирующих (Тс1, Тс2, Тс17) клеток при взаимодействии антиген-презентирующих клеток с комплексом антигенный пептид - молекулы МНС I класса
[2]. Считается, что цитокинсекретирующие СD8+-клетки не обладают выраженной цитотоксической активностью вследствие довольно низкой экспрессии в них факторов цитолити-ческого комплекса - гранзима В, перфорина, Fas-лиганда и др.
[3]. В целом показана схожесть паттернов цитокинов, секре-тируемых ТЫ и Тс-клетками. В частности, Тс1-лимфоциты продуцируют преимущественно интерферон-у (ШИу) и опосредуют те же иммунологические реакции, что и ТЫ. Тс2-субпопуляция, как и №2, секретирует цитокины ГЬ-4, ГЬ-5 и ГЬ-10 и обеспечивает процессы протективного иммунитета. Тс17 ^8+ГЬ-17+)- и ТЫ7^4+ГЬ-17+)-лимфоциты, как полагают, участвуют в механизмах воспалительных и аутоиммунных реакций [4].
На данный момент интенсивно исследуют функциональную значимость той или иной субпопуляции ТЫ и Тс-клеток в инициации, формировании, прогрессии и ремиссии РС. Наряду с провоспалительными ТЫ - и Тс1-клетками, популя-
ции секретирующих ГЬ-17 лимфоцитов играют критическую роль в регуляции воспалительного аутоиммунного процесса в ЦНС. Убедительно показано, что несбалансированное преобладание ТЫ- и ТЫ7 клеток способствует развитию клеточных аутоиммунных процессов, составляющих основу иммунопатонегеза при РС. На модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) показано, что, продуцируя ГЬ-17 и ГЬ-22, Т-клетки повышают проницаемость гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), способствуя тем самым попаданию нейроантигенов на периферию, активации и пролиферации там миелинреактивных Т- и В-клеток и последующему проникновению этих клеток в ЦНС. ТЫ7-клетки благодаря экспрессии ряда белков, таких как СD146, ССR6 и СD6, обладают повышенной способностью к адгезии на эндотелии и миграции через ГЭБ по сравнению с таковой ТЫ-лимфоцитами [5]. Секретируемый ТЫ7- и Тс17-клетками провоспалительный цитокин ГЬ-17 индуцирует активацию матриксных металлопротеиназ ГЭБ и стимулирует мобилизацию нейтрофилов, моноцитов и макрофагов к очагу воспаления, что приводит впоследствии к повреждению миелина и аксонов. Кроме того, ГЬ-17 стимулирует продукцию других провоспалительных медиаторов (ГЬ-8, ГЬ-6, фактор некроза опухоли а (ТЫЬа), ГЬ-1В, МГР-2, МСР-1) фибробластами и клетками эндотелия сосудов [6]. В связи с этим отметим исследование М. НиЬег и соавт. [7], в котором показано, что ТС17-клетки в кооперации с СD4+-лимфоцитами вовлечены в индукцию ЭАЭ у животных. Кроме того, у больных РС на ранних стадиях заболевания обнаружено повышенное содержание ГЬ-17-продуцирующих cD8+-лимфоцитов в спинномозговой жидкости (СМЖ). Данный факт позволил авторам предположить участие этого типа клеток в инициации РС и усилении патогенного потенциала ТЫ7-лимфоцитов.
Среди факторов, способствующих повреждению нейронов, миелина и олигодендроцитов при РС, важную роль отводят возбуждающему нейромедиатору ЦНС - глутамату. В ряде исследований выявлено повышение уровня нейро-медиатора в плазме, СМЖ и мозге больных РС, зависимое от тяжести и характера течения болезни [8, 9]. С помощью магнитно-резонансной спектроскопии выявлено, что при РС уровень глутамата возрастает в острых очагах демиели-низации, а также в кажущемся нормальным веществе мозга [10]. Установлено, что в процессе воспалительного процесса в ЦНС глутамат, в избытке продуцируемый активированными макрофагами и микроглией, а также проникшими в мозг лейкоцитами, посредством ионотропных рецепторов, главным образом ММЭА-подтипа, запускает эксайтотоксические
Таблица 1
Общая характеристика больных рс и здоровых лиц
Показатель Больные РС Здоровые лица
п 12 15
В том числе:
мужчины 5 9
женщины 7 6
Возраст (годы) 39,7 ± 9,4 32,0 ± 6,8
Тип течения РС:
• ремитирующий 6
• первично-прогресирующий 2
• вторично-прогрессирующий 4
Продолжительность заболевания (с 6,4 ± 4,0
момента постановки диагноза; годы)
EDSS (по шкале Куртцке) 3,2 ± 0,8
Примечание. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка.
программы, что, как полагают, вносит вклад в формирование и поддержание нейродегенарации при PC [11]. В единичных на сегодняшний день работах представлены противоречивые сведения об эффектах лигандов локализованных в ЦНС рецепторов глутамата в индукции и развитии патологического процесса при PC и при моделировании данного заболевания у животных. На модели ЭАЭ показано, что эксайтотоксиче-ские эффекты глутамата, опосредуемые AMPA/каинатными и NMDA-рецепторами ЦНС, приводят к повреждению нейронов, миелина и олигодендроцитов. Отметим, однако, что функциональное значение тех или иных рецепторов глута-мата для патогенеза PC и ЭАЭ практически не исследовано. Имеющиеся литературные данные также свидетельствуют об участии глутамата в механизмах нейровоспаления, осуществляемом в том числе за счет регуляции функций как поступивших в мозг аутореактивных T-клеток, так и периферических T-лимфоцитов [12]. По данным ряда авторов, антагонисты NMDA-рецепторов мемантин и (+)-МК801 снижали выраженность неврологических нарушений у животных с ЭАЭ, не препятствуя при этом развитию демиелинизации, однако уменьшали воспаление в ЦНС вследствие ограничения проницаемости ГЭБ для цитокинов и T-лимфоцитов [13, 14]. Отметим, что антагонисты AMPA-рецепторов более эффективно, чем антагонисты NMDA-рецепторов устраняют неврологический дефицит, но не оказывают влияния на развитие воспаления в ЦНС [15]. Y. Ganor и соавт. [16] продемонстрировали, что блокада AMPA-рецепторов, экспрессирован-ных на аутореактивных энцефалитогенных T-лимфоцитах, предотвращала их активацию глутаматом, снижая тем самым патогенный потенциал клеток.
К настоящему времени показана экспрессия как метабо-тропных, так и ионотропных рецепторов глутамата на поверхности T-клеток человека и грызунов, а также определена их роль в регуляции ключевых функций иммунокомпетентных клеток. В частности, выявлено, что рецепторы глутамата вовлекаются в регуляцию секреции цитокинов, механизмы диф-ференцировки субпопуляций T-хелперов, контроль клеточного цикла, пролиферации и апоптоза, изменений мембранного потенциала клеток, модуляцию активности ионных каналов, экспрессии генов, усиления образования свободных радикалов, интегринопосредованной адгезии к гликопротеинам экстраклеточного матрикса [17]. Как уже отмечалось выше, на модели РС - ЭАЭ - животных было убедительно показано существование протективного иммунного механизма, опосредованного периферическими T-клетками, направленного, как полагают, на снижение токсического действия глутамата
в ЦНС [12]. С учетом известных фактов о вовлечении ЫМОА-рецепторов ЦНС в патогенез РС определенный интерес, на наш взгляд, представляет исследование вопроса о значении ЫМОА-рецепторов, экспрессированных на клетках иммунной системы, в функционировании циркулирующих на периферии Т-лимфоцитов. Целью данной работы стало изучение эффекта антагониста ЫМОА-рецепторов (+)-МК801 на содержание ]Ь-17-продуцирующих лимфоцитов с фенотипами СБ4+ и СБ8+ у здоровых лиц и больных РС.
Материалы и методы. Общая характеристика здоровых лиц. В исследовании принимали участие условно-здоровые лица (п = 15) и пациенты с достоверным диагнозом РС в стадии ремиссии (п = 12; табл. 1). Работа получила одобрение в Локальном этическом комитете при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Все здоровые лица дали информированное согласие на участие в исследованиях. Выделение лимфоцитов из периферической венозной крови проводили по стандартному протоколу градиентного центрифугирования в плотности фиколла (1077 г/см3) [18]. Моноциты элиминировали адгезией в 12-луночных планшетах в течение 24 ч при 370С в атмосфере 5% С02. Лимфоциты стимулировали ФМА (10 нг/мл) и иономицином (1 мкг/мл) в присутствии брефелдина А (10мкг/мл) (Tocris, США) в течение 4 ч для определения содержания внутриклеточного ГЬ-17, уровня экспрессии мРНК гена RORС в течение 2 ч. Для блокады ПМОА-рецепторов использовали неконкурентный антагонист (+)-МК801 (10-4 М; Тосм, США).
Фенотипирование популяций Т-лимфоцитов проводили путем окрашивания клеток моноклональными антителами (МКА) к СБ4 и СБ8, конъюгированными с флюоресцентными красителями - фикоэритрином (РЕ) и комплексом фикоэритрина и цианина (РЕ-Су5) соответственно, согласно протоколу фирмы-изготовителя (еВ^шепсе, США). Для внутриклеточного окрашивания ГЬ-17-лимфоциты затем фиксировали 1% параформальдегидом в течение 10 мин при 370С, пермеабилизировали 90% этанолом 30 мин при 40С и окрашивали МКА к ГЬ-17-РГТС и соответствующим изоти-пическим контролем (еВ^шепсе, США). Анализ образцов осуществляли на проточном цитофлюориметре Сytomics
Таблица 2
Показатели клеточного иммунитета при блокаде NMDA-рецепторов Т-лимфоцитов у здоровых лиц и больных рс
Показатель Контроль (+-)-MK801 ФМА/ионо-мицин ФМА/ионо- мицин + (+)-MK801
Здоровые лица (n = 15)
CD4+, % 48,8 47,3 45,3 44,2
(39,6-55,4) (39,1-53,6) (39,6-49,9)* (39,0-49,4)*
CD8+, % 29,5 30,0 31,0 31,2
(26,4-31,8) (26,8-33,3) (26,4-36,8) (26,3-37,2)
CD4+/CD8+ 1,7 1,6 1,5 1,4
(1,2-2,1) (1,2-2,0) (1,1-1,9) (1,1-1,8)
Больные РС (n = 12)
CD4+, % 48,1 48,7 45,2 43,5
(45,6-52,) (47,6-51,8) (37,8-50,9)* (37,0-49,5)*
CD8+, % 31,2 31,1 35,0 35,6
(30,4-34,9) (29,5-32,0) (31,6-37,7) (30,2-39,0)
CD4+/CD8+ 1,6 1,6 1,35 1,2
(1,3-1,7) (1,5-1,7) (1,0-1,6)* (1,0-1,6)*
Примечание. Данные представлены в процентах от общего количества лимфоцитов. Здесь и в табл. 3: данные представлены в виде Ме (10-90 процентили); * -р < 0,05 относительно показателей в контроле.
FC 500 (Beckman Coulter, США). Последующую обработку данных проводили в программе FCS Express 4.0 (De Novo Software, Канада). Результаты представлены в виде процента цитокинпродуцирующих CD4+ или СБ8+-клеток от общей популяции лимфоцитов.
Определение уровня мРНК гена RORC проводили методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, как было описано ранее [19]. Статистическую обработку результатов осуществляли в программе StatSoft (Statistica v6.1, США) с использованием методов непараметрической статистики: для сравнения двух независимых выборок (здоровые лица и больные PC) применяли критерий Манна-Уитни, для сравнения двух зависимых выборок (внутри экспериментальных групп) - критерий Вилкоксона. Различие показателей в группах считали статистически достоверным при p < 0,05. Результаты представлены в виде Me (10-90 процентили), где Me - медиана, в скобках указан 80% интерпроцентильный размах от 10 до 90%.
Результаты и обсуждение. В данной работе мы исследовали влияние блокады NMDA-рецепторов T-клеток на функциональную активность CD4+ и CD8+-лимфоцитов у здоровых лиц и больных РС по их способности продуцировать IL-17 в ответ на экзогенную стимуляцию ФМА и иономицином. Как известно, ФМА и иономицин поликлонально стимулируют T-клетки за счет активации зависимого от протеинкиназы C-сигнального каскада с последующей индукцией ряда Ca2+-регулируемых транскрипционных факторов и групп генов, кодирующих в том числе и гены цитокинов [20]. Как следует из данных табл. 2, фармакологическая стимуляция лимфоцитов in vitro существенно не изменяет картины распределения субпопуляций лимфоцитов по сравнению с таковым интакт-ных клеток, как у здоровых лиц, так и у больных PC. Отметим незначительное статистически достоверное (p < 0,05) снижение содержания CD4+ в обеих группах на фоне ФМА и ионо-мицина и некоторое увеличение количества CD8+ у больных PC. Блокада NMD-рецепторов неконкурентным антагонистом (+)-MK801 не сопровождается изменением количества CD4+- и CD8+-клеток периферической крови у пациентов с РС и здоровых лиц. При анализе соотношения уровня CD4+/ CD8+ выявили следующее. Базальное отношение содержания CD4+/CD8+ оказалось несколько выше у здоровых лиц, ИМ у больных PC (1,7 (1,2-2,1) и 1,6 (1,3-1,7) соответственно). Рецепторно-независимая активация лимфоцитов приводила к снижению соотношения содержания CD4+/CD8+ как у больных (1,35 (1-1,6)), так и у здоровых лиц (1,5 (1,1-1,9)), что, вероятнее всего, объясняется уменьшением мембранной экспрессии CD4 при действии ФМА и иономицина [21]. Блокада NMDA-рецепторов на фоне поликлональной стимуляции практически не оказывает влияния на данное соотношение в обеих группах. Отметим, что инкубация интактных клеток с (+)-MK801 также не сопровождается изменениями отношения содержания CD4+/CD8+.
Полученные нами сведения о соотношении содержания CD4+/CD8+ в периферических клетках у больных PC в стадии ремиссии согласуются с литературными данными. В ряде исследований у пациентов с РС отмечено более высокое значение этого соотношения в СМЖ (2,2-8,7), чем в периферической крови (от 1,3 до 2,6), что сопоставимо с отношением содержания CD4+/CD8+ у здоровых лиц. Полагают, что увеличение коэффициента CD4+/CD8+ в СМЖ у больных РС обусловлено усилением миграции CD8+-клеток с периферии в ЦНС [22, 23]. Отсутствие изменений соотношения содержания CD4+/CD8+ в обеих группах при блокаде NMDA-рецепторов, вероятно, свидетельствует о том, что при данных экспериментальных условиях антагонист (+)-MK801 не оказывает влияния на количество CD4+ и CD8+-клеток, полученных из периферической крови как у больных РС, так и у здоровых лиц.
На рисунке данные о влиянии блокады NMDA-рецепторов на содержание IL-17-продуцирующих клеток с фенотипами CD4+ (см. рисунок, а) и CD8+ (см. рисунок, б) у больных РС и здоровых лиц. Как видно (см. рисунок, а), в условиях стиму-
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
~~i— +
+ +
+
+ +
в
£.......
I I Здоровые лица Больные РС
Действие блокады NMDA-рецепторов на внутриклеточную продукцию ^-17 СD4+(a) и CD8+(б) Т-лимфоцитами здоровых лиц и больных РС (в %). * -р < 0,05.
По оси абсцисс: первая строка - ФМА/иономицин, вторая строка - (+) - МК801.
ляции ФМА и иономицином содержание СВ4+]Ъ-17+-клеток у здоровых лиц составляет 0,37 (0,27-0,47)%, а у пациентов с РС - 0,4 (0,21-0,59)%. Инкубация клеток с антагонистом ПМОА-рецепторов в присутствии индукторов статистически достоверно снижает количество ГЬ-17-секретирующих СБ4+-клеток как у больных с РС, так и у здоровых лиц, причем эффект блокады более выражен в отношении клеток, полученных от больных РС. Схожие закономерности показаны и для ГЬ-17-продуцирующих СБ8+-клеток (см. рисунок, б). Обращает внимание значительное негативное влияние антагониста ЫМОА-рецепторов на внутриклеточный синтез !Ь-17 СБ8+-лимфоцитами: у здоровых лиц значения данного показателя снижены более чем в 2 раза, тогда как у больных РС - почти в 3 раза. В целом отметим, что у больных РС ГЬ-17-продуцирующие СБ4+- и СБ8+-лимфоциты более чувствительны к действию антагониста ЫМОА-рецепторов. Кроме того, эффект блокады ЫМОА-рецепторов оказался более выражен в отношении содержания СБ8+ ГЬ-17-клеток в обеих обследуемых группах.
Накопленные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что ГЬ-17-продуцирующие клетки являются важными посредниками в патогенезе аутоиммунных заболеваний, в частности РС. Многими авторами показано повышение содержания ГЬ-17-секретирующих ТЫ7- и Тс17-клеток в периферической крови и СМЖ у больных с разным типом течения РС по сравнению с таковым у здоровых лиц. В отдельных работах выявлено, что повышение содержания ТЫ7-клеток в периферической крови предшествует клиническим проявлениям РС [24]. Отметим относительно новые исследования, в которых установлена роль субпопуляции СВ8+!Ь-17+-лимфоцитов: так, накопление клеток этого типа имеет место в активных очагах демиелинизации и ассоциируется с фазами обострения заболевания [25]. Кроме того, на
Влияние блокады NMDA-рецепторов на экспрессию гена ЯОЯС в Т-лимфоцитах у здоровых лиц и больных РС
Относительный уровень мРНК гена RORC
Группа контроль (+)-MK801 ФМА/ионо-мицин ФМА/иономицин + (+)-MK801
Здоровые лица (n = 15) 1,1 1,0 3,7 1,95
(0,7-1,2) (0,6-1,6) (2,6-4,4)* (0,6-3,0)**
Больные РС (n = 12) 1,0 0,8 1,2 0,61
(0,7-1,3) (0,6-1,5) (1,0-3,2) (0,4-2,0)**
Примечание. цин.
- p < 0,05 относительно показателей в группе ФМА/иономи-
модели ЭАЭ убедительно продемонстрирован вклад Tc17-клеток в инициацию патологического процесса, возможно, за счет кооперации с периферическими ТЫ7-клетками [7].
Как уже отмечалось выше, основная функция провос-палительного цитокина IL-17 состоит в вовлечении в воспалительную реакцию большого количества разных клеток за счет индукции экспрессии таких цитокинов, как IL-6, IL-8, IL-1ß, TNFa, провоспалительных факторов GM-CSF, G-CSF, а также хемокинов (СХС L1, СХС L10) и металлопротеиназ. Важную роль IL-17 играет в рекрутировании, активации и миграции нейтрофилов. ТЫ7-клетки повышают проницаемость ГЭБ, что далее сопровождается проникновением через него в ткань мозга T-клеток, сенсибилизированных к антигенам миелина, которые начинают локально пролиферировать, привлекать другие клетки крови (нейтрофилы, моноциты, макрофаги) и запускать эффекторные реакции, повреждающие миелин и аксоны [26]. Согласно существующим представлениям о патогенезе PC, инициация воспалительного процесса в ЦНС связана в определенной степени с событиями в периферическом компоненте иммунной системы [27]. Можно предположить, что уменьшение количества циркулирующих на периферии IL-17-продуцирующих клеток на фоне блокады NMDA-рецепторов лимфоцитов может приводить к снижению их миграции в ЦНС, ограничивая тем самым уровень воспалительных реакций, опосредуемых Th17- и Tc17-клетками.
С целью выяснения механизмов зависимого от блокады NMDA-рецепторов подавления внутриклеточной продукции IL-17 CD4+- и CD8+-клетками мы изучили влияние антагониста этого типа рецепторов глутамата на экспрессию гена RORC в культуре лимфоцитов, полученных от здоровых лиц и больных Pc. Как известно, дифференцировка Th17- и Тс17-клеток и контроль синтеза IL-17, помимо TGFß/IL-6-индуцированной экспрессии SMAD/STAT3 и ряда цитокинов (IL-1, IL-6, IL-23) в значительной мере определяется транскрипционным фактором RORyt [28]. Считается, что экспрессия гена RORC, кодирующего фактор транскрипции RORyt, обусловливает активность процесса направленной диффе-ренцировки Th17- и Тс17-субпопуляций и, соответственно, продукции IL-17. Как следует из данных, представленных в табл. 3, в условиях модели дифференцировки in vitro (кратковременная инкубация клеток с ФМА и иономицином) относительный уровень мРНК гена RORC существенно возрастает в лимфоцитах у здоровых лиц и несколько менее значимо - в лимфоцитах у больных PC по сравнению с таковым в интактных клетках. Инкубация клеток в присутствии антагониста NMDA-рецепторов сопровождается снижением уровня мРНК данного гена в обеих группах здоровых лиц почти в 2 раза. По литературным данным, уровень мРНК гена RORC позитивно коррелирует с активностью Th17, что показано при различных воспалительных заболеваниях [29]. Экспрессия гена, кодирующего IL-17 помимо RORyt зависит от активности ряда транскрипционных факторов, таких как STAT3,IRF4-BATF-JUN-комплекса, а также NFAT-AP1 [30]. Можно предположить, что снижение экспрессии гена RORC
Таблица 3 на фоне блокады NMDA-рецепторов является следствием подавления Са2+-зависимых сигнальных путей, активированных ФМА и иономицином.
Совокупность полученных нами данных указывает на участие NMDA-рецепторов в контроле синтеза IL-17 CD4+- и CD8+-клетками, осуществляемом, вероятно, на уровне регуляции транскрипции гена, кодирующего транскрипционный фактор RORyt, причем более выраженно данный эффект проявляется в отношении цитокинпродуцирующих клеток у больных РС. Таким образом, одним из механизмов протективного действия антагониста NMDA-рецепторов является его способность подавлять продукцию провоспалительного ци-токина IL-17, что может иметь практическое значение для лечения и профилактики РС и других демиели-низирующих заболеваний ЦНС.
Выводы. 1. Блокада NMDA-рецепторов T-лимфоцитов неконкурентным антагонистом (+)-MK801 in vitro не сопровождается изменением соотношения содержания CD4+/CD8+ у пациентов с PC и здоровых лиц.
2. Инкубация клеток с антагонистом NMDA-рецепторов в присутствии индукторов статистически достоверно снижает количество IL-17-секретирующих CD4+- и СБ8+-клеток как у больных РС, так и у здоровых лиц, причем эффект блокады более выражен в отношении клеток, полученных от больных PC.
3. Действие антагониста NMDA-рецепторов сопровождается снижением уровня мРНК гена RORC, кодирующего ключевой транскрипционный фактор дифференцировки Th17- и ^П-клеток, в обеих группах.
Исследования выполнены с использованием оборудования ЦКП «Биомика» (отделение биохимических методов исследований и нанобиотехнологии РЦКП «Агидель») и УНУ «КОДИНК». Работа поддержана грантом РФФИ № 15-0401441 и грантом Президента РФ для государственной поддержки ведущих научных школ РФ в 2014-2015 гг. (НШ -5923.2014.4).
ЛИТЕРАТУРА
9. Бархатова В. П., Завалишин И. А., Аскарова Л. Ш. и др. Изменения нейротрансмитгеров при рассеянном склерозе. Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. 1997; 5: 7-10.
14. Абдурасулова И. Н., Житнухин Ю. Л., Тарасова Е. А., Клименко В. М. Вовлечение NMDA рецепторов глутамата в патогенез экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ). Клиническая патофизиология. 2004; 1; 29-32. 19. Фаткуллина У. Ш., Зайнуллина Л. Ф., Бахтиярова К. З., Ва-хитова Ю. В. NMDA-рецепторы T-лимфоцитов регулируют синтез цитокинов у больных рассеянным склерозом. Иммунология. 2013; 34(6): 339-43. 27. Гусев Е. И., Завалишин И. А., Бойко А. Н., ред. Рассеянный склероз: Клиническое руководство. М.: Реал Тайм; 2011.
Поступила 28.05.14
REFERENCES
1. Zhu J., Yamane H., Paul W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations. Annu. Rev. Immunol. 2010; 28: 445-89.
2. van Stipdok M. J., Lemmens E. E., Schoenberger S. P. Na@ive CNLs require a single brief period of antigenic stimulation for clonal expansion and differentiation. Nat. Immunol. 2001; 2(5): 423-9.
3. Sandberg J. K., Fast N. M., Nixon D. F. Functional heterogeneity of cytokines and cytolytic effector molecules in human CD8+ T lymphocytes. J. Immunol. 2001; 167(1): 181-7.
4. Gravano D. M., Hoyer K. K. Promotion and prevention of autooimmune disease by CD8+ T cell. J. Autoimmun. 2013; 45: 68-79.
1/IMMyHOnon/m № 1, 2015
5. Brucklacher-Waldert V., Stuerner K., Kolster M., Wolthausen J., Tolosa E. Phenotypical and functional characterization of T helper 17 cells in multiple sclerosis. Brain. 2009; 132 (Pt 12): 3329-41.
6. Jadidi-Niaragh F., Mirshafiey A. Th 17 cell, the new player of neuroinflammatory process in multiple sclerosis. Scand. J. Immunol. 2011; 74(1): 1-13.
7. Huber M., Heink S., Pagenstecher A., Reinhard K., Ritter J., Visekruna A. et al. IL-17A secretion by CD8+ T cells supports Thl7-mediated autoimmune encephalomyelitis. J. Clin. Invest. 2013; 123: 247-60.
8. Stover J. F., Pleines U. E., Morganti-Kossmann M. C., Kossmann T., Lowitzsch K., Kempski O. S. Neurotransmitters in cerebrospinal fluid reflect pathological activity. Eur. J. Clin Invest. 1997; 27(12): 1038-43.
9. Barkhatova V. P., Zavalishin I. A., Askarova L. Sh. et al. Changes of neurotransmitters in multiple sclerosis. Zhurnal nevrologii i psikhiatrii im. S. S. Korsakova. 1997; 5: 7-10. (in Russian)
10. Srinivasan R., Sailasuta N., Hurd R., Nelson S., Pelletier D. Evidence of elevated glutamate in multiple sclerosis using magnetic resonance spectroscopy at 3 T. Brain. 2005; 128 (Pt 5): 1016-25.
11. Pitt D., Werner P., Raine C. S. Glutamate excitotoxicity in a model of multiple sclerosis. Nat. Med. 2000; 6 (1): 67-70.
12. Schori H., Yoles E., Schwartz M. T-cell-based immunity counteracts the potential toxicity of glutamate in the central nervous system. J. Neuroimmunol. 2001; 119(2): 199-204.
13. Paul C., Bolton C. Modulation of blood-brain barrier dysfunction and neurological deficits during acute experimental allergic en-cephalomyelitis by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist memantine. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002; 302(1): 50-7.
14. Abdurasulova I. N., Zhitnukhin Yu. L., Tarasova E. A., Klimenko V. M. Involvement of NMDA glutamate receptors in the pathogenesis of experimental allergic encephalomyelitis (EAE). Klin-icheskayapatofiziologiya. 2004; 1: 29-32. (in Russian)
15. Smith T., Groom A., Zhu B., Turski L. Autoimmune encepha-lomyelitis ameliorated by AMPA antagonists. Nat. Med. 2000; 6(1): 62-6.
16. Ganor Y., Besser M., Ben-Zakay N., Unger T., Levite M. Human T cells express a functional ionotropic glutamate receptor GluR3, and glutamate by itself triggers integrinmediated adhesion to laminin and flbronectin and chemotactic migration. J. Immunol. 2003; 170 (8): 4362-72.
17. Ganor Y., Levite M. The neurotransmitter glutamate and human T cells: glutamate receptors and glutamate-induced direct and potent effects on normal human T cells, cancerous human leu-
kemia and lymphoma T cells, and autoimmune human T cells. J. Neural. Transm. 2014 (in press).
18. Boyum A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Scand. J. Lab. Clin. Invest. 1968; 21: 77-89.
19. Fatkullina U. Sh., Zainullina L. F., Bakhtiyarova K. Z., Vakhi-tova Yu. V. NMDA-receptors are involved in regulation of cytok-ines production by T-lymphocytes of multiple sclerosis patients. Immunologiya. 2013; 34(6): 339-43 (in Russian)
20. Weiss A. T lymphocytes activation. In: Fundamental Immunology. 1998: 411-47.
21. Munck Petersen M., Christenen E. 1., Andresen B. S., Moller B. K. Internalization, lysosomal degradation and new synthesis of surfacemembrane CD4 phorbol ester-activated T-lymphocytes and U937 cells. Exp. Cell Res. 1992; 201: 160-73.
22. Scolozzi R., Boccafogli A., Tola M. R., Vicentini L., Camerani A., Degani D. et al. T-cell phenotypic profiles in the cerebrospi-nal fluid and peripheral blood of multiple sclerosis patients. J. Neurol. Sci. 1992; 108(1): 93-8.
23. Stuve O., Marra C. M., Bar-Or A., Niino M., Cravens P. D., Ce-pok S. et al. Altered CD4+/CD8+ T-cell ratios in cerebrospinal fluid of natalizumab-treated patients with multiple sclerosis. Arch. Neurol. 2006; 63(10): 1383-7.
24. Hofstetter H., Gold R., Hartung H. P. Th17 cells in MS and experimental autoimmune encephalomyelitis. Int. MS J. 2009; 16(1): 12-8.
25. Tzartos J. S., Friese M. A., Craner M. J., Palace J., Newcombe J., Esiri M. M., Fugger L. Interleukin-17 production in central nervous system-infiltrating T ceils and glial cells is associated with active disease in multiple sclerosis. Am. J. Pathol. 2008; 172(1): 146-55.
26. Segal B. M. Th17 cells in autoimmune demyelinating disease. Semin. Immunopathol. 2010; 32(1): 71-7.
27. Gusev E. I., Zavalishin I. A., Boyko A. N., eds. Multiple Sclerosis: Clinical Guidance [Rasseyannyy skleroz: Klinicheskoye rukovodstvo]. Moscow: Real Taym; 2011. (in Russian)
28. Miossec P., Korn T., Kuchroo V. K. Interleukin-17 and type 17 helper T cells. N. Engl. J. Med. 2009; 361(9): 888-98.
29. Drulovic J., Savic E., Pekmezovic T., Mesaros S., Stojsavljevic N., Dujmovic-Basuroski I. Expression of Th1 and Th17 cytok-ines and transcription factors in multiple sclerosis patients: does baseline T-bet mRNA predict the response to interferon-beta treatment? J. Neuroimmunol. 2009; 215(1-2): 90-5.
30. Basu R., Hatton R. D., Weaver C. T. The Th17 family: flexibility follows function. Immunol. Rev. 2013; 252(1): 89-103.
Received 28.05.14
