CC BY
57
2015, Т. 17, Специальный выпуск 2015, Vol. 17, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
ОТВЕТ НАИВНЫХ CD31 + Т-ЛИМФОЦИТОВ НА СТИМУЛЯЦИЮ IL-7 И IL-15 IN VITRO
Блинова Е.А., Пашкина Е.А., Козлов В.А.
НИИФКИ, Новосибирск, Россия
Введение: Размер пула наивных лимфоцитов остается практически неизменным в течение жизни человека, не смотря на непрерывную стимуляцию клеток окружающими организм антигенами и драматическими изменениями лимфоэпителиальной массы тимуса с возрастом. Поддержание численности наивных Т-клеток обеспечивается процессами их образования в тимусе и гомеостати-ческой пролиферации на периферии. Факторами выживания и гомеостатического контроля для наивных CD4+ и CD8+ клеток являются IL-7 и IL-15. По экспрессии CD31 Т-лимфоциты делят на «истинно» (недавно вышедшие из тимуса, CD31+) и центральные наивные клетки (CD31-). Негативная популяция образуется из CD31+ лимфоцитов, которые получили гомеостатический сигнал от комплекса MHC/аутологичный пептид. Однако с возрастом снижение CD31+ клеток не соответствует уменьшению содержания TREC в них, что предполагает наличие пролиферации данной популяции с сохранением молекулы CD31. Поэтому целью данной работы было исследование экспрессии CD31 на Т-лимфоцитах в динамике клеточных делений in vitro при стимуляции IL-7 и IL-15.
Материалы и методы: Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли из периферической крови условно-здоровых доноров (n=10), средний возраст 42±3,1 года. Часть выделенных клеток сразу метили моноклональными антителами к антигенам CD3, CD4, CD45RA и CD31, конъю-гированными с флюорохромами FITC, PE, PerCP и APC соответственно. Остальные клетки окрашивали витальным красителем CFSE (4 мкМ) и культивировали в 24-лу-ночных планшетах в полной среде (RPMI-1640, 10% FCS) в присутствии и отсутствии IL-7 и IL-15 в концентрации 2 млн клеток в мл. После 7 дней культивирования клетки собирали и окрашивали тем же набором моноклональных антител. Фенотипирование клеток осуществляли методом проточной цитофлуориметрии на клеточном анализаторе FACS Canto II (BD, США).
Результаты и обсуждение: Опытным путем была подобрана оптимальная концентрация гомеостатических цитокинов (50 нг/мл). В ответ на стимуляцию IL-7 и IL-15 Т-лимфоциты совершали в среднем 3-4 деления. При этом IL-7 вызывал пролиферацию как CD4+, так и CD8+
клеток, а ГЬ-15 — преимущественно CD8+ лимфоцитов. Добавление обоих цитокинов приводило к суммированию оказываемых ими эффектов. До культивирования число CD4+ лимфоцитов в среднем составило 37,3+2,7%, а CD8+ - 19,8+5,0%; тогда как оно достоверно повысилось после культивирования с Ш-7 (53,8+2,8% и 25,9+1,6%) и с ГЬ-15 (45,2+3,1% и 27,2+2,6%). При совместном культивировании с ГЬ-7 и ГЬ-15 количество CD4+ и CD8+ клеток увеличилось до 43,9+3,0% и 28,6+3,1% соответственно. В отсутствие гомеостатических цитокинов Т-клетки практически не пролиферировали (в среднем 1-2%) и их соотношение достоверно не отличалось от такового до культивирования. Число наивных CD31-позитивных Т-лимфоцитов до культивирования составило 38,9+5,2% для CD4+ клеток и 72,2+4,3% для CD8+ клеток. Достоверных отличий по количеству CD4+31+ и CD8+31+ лимфоцитов до и после культивирования в присутствии и отсутствии ГЬ-7 и ГЬ-15 не было выявлено. Число пролиферирующих в ответ на ГЬ-7 CD4+ клеток составило 22+5,5%, на ГЬ-15 — 9,8+2,0%, на ГЬ-7 вместе с ГЬ-15 — 31,2+7,0%. Число пролиферирующих в ответ на ГЬ-7 CD8+ клеток составило 35+5,5%, на ГЬ-15 - 49+6,8% и совместно на Ш-7 и Ш-15 - 61+6,3%. Аналогичное число отвечающих на стимуляцию клеток было выявлено и для субпопуляций CD4+31+ и CD8+31+ лимфоцитов. При этом 25+5,4% наивных CD4+45RA+ клеток и 35+7,6% наивных CD8+45RA+ клеток пролиферировали в ответ на Ш-7, 13+3,9% и 53+10,8% — в ответ на Ш-15, 39+10,0% и 67+10,3% - в ответ на Ш-7 и Ш-15 соответственно. Наибольшее количество клеток среди пролиферирующих Т-лимфоцитов совершило только одно деление, причем данный феномен наблюдался для всех исследованных субпопуляций.
Выводы: В ответ на стимуляцию Ш-7 и ГЬ-15 наблюдалась медленная пролиферация Т-клеток, при этом Ш-7 вызывал пролиферацию как CD4+, так и CD8+ клеток, а ГЬ-15 — преимущественно CD8+ лимфоцитов. Число наивных CD45RA+ лимфоцитов, отвечающих на стимуляцию, не совпадало с числом пролиферирующих CD4+ и CD8+ клеток, что указывает на пролиферацию клеток памяти. Число наивных CD4+31+ и CD8+31+ клеток, отвечающих на стимуляцию пролиферацией, было сопоставимо с таковым для CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Таким образом, не смотря на увеличение количества CD4+ и CD8+ лимфоцитов в процессе культивирования соотношение CD31+/CD31- клеток оставалось неизменным, что свидетельствует о пролиферации CD31-позитивных и CD31-негативных клеток с сохранением их фенотипа.
