CC BY
32
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
УДК 616.132.2-089.819.5-018.1-092:612.017.1
Сизякина Л.П.1, Шлык И.Ф.2, Сидоров Р.В.1, Шлык С.В.1
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ВРОЖДЁННОГО ИММУНИТЕТА У ПАЦИЕНТОВ, ПЕРЕНЕСШИХ КОРОНАРНОЕ СТЕНТИРОВАНИЕ
1 ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, 344022, Ростов-на-Дону, Россия;
2 ГБУ РО «Ростовская областная клиническая больница», 344015, Ростов-на-Дону, Россия
Одним из методов лечения ишемической болезни сердца является коронарное стентирование. При имплантации коронарного стента происходит повреждение интимы сосуда, что приводит к активации врождённого иммунного ответа. Целью настоящей работы явилось изучение клеточного звена врождённого иммунитета у пациентов с ишемической болезнью сердца до операции коронарного стентирования и послеоперационный период. В результате исследования до проведения коронарного стентирования выявлено повышение экспрессии TLR 2 и TLR 9, увеличение количества и снижение цитотоксичности CD16+-лимфоцитов, снижение микробицидного потенциала нейтрофилов. После проведения коронарного стентирования отмечено снижение экпрессии на моноцитах CD284 и CD289, снижение количества и увеличение цитотоксической активности CD16+-клеток. Таким образом, пациентам, которым выполнено коронарное стентирование, необходима оценка клеточного звена врождённого иммунитета как до операции, так и после неё.
Ключевые слова: коронарное стентирование; врождённый иммунитет; Толл-подобныерецепторы. Для цитирования: Сизякина Л.П., Шлык И.Ф., Сидоров Р.В., Шлык С.В. Характеристика клеточного звена врождённого иммунитета у пациентов, перенесших коронарное стентирование. Иммунология. 2018; 39(1): 16-19. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-16-19
Sizyakina L.P.1, Shlyk IF.2, Sidorov R.V.1, Shlyk S.V.1
CHARACTERISTICS OF THE CELLULAR LINK OF INNATE IMMUNITY IN PATIENTS UNDERGOING CORONARY STENTING
1 «Rostov State Medical University», 344022, Rostov-on-Don, Russia;
2 «Rostov Regional Hospital», 344015, Rostov-on-Don, Russia
One of the methods of treating ischemic heart disease is coronary stenting. When the coronary stent is implanted, the intima of the vessel is damaged, which leads to activation of the innate immune response. The purpose of this work was to study the cellular link of innate immunity in patients with coronary heart disease before the operation of coronary stenting and at various times of the postoperative period. As a result of the study, before the coronary stenting, an increase in the expression of TLR2 and TLR9, an increase in the number and decrease in the cytotoxicity of CD16+ lymphocytes, a decrease in the microbicidal potential of neutrophils was revealed. After coronary stenting, the expression on CD284 and CD289 monocytes decreased, the amount and increase in the cytotoxic activity of CD16+ cells decreased. Thus, patients who underwent coronary stenting need an evaluation of the cellular link of innate immunity both before and after surgery.
Keywords: coronary stenting; innate immunity; Toll-like receptors.
For citation: Sizyakina L.P., Shlyk I.F., Sidorov R.V, Shlyk S.V Characteristics of the cellular link of innate immunity in patients undergoing coronary stenting. Immunologiya. 2018; 39(1): 16-19. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-16-19
For correspondence: Sizyakina Lyudmila Petrovna, Dr Med. Sci., Professor, Head. cafes. Clinical Immunology and
Allergology, director of the Institute of Clinical Immunology «Rostov State State Medical University», 344022,
Rostov-on-Don, Russia, E-mail: [email protected]
Information about authors:
Sizyakina L.P. http://orcid.org/0000-0001-5716-4397
Shlyk I.F., http://orcid.org/0000-0003-2193-7372
Sidorov R.V., http://orcid.org/0000-0002-8411-1554
Shlyk S.V. http://orcid.org/0000-0003-3070-8424
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 12.05.17 Accepted 16.08.17
В настоящее время заболеваемость и смертность от болезней системы кровообращения, несмотря на снижение на 3,15% (по состоянию на 2015 г.), продолжает оставаться глав-
Для корреспонденции: Сизякина Людмила Петровна, д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой клинической иммунологии и аллергологии, директор Института клинической иммунологии Ростовского государственного медицинского университета, E-mail: [email protected]
ным вызовом современной медицины. При этом смертность от ишемической болезни сердца (ИБС) с 2014 г увеличилась на 0,3%. Одним из самых распространённых методов хирургического лечения ИБС является стентирование коронарных артерий (КА). В 2015 г количество стентирований КА в РФ увеличилось на 18,4% по сравнению с 2014 г. [1]. Однако успешность данного вида лечения снижается в первую очередь за счёт развития рестенозов коронарных стентов, встречающихся у 30-42% больных [2].
Коронарные стенты, несмотря на их биоинертность,
ORIGINAL ARTICLE
представляют собой чужеродный агент. При его имплантации возникает повреждение интимы, что приводит к активации моноцитов и развитию острой воспалительной реакции с формированием неоинтимы [3-5]. От исхода воспаления зависит функциональная состоятельность коронарного стента. Таким образом, интерес представляет характеристика врождённого звена иммунной системы, так как от него зависит не только исход воспаления, но и запуск адаптивных иммунных реакций, что в свою очередь обусловливает хронизацию воспалительного процесса и формирование рестеноза коронарного стента [6].
В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение клеточного звена врождённого иммунитета у пациентов с ишемической болезнью сердца до операции коронарного стентирования и в различные сроки послеоперационного периода.
Материал и методы
Исследование проводили на базе кардиохирургического отделения и НИИ иммунологии ФГБОУ ВО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России. В исследование включены 56 участников (27 мужчин и 15 женщин в возрасте 55,5±3 года) с ИБС, и 14 респондентов без клинического проявления ИБС (в возрасте 50,1±2 года), составивших группу контроля. Критериями включения явились: ИБС, стенокардия напряжения III-IV функциональных классов и наличие показаний для стентирования коронарных артерий. Критерии исключения: нестабильная форма стенокардии, острый инфаркт миокарда, постинфарктный кардиосклероз, наличие сопутствующей онкологической и аутоиммунной патологии, заболеваний соединительной ткани. Все участники подписали информированное согласие на участие в исследовании.
Продолжительность ИБС составила 4,6±2,1 года. Всем пациентам выполнена операция стентирования коронарных артерий с имплантацией стентов Nobori с лекарственным покрытием Biolimus (Бельгия). В 39,9% случаев выполнено стентирование средней трети и в 30,2% - проксимальной трети передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. Стентирование правой коронарной артерии проведено в 29,9% случаев. После операции пациенты принимали стандартную двойную антиагрегантную (клопидогрел и ацетилсалициловая кислота), гиполипидемическую, антианги-нальную и гипотензивную терапию. Клеточное звено врождённого иммунитета оценивали до стентирования и через 4, 11 и 18 дней после операции. Методом проточной цитофлюометрии с использованием монокло-нальных антител (Beckman Coulter, США) проводили фенотипирование CD14+CD282+ (TLR2), CD14+CD284+ (TLR4), CD14+CD289+ (TLR9) моноцитов и CD3+CD16+, CD16+Gr+-лимфоцитов периферической крови на проточном лазерном ци-тофлюориметре «FC500». Метаболическую кисло-родзависимую активность нейтрофилов оценивали в НСТ-тесте. Для оценки клинического проявления ИБС через 6 мес после проведения коронарного стентирования в 90% случаев пациентам выполнен ЭКГ-стресс-тест с физической нагрузкой на тред-миле.
При статистическом анализе нормальность распределения признака в выборках оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Статистическая обработка полученных результатов основывалась на /-критерии Стьюдента и осуществлялась при использовании пакетов программ SPSS Statistics 17.0. Различия показателей считали достоверными при р<0,05. Значения показателей представлены в виде среднего значения (M) ± стандартная ошибка (m).
Таблица 1
Характеристика клеточного звена врождённого иммунитета пациентов с ИБС в дооперационном периоде
Показатель Контроль Больные с ИБС
CD14+CD282+, % 64,0±8,0 79,8±1,6*
CD14+CD282+, 107л 0,2±0,03 0,4 ±0,1*
CD14+CD284+, % 20,0±4,0 27,0±4,3
CD14+CD284+, 109/л 0,1± 0,01 0,2 ±0,01
CD14+CD289+, % 3,0±1,0 87,3±3,5*
CD14+CD289+, 109/л 0,01±0,005 0,5 ±0,01*
CD16+, % 12,2±0,2 16,5±1,3*
CD16+, 109/л 0,1±0,01 0,3± 0,1*
CD16+Gr+, % 10,2±1,1 5,3±0,7*
CD16+Gr+, 109/л 0,14 ±0,02 0,02± 0,01*
НСТ сп, у.е. 90,2±1,2 97,7±2,6*
НСТ ст, у.е. 193,6±2,1 158,9±4,2*
К ст. НСТ 2,1±0,1 1,6±0,1*
Примечание. Здесь и в табл. 2: * - р<0,05 по сравнению с исходными данными до оперативного лечения.
Результаты и обсуждение
В табл. 1 представлено сравнение показателей клеточного звена врождённого иммунитета у пациентов с
ишемической болезнью сердца и группой контроля. Выявлено статистически значимое повышение экспрессии CD282 на CD14+-моноцитах как по относительным, так и по абсолютным значениям. В то же время экспрессия TLR4 не отличалась от группы сравнения. Обращает внимание количество CD289+моноцитарных клеток, которое в несколько раз выше соответствующих данных контрольной группой. Эта закономерность отражена как в абсолютных, так и в относительных значениях. Анализ показателей CD16+-лимфоцитов выявил, что у пациентов с ИБС количество этих клеток статистически значимо выше, чем в контрольной группе, а цитотокси-ческий потенциал ниже, о чём свидетельствует уменьшение количества Гранзим В-содержащих CD16+-лимфоцитов. В фагоцитарном звене отмечено статистически значимое по-
Таблица 2
Динамика показателей клеточного звена врождённого иммунитета в различные сроки ослеоперационного периода
Показатель До операции 4-е сутки 11-е сутки 18-е сутки
CD14+ CD282+, % 79,8±1,6 78,0±1,4 80,67±6,89 76,0±1,1
CD14+ CD282+, 109/л 0,4±0,1 0,3 ±0,01 0,7± 0,03 0,3± 0,03
CD14+ CD284+, % 27,0±4,3 10,6±1,6* 12,0±1,8* 13,5±1,2*
CD14+ CD284+, 109/л 0,2 ±0,01 0,05±0,01* 0,1 ±0,09* 0,09±0,04*
CD14+ CD289+, % 87,3±3,5 75,18±5,1* 61,67±2,1* 78,20±3,1*
CD14+ CD289+, 109/л 0,5 ±0,01 0,3± 0,02* 0,2±0,03* 0,3± 0,01*
CD16+, % 16,5±1,3 13,86±1,1* 14,67±2,4 15,3±2,2
CD16+, 109/л 0,3± 0,1 0,1±0,03* 0,1 ±0,08 0,4 ±0,1
CD16+Gr+ ,% 5,3±0,7 5,4±0,9 15,4±1,4* 8,8±1,2
CD16+Gr+ ,109/л 0,02±0,01 0,08±0,05 0,2±0,01* 0,09±0,06
НСТ сп, у.е. 97,7±2,6 95,4 ±1,9 93,0±3,5 98,0±3,4
НСТ ст, у.е. 158,9±4,2 165,20±5,58 152,00±4,37 163,00±5,79
К ст. НСТ 1,6±0,1 1,7±0,03 1,6±0,09 1,6±0,06
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
вышение значения спонтанного НСТ-теста при уменьшении адаптационного резерва фагоцитов в виде снижения стимулированного НСТ-теста, что проявляется достоверно низким значением коэффициента стимуляции.
Таким образом, из приведённых данных следует, что у пациентов с ИБС в сравнении с группой контроля отмечается усиление экспрессии TLR2 и 9 моноцитами периферической крови, снижение цитотоксической активности CD16+-клеток наряду с повышением их содержания и неадекватной микро-бицидной активностью нейтрофилов.
При анализе динамики данных показателей у пациентов с ишемической болезнью сердца в различные сроки послеоперационного периода выявлено незначительное колебание экспрессии CD282 на моноцитах, не достигающее статистически значимых изменений (табл. 2). При этом противоположная динамика прослеживается в отношении экспрессии CD284 и CD289 на CD14+-клетках и проявляется достоверным снижением отмеченных показателей во все сроки наблюдения, демонстрируя тенденцию к незначительному повышению к 18-м суткам как в относительных, так и в абсолютных значениях. При анализе динамики CD16+-лимфоцитов на 4-е сутки отмечается статистически значимая количественная супрессия с постепенным достижением исходного содержания к 18-м суткам. При этом цитотоксический потенциал в виде внутриклеточного содержания Гранзима В, достоверно повышается к 11-м суткам послеоперационного периода, достигая исходных значений к 18-м суткам. Отмеченная динамика количества CD16+-клеток и содержания в них Гранзима В прослеживается как в относительных, так и в абсолютных значениях.
Исследование микробицидной активности нейтрофилов не выявило статистически значимых колебаний значений как спонтанного, так и стимулированного НСТ-теста, была отмечена лишь тенденция к увеличению данных показателей к 18-м суткам. Коэффициент стимуляции оставался на исходно низком уровне (см. табл. 2).
Таким образом, при исследовании динамики показателей клеточного звена врождённого иммунитета после коронарного стентирования выявлено снижение экспрессии моноцитами TLR4 и TLR9 в течение всего послеоперационного периода и уменьшение количества CD16+-лимфоцитов с повышением их цитотоксической активности.
TLR2 и TLR4 - трансмембранные белки, расположенные на наружной мембране клетки, а TLR9 - внутриклеточный белок мембраны эндосом. Воздействие на эти клеточные структуры приводит к активации синтеза провоспалительных цитокинов и индукции адаптивного иммунитета [7].
В наших исследованиях установлено, что у пациентов с коронарным атеросклерозом отмечается повышенная моно-цитарная экспрессия CD282 и CD289. Этот факт связан с наличием воспаления в очаге атеросклеротического поражения и согласуется с данными литературы. Так, в работе Lee G. [8] отмечено, что TLR2 и TLR4 участвуют в формировании атеросклеротических бляшек. Установлено, что TLR2 способствуют миграции гладко-мышечных клеток в зону ате-росклеротичекого повреждения, вызывают эндотелиальную дисфункцию коронарных артерий за счёт активации нейтро-филов и продукции ими активных форм кислорода [8, 9].
В свою очередь, TLR4 активируется не только бактериальными и вирусными липополисахаридами, но и окисленными липопротеинами низкой плотности. Данный факт способствует поддержанию асептического воспаления в зоне атеросклеротического повреждения [9, 10].
Особого внимания заслуживает факт увеличения количества CD14+CD289+-моноцитов, в десятки раз превышающих соответствующий показатель контроля. Возможно, это связано с длительно существующим атеросклеротическим повреждением сосудистой стенки. Данный тип рецепторов активируется внутриклеточными патогенами и продуктами
тканевого распада эндогенного происхождения. Согласно литературным данным, в роли паттернов TLR9 могут выступать последовательности нуклеиновых кислот некроти-зированной сосудистой стенки в зоне атеросклеротического повреждения, белки теплового шока HSP 60 и 70, которые имеют сходство с бактериальными липополисахаридами, продукты апоптоза макрофагов, фибриноген, фибронектин [10].
Выявленное в нашем исследовании повышенное содержание натуральных киллеров до проведения стентирования, согласно данным литературы, связано с атеросклеротическим повреждением сосудистой стенки. Так, в работе Kotfis K. и соавт. [11] показана прямая корреляционная связь повышенного содержания CDl6+-лимфоцитов с обширностью атеросклеротического поражения и длительностью течения атеросклероза.
В экспериментальных моделях также доказано, что чем длительнее существует атеросклероз, тем ниже цитолити-ческая активность CD16+-клеток [12]. Полученные нами данные служат убедительным подтверждением этих выводов: снижение количества СD16+Гранзим В+-лимфоцитов свидетельствует об угнетении цитолитической функции этих клеток при ИБС.
Неадекватное изменение значений НСТ-теста как спонтанного, так и стимулированного, может свидетельствовать об истощении микробицидной активности нейтрофилов при коронарном атеросклерозе.
Необходимо отметить результаты динамики изучаемых показателей после проведения коронарного стентирования. На протяжении всего периода наблюдения отмечалось снижение экспрессии всех трёх изученных видов TLR. Что, возможно, обусловлено иммуносупрессивным влиянием лекарственного покрытия стента [13].
Обращает внимание динамика снижения CD16+-лимфоцитов в течение послеоперационного периода, видимо, также связанная с антипролиферативным покрытием коронарного стента. Повышение цитолитической активности CD16+-клеток на 11-е сутки может быть обусловлено активацией аутоиммунного ответа. Снижение внутриклеточного содержания Гранзима В к 18-м суткам послеоперационного периода не исключает активацию адаптивного иммунитета в более поздние сроки, проявляющуюся усиленной продукцией провоспалительных цитокинов и хемокинов. Механизм активации CD16+-лимфоцитами адаптивного иммунитета связывают с пролиферацией покоящихся аутологичных СD4+-клеток под воздействием костимулирующих молекул суперсемейства иммуноглобулинов и TNF [14]. Эти медиаторы являются мощным триггером воспалительной реакции в месте имплантации стента [13].
В свою очередь, отсутствие динамики метаболической активности нейтрофилов в течение послеоперационного периода может свидетельствовать как о супрессивной роли лекарственного покрытия стента, так и о недостаточности кислородзависимого механизма фагоцитоза нейтрофилов.
У пациентов, перенёсших коронарное стентирование, через 6 мес проведён тредмил-тест. При этом ишемических изменений не выявлено и проба оценена как отрицательная. Данный факт косвенно может свидетельствовать об адекватной работе стентов. Однако, учитывая, что рестенозы коронарных стентов чаще происходят через 12 мес с момента коронарного стентирования, необходимо дальнейшее динамическое наблюдение за данной группой пациентов.
На основании вышеизложенного можно сделать заключение, что у пациентов с ИБС наблюдается нарушение го-меостаза в клеточном звене врождённого иммунитета до проведения стентирования. Выявленные факты могут быть объяснены длительно текущим атеросклерозом. Изменения компонентов клеточного звена врождённого иммунитета в течение послеоперационного периода являются дискута-
бельными и требуют дальнейшего изучения. Учитывая вклад врожденного иммунитета в активацию адаптивного иммунного ответа, выявленные изменения требуют динамического наблюдения в течение раннего послеоперационного периода для отбора пациентов с высоким риском неблагоприятных осложнений в виде тромбоза и рестеноза коронарного стента.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 4, 7-13 см. REFERENCES)
1. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. Сердечно-сосудистая хирургия-2015. Болезни и врожденные аномалии системы кровообращения. Москва: НЦССХ им. А.Н. Бакулева; 2016.
2. Проскуряков А.И., Мироненко С.П., Осиев А.Г. Клинико-имму-нологические аспекты формирования рестеноза после коронарного стентирования при ИБС. Медицина и образование в Сибири. 2013; 3: 8.
5. Сушкина И.Ф., Шлык С.В., Сизякина Л.П., Антонова Е.А. Влияние маркеров воспаления на тяжесть течения острого коронарного синдрома. Цитокины и воспаление. 2014; 13(3): 131-2.
6. Хаитов Р.М. Иммунология: структура и функции иммунной системы. Москва: Геотар-Медиа; 2013.
14. Осиев А.Г., Мироненко С.П., Ёлкина Д.С. Сравнительная характеристика покрытых стентов, использованных при эндоваскулярном лечении больных ишемической болезнью сердца. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2013; 1: 91-5.
REFERENCES
1. Bokeriya L.A., Gudkova R.G. Cardiovascular Surgery-2015. Diseases and congenital anomalies of the circulatory system. [Serdech-no-sosudistaya khirurgiya-2015. Bolezni i vrozhdennye anomalii sistemy krovoobrashcheniya]. Moscow: NTsSSKh im. A.N. Baku-leva; 2016. (in Russian)
2. Proskuryakov A.I., Mironenko S.P., Osiev A.G. Clinical and immunological aspects of the formation of restenosis after coronary stent-ing in IHD. Meditsina i obrazovanie vSibiri. 2013; 3: 8. (in Russian)
3. Nakagawa M.A., Naruko T., Ikura Y. Decline in platelet activation and inflammatory cell infiltration in associated with the phenotypic redifferentiation of neointimal smooth muscle cells after bare-metal stent implantation in acute coronary syndrome. J. Atheroscler. Thromb. 2010; 17 (7): 675-87.
ORIGINAL ARTICLE
4. Fukuda D., Shimada K.,TanakaA., KawarabayashiT.,Yoshiyama M., Yoshikawa J. Circulating monocytes and in-stent neointima after coronary stent implantation. J. Am. Coll. Cardiol. 2004; 43: 18-23.
5. Sushkina I.F., Shlyk S.V., Sizyakina L.P., Antonova E.A. Influence of markers of inflammation on the severity of acute coronary syndrome. Tsitokiny i vospalenie. 2014; 13(3): 131-2. (in Russian)
6. Khaitov R.M. Immunology: structure and functions of the immune system. [Immunologiya: struktura i funktsii immunnoy sistemy]. Moscow: Geotar-Media; 2013. (in Russian)
7. Farb A., Weber D. K., Kolodgie F. D., Burke A. P., Virmani R. Morphological predictor of restenosis after coronary stenting in humans. Circulation. 2002; 105: 2974- 80.
8. Lee G.L., Chang Y.W., Wu J.Y., Wu M.L., Wu K.K., Yet S.F. et al. TLR 2 induces vascular smooth muscle cell migration through cAMP response element-binding protein-mediated interleukin-6 production. Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 2012; 32(11): 2751-60. doi: 10.1161/atvbaha.112.300302.
9. Favre J., Musette P., Douin-Echinard V., Laude K., Henry J.P., Arnal J.F. et al. Toll-like receptors 2-deficient mice are protected against postischemic coronary endothelial dysfunction. Arterioscler Thromb Vasc. Biol. 2007; 27(5):1064-71.
10. Mohsin H. K. Roshan, Amos Tambo, Nikolai P. Pace The Role of TLR2, TLR4, and TLR9 in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Int. J. Inflam. 2016; 2016: 1532832. doi: 10.1155/2016/1532832
11. Kotfis K., Biernawska J., Zegan-Baranska M., Zukowski M. Peripheral Blood Lymphocyte Subsets (CD4+, CD8+ T Cells, NK Cells) in Patients with Cardiovascular and Neurological Complications after Carotid Endarterectomy. Int. J. Sci. 2015; 16(5): 10077-94. doi: 10.3390/ijms160510077
12. Parisi L., Bassani B., Tremolati M., Gini E., Farronato G., Bruno A. Natural killer (NK) cells augment atherosclerosis by cytotoxic-de-pendent mechanisms. Cardiovasc Res. 2014; 102 (1): 128-37. DOI: https://doi.org/10.1093/cvr/cvu016.
13. Osiev A.G., Mironenko S.P., Elkina D.S. Comparative characteristics of coated stents used in endovascular treatment of patients with ischemic heart disease. Patologiya krovoobrashcheniya i kardiokh-irurgiya. 2013; 1: 91-5. (in Russian)
14. Zingoni A., Sornasse T., Benjamin G. C., Tanaka Y., Santoni A., Lanier L.L. Cross-Talk between Activated Human NK Cells and CD4+ T Cells via 0X40-0X40 Ligand Interactions. J. Immunol. 2004; 173 (6): 3716-24. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmu-nol.173.6.3716
Поступила 12.05.17 Принята в печать 16.08.17
