CC BY
54
ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология
© СИЗЯКИНА л.п., АНДРЕЕВА И.И., 2014 УДК 616.153.962.4-085-078.33
Сизякина Л.П., Андреева И.И.
дискордантность параметров адаптивного и врожденного иммунного ответа при заместительной терапии у больных х-сцепленной агаммаглобулинемией
ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России 344033, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29
Эффективность заместительной терапии при Х-сцепленной агаммаглобулинемии (болезнь Брутона) не вызывает сомнения. Тем не менее вопросы функционирования клеточного звена иммунной системы, а также факторов врожденного иммунитета в этих условиях малоизучены. В результате комплексного анализа параметров иммунного статуса выявлено, что у пациентов с первичным дефектом процессов антителогенеза определяется компенсаторная активация клеточных механизмов адаптивной иммунной защиты. В то же время функция клеточных факторов врожденного иммунитета снижена, при этом гуморальный компонент врожденной защиты, верифицируемый синтезом антимикробных пептидов, сохраняет свой потенциал. Заместительная внутривенная иммуноглобулиновая (ВВИг) терапия, помимо восстановления уровня сывороточных иммуноглобулинов, стабилизирует синтез антимикробных пептидов и антигенпрезентирующую функцию макрофагов.
Ключевые слова: Х-сцепленная агаммаглобулинемия; врожденный и адаптивный иммунный ответ; заместительная терапия ВВИГ.
Sizyakina L.P., Andreevа I.I.
DISCORDANT ADAPTIvE AND INNATE IMMUNE RESPONSE FOR SUBSTITUTION THERAPY IN PATIENTS WITH X-LINKED AGAMMAGLOBULINEMIA.
Rostov State Medical University, 344022, Rostov-on-Don. Russian Federation
The effectiveness of substitution therapy for X-linked agammaglobulinemia (Bruton's disease) is known. However, the issues of functioning immune system cell link, and innate factors of immunity in these conditions are poorly understood. The analysis of immune status parameters shown that patients with primary defect processes of antibody determined compensatory activation of cellular mechanisms of adaptive immune defense. At the same time the function of cellular factors innate immunity is reduced, thus protecting the innate humoral component, verifiable synthesis of antimicrobial peptides retain their potential. IvIG replacement therapy in addition to restoring the level of serum immunoglobulins stabilizes the synthesis of antimicrobial peptides and the antigen presenting function of macrophages.
Key words: X-linked agammaglobulinemia; innate and adaptive immune response; IVIG replacement therapy.
Введение. Первичные иммунодефициты - одна из наиболее актуальных тем современной клинической иммунологии. Интерес к данной проблеме определяется широкими возможностями изучения особенностей функционирования факторов врожденной и адаптивной иммунной защиты в условиях естественной модели иммунной дисфункции [1, 2]. Не менее важным аспектом является поиск возможных терапевтических средств возмещения врожденного дефекта. В первую очередь это относится к пациентам с агаммаглобулинемией - патогенетически обоснованная заместительная терапия внутривенными иммуноглобулинами доказала свою эффективность [3, 4]. Однако, несмотря на замещение гуморальной составляющей адаптивного иммунитета, вопросы функционирования клеточного звена иммунной системы, а также факторы врожденного иммунитета в этих условиях малоизучены.
Цель настоящей работы - анализ изменений в динамике адаптивного и врожденного иммунного ответа в процессе заместительной терапии пациентов с Х-сцепленной агаммаглобулинемией (Х-АГГ) - болезнь Брутона.
Материалы и методы. Под наблюдением находились 7 пациентов (мужчины) в возрасте 9-23 лет, с диагнозом Х-АГГ (болезнь Брутона). Все больные после установления диагноза получали заместительную терапию ВВИГ. В нача-
Сизякина Людмила Петровна - доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой клинической иммунологии аллергологии ФПК и ППС (Sizyakina Lyudmila Petrovna), msiziaki-na@mail.ru; Андреева Ирина Ивановна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС (Andreeva Irina Ivanovna), iai3012@rambler.ru
ле лечения - в режиме насыщения. После достижения пре-трансфузионного уровня IgG 5 г/л в фазе поддержания больным назначили регулярную заместительную терапию ВВИГ G-класса в дозе 0,4-0,5 г/кг. Введение препарата проводили 1 раз в 4 нед внутривенно капельно. Контрольную группу составили 10 практически здоровых доноров крови в возрасте 20-22 лет. Комплексную оценку параметров адаптивного и врожденного иммунного ответа осуществляли до начала регулярной заместительной терапии, через 2 и 4 нед после очередной инфузии в период поддерживающей терапии. Фенотипический анализ лимфоцитов, а именно определение экспрессии CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD25, CD95, внутриклеточного содержания Foxp3, гранзима В, экспрессию HLA-DR, ТМ-подобных рецепторов (TLR2), TLR4 на моноцитах периферической крови, проводили с помощью реакции иммунофлюоресценции с учетом результатов на проточном лазерном цитофлюориметре FC 500 (Becman Coulter, США), используя соответствующие моноклональные антитела. Кис-лородзависимую метаболическую активность нейтрофилов оценивали в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ) [5], содержание сывороточных IgA, IgM, IgG - в реакции радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини. Уровень IgE, интерлейкина (IL)-4, интерферона-у (IFNy, дефензина, катеп-сина, лактоферрина, в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа в тест-системах ЗАО Вектор-Бест, Orgentec, HBT. Полученные данные математически обрабатывали на ПК Microsoft Windows XP professional, используя программу Statistica 6.0. Достоверность различий в группах оценивали с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и Вилксона. Достоверными считались результаты при р < 0,05.
- 89 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2014
Результаты и обсуждение. При иммунологическом обследовании пациентов, проведенном до начала заместительной терапии, на фоне характерных для болезни Брутона признаков в виде отсутствия в циркуляции зрелых В-лимфоцитов и снижения общего количества иммуноглобулинов сыворотки крови до 1,54 ± 0,86 г/л выявили существенные изменения и в клеточном звене адаптивного иммунного ответа (табл. 1). Так, отметили увеличение общего количества Т-клеток, при этом количественные изменения сопровождались трансформацией функционального и иммунорегуляторного потенциала: усилена экспрессия раннего активационного маркера cD25 на CD4+-Т-клетках, в то же время существенно снижено содержание циркулирующих CD4+CD25+Foxp3+-лимфоцитов, ответственных за супрессию иммунного ответа. Рост количества Т-лимфоцитов опосредован повышением уровня CD8+-субпопуляции. Увеличение количества эффекторных цитолитических клеток сопровождается активацией их функциональных параметров, что документируется повышенной экспрессией позднего активационного маркера HLA-DR, увеличением спонтанной продукции IFNy, а также значительным усилением цитолитического потенциала: количество гранзимсодержащих CD3+ CD8+-клеток достигает 32,60 ± 3,84% против 9,38 ±
2,21% в контролех.
Через 2 нед после проведения заместительной терапии уровень иммуноглобулинов сохраняется в пределах 6-7,5 г/л. В клеточном звене адаптивной иммунной защиты в сравнении с исходными данными не изменяются количество и соотношение субпопуляций Т-клеток. Однако мы отметили изменения их функциональных свойств. Так, восстанавливается на уровне таковой в группе сравнения экспрессия раннего активационного маркера CD25 на CD4+ Т-лимфоцитах, в то время как в еще большей степени, чем до терапии, снижено количество CD4+CD25+Foxp3+-супрессорных лимфоцитов. Обращает внимание тот факт, что, несмотря на терапевтическое восстановление уровня иммуноглобулинов, эффекторные функции клеточной системы защиты продолжают расти: количество HLA-DR+ и гранзим+-цитотоксических лимфоцитов увеличивается в еще большей степени, чем до лечения, а на cD8+ Т-клетках восстанавливается до контрольных значений экспрессия маркеров ранней (cD25) и поздней (cD95) активации. Высокий потенциал клеточного звена поддерживается IFNy, продукция которого также остается повышенной. Через 1 мес, накануне введения поддерживающей дозы ВВИГ, сывороточный уровень иммуноглобулинов составил в среднем 6,2 ± 0,9 г/л. Общее количество Т-лимфоцитов, оставаясь повышенным, имеет тенденцию к снижению за счет стремящейся к нормализации CD8+-cубпопуляции.
Для CD4+-субпопуляции Т-клеток характерны нивелирование эффектов ВВИГ, отмеченных ранее, и восстановление функциональных параметров в виде экспрессии cD25, количества CD4+CD25+Foxp3+-регуляторных клеток на уровне, определенном до начала терапии.
Тенденция к снижению содержания cD8+ Т-лимфоцитов сопряжена также, статистически недостоверно, уменьшением числа содержащих гранулы гранзима активных цитотоксических Т-клеток, хотя их количество по-прежнему превышает контроль. При этом отметили нормализацию экспрессии маркера ранней активации - количество CD25+-цитотоксических лимфоцитов приближается к показателям в контрольной группе. Уровень CD8+HLA-DR+-клеток снижается, оставаясь тем не менее повышенным по
Таблица 1
Факторы адаптивного иммунного ответа в динамике заместительной терапии внутривенными иммуноглобулинами пациентов с Х-АГГ
Параметр Контроль До начала терапии Через 2 нед Через 4 нед
CD3+, % 65,4 ± 2,2 91,40 ± 2,5* 91,7 ± 1,3* 89,4 ± 2,6*
CD3+CD25, % 2,1 ± 0,8 3,4 ± 1,0 1,0 ± 0,5 3,5 ± 1,2
CD3+CD95,% 2,6 ± 1,0 0,7 ± 0,2* 0,3 ± 0,1* 0,7 ± 0,3*
CD3+HLA-DR+, % 8 ± 0,06 12,00 ± 4,0 9,7 ± 1,3 9,2 ± 2,2
CD4+, % 41,9 ± 1,9 44,40 ± 4,4 38,3 ± 1,7 43 ± 5,9
CD4+CD25+Foxp3+, % 3,0 ± 1,2 0,8 ± 0,5* 0,28 ± 0,08* 1,1 ± 0,3*
CD4+CD25, % 1,3 ± 0,6 3,1 ± 0,1* 0,8 ± 0,1 3,8 ± 0,3*
CD8+, % 21,8 ± 1,6 40,80 ± 3,44* 45,8 ± 3,1* 35,3 ± 4,9*
CD8+CD25+,% 1,26 ± 0,03 0,03 ± 0,01* 0,1 ± 0,05* 0,9 ± 0,1
CD8+CD95+, % 0,46 ± 0,05 0,4 ±0,1 0,1 ± 0,05* 0,3 ± 0,05*
CD8+HLA-DR, % 0,94 ± 0,07 2,50 ± 0,81* 8,1 ± 0,2* 5,2 ± 1,6*
CD8+Gr+, % 9,38 ± 2,21 32,60 ± 3,84* 44,0 ± 2,0* 31,0 ± 4,0*
CD19+, % 6,2 ±1,1 0,04 ± 0,04* 0,04 ± 0,04* 0,04 ± 0,04*
IgA г/л 1,6 ± 0,4 0,30 ± 0,12* 0,32 ± 0,13* 0,31 ± 0,09*
IgM г/л 1,1 ± 0,3 0,47 ± 0,21* 0,4 ± 0,2* 0,43 ± 0,14*
IgG г/л 10,3±1,3 2,54±0,86* 6,9 ± 0,8* 6,2 ± 0,9*
IL-4, пг/мл 1,9±0,2 1,6±0,3 1,8 ± 0,2 1,9 ± 0,2
INFy, пг/мл 6,2±3,3 20,26±5,05* 18,0 ± 3,0* 26,0 ± 5,0*
Примечание. Здесь и на рис. 2: * - статистически достоверные различия показателей по сравнению с таковыми в контроле при p < 0,05.
отношению к таковому до начала терапии и контрольным данным. Также повышенной остается и продукция IFNy.
У пациентов с Х-АГГ до проведения заместительной терапии выявили не только генетически детерминированные изменения в системе гуморального звена и связанные с этим компенсаторные процессы системы клеточных факторов адаптивной иммунной защиты, но и особенности параметров иммунного статуса, характеризующих врожденный иммунитет (табл. 2). Внимания заслуживает факт, что активность клеточных факторов врожденного ответа в отличие от адаптивного снижена. Это проявляется уменьшением как общего количества натуральных киллеров, так и гран-зимсодержащих CD3-CD16+-лимфоцитов. Снижены также
Таблица 2
Факторы врожденного иммунного ответа в динамике заместительной терапии внутривенными иммуноглобулинами пациентов с Х-АГГ
Параметр Контроль До начала терапии Через 2 нед Через 4 нед
НСТ сп. 99,1 ± 5,0 86,00 ± 2,74* 92,00 ± 2,5 90,00 ± 2,0*
К ст 2,1 ± 0,08 1,46 ± 0,13* 1,4 ± 0,1* 1,5 ± 0,1*
TLR2,% 64 ± 8 71,33 ±2,89 74,00 ± 4,0 70,00 ± 3,0
TLR4,% 20 ± 4 9,67 ± 1,04* 7,5 ± 1,5* 9,00 ± 0,8*
TLR9, % 3,1 ± 1,1 3,00 ±1,00 3,0 ± 1,5 2,3 ± 0,7
CD14+HLA-DR+, % 85,0 ± 5,0 52,80 ± 5,25* 80,0 ± 5,0 80,0 ± 6,0
CD16+, % 12,1 ± 1,2 6,30 ± 1,13* 5,4 ± 0,4* 6,3 ± 0,5*
CD16+GR+, % 10,21 ± 1,10 4,30 ± 1,3* 3,0 ± 0,5* 2,3 ± 0,7*
Катепсин, нг/мл 2,7 ± 1,2 2,94 ± 1,5 0,35 ± 0,15* 0,15 ± 0,1*
Дефензин, мкг/мл 75,0 ± 15,0 572,5 ± 20* 398,0 ± 45,0* 288,0 ± 23,0*
Лактоферрин, мкг/мл 650,0 ± 50,0 513,0 ± 95,95 632,0 ± 36,0 787,0 ± 81,0
Примечание. сп. - спонтанный; ст. - стимулированный.
- 90 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ и КЛИНИЧЕСКАЯ иммунология
спонтанная кислородзависимая метаболическая активность нейтрофилов и их адаптивный потенциал. Угнетение функциональных свойств клеток макрофагального ряда проявляется уменьшением количества антигенпрезентирующих CD14+HLA-DR+-моноцитов, снижением экспрессии TLR4+-рецептора, ответственного за распознавание липополисахарида (ЛПС), одного из ведущих бактериальных паттернов. В то же время гуморальные факторы врожденного иммунитета, как катепсин В и лактоферрин, находятся на уровне таковых в контрольной группе, а секреция катионного пептида дефензина-а, обеспечивающего прямой антимикробный эффект, существенно повышена.
В системе врожденного иммунитета эффективность ВВИГ-терапии через 2 нед четко прослеживается на антиген-представляющей функции клеток макрофагального ряда, что документируется существенной активацией экспресси HLA II класса - количество CD14+ HLA-DR+ восстанавливается до контрольных значений практически здоровых доноров. В то же время отсутствует динамика в экспрессии паттернораспознающих рецепторов: продукция TLR2 и TLR9 находится на уровне контроля, а TLR4 существенно снижена. Так же, как и до лечения количество и функциональный потенциал киллерных клеток врожденного иммунитета низкий, более того, следует отметить тенденцию к дальнейшему снижению гранзимсодержащих CD3-CD16+-лимфоцитов. Экзогенное введение иммуноглобулинов не оказывает влияния на продукцию лактоферрина, однако приводит к существенному, ниже контрольных параметров, снижению внеклеточного содержания катепсина. Уровень дефензина также уменьшается, оставаясь тем не менее значительно выше контрольных значений. Через 1 мес после восстановления терапевтического уровня иммуноглобулинов остается стабильным на уровне контроля количество CD14+HLA DR+-моноцитов. Что касается экспрессии TLR, то на эту функцию распознавания патогенов терапия ВВИГ воздействия не оказала - параметры экспрессии TLR2, TLR4 и TLR9 не изменялись в течение всего периода наблюдения. Также сниженными через 1 мес после введения иммуноглобулинов оказались количество и функциональный потенциал натуральных киллеров. Отметили дальнейшее в сравнении с начальным и промежуточным периодами наблюдения снижение содержания катепсина и дефензина. При этом количество катепсина на порядок ниже, чем в контрольной группе, а продукция дефензина выше, чем в контроле. Количество внеклеточного лактоферрина остается в пределах контрольных значений.
Заключение. Таким образом, у пациентов с первичным дефектом процессов антителогенеза определяется компенсаторная активация клеточных механизмов адаптивной иммунной защиты. В то же время функция клеточных факторов врожденного иммунитета снижена, при этом гуморальный компонент врожденной защиты, верифицируемый синтезом антимикробных пептидов, сохраняет свой потенциал.
Заместительная терапия не изменяет процессы созревания, пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов, не влияет на высокий цитолитический потенциал Т-эффекторов, однако приводит к включению механизмов, воздействующих
на экспрессию активационных маркеров и уровень циркулирующих CD4+CD25+Foxp3+-регуляторных клеток. В динамике терапии ВВИГ не изменяется экспрессия TLR, не восстанавливается активационный потенциал НК и нейтрофилов, при этом нормализуется антигенпрезентирующая функция моноцитов и снижается исходно повышенный уровень антимикробных пептидов.
При Х-АГГ иммунодефицитное состояние определяется не только отсутствием специфических иммуноглобулинов, но и сниженным функциональным потенциалом клеточных факторов врожденного иммунитета. Компенсация иммунодефицита обеспечивается активацией пролиферации и цитолитических свойств специфических цитотоксических лимфоцитов, а также продукцией антимикробных пептидов.
Заместительная терапия ВВИГ, помимо восстановления уровня сывороточных иммуноглобулинов, стабилизирует синтез антимикробных пептидов и антигенпрезентирующую функцию макрофагов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кондратенко И.В., Болгов А.А. Первичные иммунодефициты. М.: МЕДПРАКТИКА М.; 2005.
2. Сизякина Л.П., Андреева И.И. Возможности совершенствования диагностики первичных иммунодефицитов в Ростовской области. Российский аллергологический журнал. 2012; 1(1): 283-4.
3. Ярцев М.Н., Яковлева К.П., Плахтиенко М.В. Первичная иммунная недостаточность по данным Регистра первичных иммунодефицитных состояний Института иммунологии ФМБА России. Consilium Medicum. Приложение: Педиатрия. 2006; 8(1): 40-51.
4. Алешкевич С.Н. Врожденная агаммаглобулинемия у детей. Медицинские новости. 2011; 9: 50-2.
5. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Ярилин А.А. Руководство по клинической иммунологии. М.; ГЭОТАР-Медиа; 2009.
REFERENCES
1. Kondratenko I.V, Bolgov A.A. Primary immunodeficiencies. Moscow: Medpraktika M.; 2005 (in Russian).
2. Sizyakina L.P. Andreeva I.I. Possibilities to improve the diagnosis of primary immunodeficiencies in the Rostov region. Russiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2012; 1(1): 283-4 (in Russian).
3. Yartsev M.N., Yakovleva K.P., Plakhtienko M.V Primary immune deficiency according to the Register of primary immunodeficiencies of the Institute of immunology of Federal medical-biological agency of Russia. Consilium Medicum. Prilozhenye: Pediatriya. 2006; 8(1): 40-51 (in Russian).
4. Aleshkevich S.N. Congenital agammaglobulinemia in children. Meditsinskiye novosti. 2011; 9: 50-2 (in Russian).
5. Khaitov R.M., Pinegin B.V., Yarilin A.A. Guidelines on clinical immunology. Moscow: GEOTAR-Media; 2009 (in Russian).
Поступила 05.11.13 Received 05.11.13
- 91 -
