CC BY
81
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
УДК 616-006.81.04-031.13-085.277.3-078.33
Митин А.Н.1, литвина М.М.1, Донецкова А.Д.1, Никонова М.Ф.1, Комогорова В.В.1, Шарова Н.и.1, Митина ТА.2, голенков А.К.2, Ярилин А.А.1
ДИНАМИКА ВОССТАНОВЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ ИНДУКЦИОННОГО КУРСА ХИМИОТЕРАПИИ У ПАЦИЕНТОВ С ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННОЙ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ
1ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва, Российская Федерация; 2ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, 129110, г Москва, Российская Федерация
Исследовали процесс восстановления периферических Т-лимфоцитов у пациентов с впервые выявленной множественной миеломой (ММ) после индукционного курса химиотерапии VCP. Обнаружили Т-лимфоцитоз у первичных пациентов, лимфопению по окончании курса терапии и полное восстановление количества Т-клеток до уровня у здоровых доноров в течение последующих 30 дней. По уровню Т-рецепторных эксцизионных колец (TREC) установили сниженный вклад тимуса в восстановление Т-клеточного звена иммунной системы из-за гипофункции тимуса у пациентов с впервые выявленной ММ. По увеличенному проценту пролиферирующих (Ki-67+) Т-клеток определили более значимый вклад вторичных лимфоидных органов в регенерацию периферического пула Т-лимфоцитов. Выявили характерную особенность первичных пациентов с ММ - наличие активного иммунного ответа, вероятно, противоопухолевого, о чем свидетельствовало повышение доли пролиферирующих Т-клеток, терминально-дифференцированных эффекторных Т-лимфоцитов, в основном CD8+, и индуцированных регуляторных Т-клеток.
Ключевые слова: Т-клетки; химиотерапия; лимфопения; тимопоэз; множественная миелома.
Mitin A.N.1, Litvina M.M.1, Donetskova A.D.1, Nikonova M.F.1, Komogorova V.V.1, Sharova N.I.1, Mitina T.A.2, Golenkov A.K.2, \Yarilin A.A.1
T LYMPHOCYTES RESTORATION DYNAMICS AFTER INDUCTION CHEMOTHERAPY IN PATIENTS WITH NEWLY DIAGNOSED MULTIPLE MYELOMA
'National Research Centre «Institute of Immunology» FMBA of Russia, 115478, Moscow, Russian Federation; Moscow regional research clinical institute named after M.F.Vladimirsky, 129110, Moscow, Russian Federation
The process of peripheral T lymphocytes restoration in patients with newly diagnosed multiple myeloma after induction chemotherapy (VCP) was investigated. We have revealed T lymphocytosis in patients with newly diagnosed multiple myeloma, lymphopenia after induction therapy and full restoration of T cells quantity in next 30 days. By means of TREC detection we have determined the reduced contribution of thymus in T-cell immunity restoration owing to thymic hypofunction in these patients. A greater contribution of secondary lymphoid organs in regeneration of peripheral T-lymphatic pool was determined by high percent of proliferating (Ki-67+) T cells. An active immune response as characteristic feature of primary patients with MM was revealed. This was evidenced by increase in the share of proliferating T cells, terminally differentiated effector T lymphocytes, mainly CD8+, and induced regulatory T cells.
Keywords: T cells; chemotherapy; lymphopenia; thymopoiesis; multiple myeloma.
Одним из методов лечения множественной миеломы (ММ), как и любого онкологического заболевания, является химиотерапия. Вследствие такой терапии, помимо редукции опухоли, развивается лимфопения, которая в наибольшей степени затрагивает Т-клеточное звено иммунной системы. Восстановление Т-лимфоцитов значительно отстает от регенерации миелоидных, ЫК- и В-клеток [1]. При этом численное восстановление Т-клеток зачастую не сопровождается восстановлением их нормального функционирования [2], что в свою очередь чревато развитием инфекционных осложнений и рецидивом заболевания. В здоровом организме регенерация Т-клеток в случае незаполнения Т-клеточной ниши осуществляется путем активации тимопоэза и гомеостати-ческой пролиферации периферических клонов Т-клеток, избежавших гибели в ходе проводимого лечения. Первый из этих механизмов приводит к заполнению ниши наивными Т-клетками с разнообразным репертуаром и способностью нормально функционировать. При гомеостатической пролиферации восстановление Т-клеток начинается немедленно, но сопровождается поликлональной активацией и конверсией фенотипа наивных Т-клеток в Т-клетки памяти, что приво-
Для корреспонденции: Митин Александр Ииколаевич, e-mail: mitin@inbox.ru
For correspondence: Mitin Alexander Nikolaevich, e-mail: mitin@inbox.ru
дит к сужению Т-клеточного репертуара, появлению ауторе-активных клонов и снижению пролиферативного потенциала [3]. Особенности гомеостаза Т-клеток при ММ определяются пожилым возрастом пациентов [4], наличием иммунного ответа на опухоль, в частности на экспрессируемые при ММ раково-тестикулярные антигены [5, 6], и видом проводимой терапии [7]. Учитывая значимость Т-клеточного звена иммунной системы в контроле опухолевого роста и предотвращении развития инфекционных осложнений, мы исследовали процесс восстановления периферических Т-лимфоцитов у пациентов с впервые выявленной ММ после индукционного курса химиотерапии VCP [7].
Материалы и методы
В исследование включили 19 здоровых доноров (средний возраст 46 (43,5-50) лет) и 15 пациентов (средний возраст 59 (53,5-67,5) лет), у которых впервые диагностирована ММ. Среди доноров было 9 мужчин и 10 женщин, среди пациентов - 6 мужчин и 9 женщин. У всех пациентов установлена III стадия ММ по D. Durie и соавт. [8]. По изотипу опухолевого парапротеина IgGk выявили у 5 пациентов, IgGA, у 3, IgAK у 3, IgMk у 1, BJk у 1, BJA, у 2. 13 пациентов имели сохраненную и компенсированную почечную функцию, у 2 отметили IV стадию хронической почечной недостаточности. У 2 пациентов в дебюте заболевания имелись внутриспинальные опухоли, компримирующие спинной мозг с развитием клиники нижнего парапареза. Перед исследованием пациенты
Рис. 1. Алгоритм гейтирования при определении функционально-возрастной структуры Т-лимфоцитов.
На графиках типа «дот-плот» по осям отражена интенсивность свечения флюорох-рома, соответствующего исследуемому маркеру. Сами клетки представлены в виде точек.
а - выделение гейта CD3+-клеток из лимфоцитарного пула; б - разделение CD3+-лимфоцитов на субпопуляции CD3+4+ и CD3+8+; в - анализ CD8+-Т-клеток по функционально-возрастному фенотипу; г - анализ CD4+-Т-клеток по функционально-возрастному фенотипу. Объяснения в тексте.
подписали информированное согласие на его проведение. Всем пациентам провели первый индукционный курс противоопухолевой терапии по протоколу VCP (велкейд 1,3 мг/м2 внутривенно (в/в) струйно в 1, 4, 8 и 11-е сутки; циклофос-фан 400 мг/м2 в/в струйно с 1-х по 4-е сутки; преднизолон 60 мг/м2 per оs с 1-х по 4-е сутки).
Забор периферической крови производили в пробирки с антикоагулянтом. Выделение мононуклеров периферической крови (МНПК) и последующий анализ проводили в течение последующих 6 ч. Клетки подсчитывали по общепринятой методике. МНПК выделяли на градиенте концентрации.
62L+
верхностным маркерам в том же буфере в течение 30 мин при 4°С. В случае определения внутриклеточных маркеров клетки отмывали и пермеабилизировали в течение 40 мин буфером фирмы eBioscience (США) («Foxp3 Fixation/Permeabilization Buffer») согласно методическим указаниям фирмы. Затем клетки отмывали и инкубировали в течение 30 мин при при 4°С в темноте с МАТ к FOXP3 и Ki-67, снова отмывали и сразу без фиксации анализировали на проточном ци-тометре. Учитывая минорность фракции FOXP3+ клеток, для уменьшения ошибки анализировали не менее 105 клеток, попадающих в гейт лимфоцитов. Лазерную цитометрию клеток осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson) в стандартном режиме. Данные анализировали с помощью программного обеспечения BD FACSDiva и FCS Express.
Использовали МАТ, меченные различными флюо-рохромами: FITC (флуоресцеина изотиоцианат), PE (фикоэритрин), PE-Cy7 (фикоэритрин-цианин-7), APC (алофикоцианин), eFluor 660 и APC-eFluor 780 (алофикоцианин-eFluor 780). Использовали следующие комбинации МАТ фирмы eBioscience (США) (препараты для изотипических контролей той же фирмы):
1. CD3-APC+CD4-FITC+CD8-APC-eFluor 780+CD45RA-PE-Cy7 + CD62L-PE;
2. CD3-APC+CD4-PE-Cy7+CD8-APC-eFluor 780+ki-67-FITC;
3. CD3-PE-Cy7+CD4-FITC+FOXP3-eFluor 660.
Алгоритм гейтирования функционально-
возрастной структуры по экспрессии маркеров CD45RA и CD62L представлен на рис. 1. Из лимфо-цитарного пула выделяют CD3+-клетки (см. рис. 1, а), по экспрессии CD4 и CD8 Т-клетки разделяют на CD3+4+- и CD3+8+-субпопуляции (см. рис. 1, б). Далее по экспрессии CD45RA и CD62L производят феноти-пический анализ функционально-возрастной структуры каждой субпопуляции (см. рис. 1, в, г). Наивные Т-клетки (Tnaive) имеют фенотип CD45RA+62L+, центральные Т-клетки памяти (Tcm) - CD45RA-эффекторные Т-клетки памяти (Tem) - CD45RA-62L-,
терминально-дифференцированные эффекторные или вновь экспрессирующие CD45RA Т-клетки (Temra) - CD45RA+62L-
[9].
Уровень TREC (T-cell receptor excision circles -Т-рецепторные эксцизионные кольца) определяли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. ДНК выделяли из 1 • 106 мононуклеаров периферической крови, использовали набор «Проба НК» («ДНК-Технология»). Объем полученной ДНК составил 25 мкл. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически, соотношение А/
Клетки суспензировали в PBS с 1% BSA и 0,1% NaN3, затем А280 составляло 1,6-2. Для постановки ПЦР применяли на-инкубировали с моноклональными антителами (МАТ) к по- бор реагентов TaqMan Universal PCR Master Mix Reagents Kit
Таблица 1
Изменение количества (в • 109/л) лимфоцитов и Т-клеток периферической крови у доноров и первичных пациентов с ММ до и по-
сле лечения
Показатель Квартиль Доноры До лечения По завершении лечения После восстановления
Лимфоциты H 1,67* 1,91 2,33** 2,86 0,89*,** 1,46 1,68 1,91
L 1,42 1,79 0,81 1,41
CD3+ H 1,16* 1,36 1 74** 2,01 0,63*,** 0,89 1,11 1,40
L 0,98 1,06 0,52 0,92
CD3+4+ H 0,71 0,88 0,88 1,26 0,49*,** 0,56 0,73 0,85
L 0,67 0,7 0,35 0,59
CD3+8+ H 0,37 0,46 0,57 1,03 0,13*,** 0,19 0,33 0,44
L 0,26 0,22 0,11 0,13
Примечание. Здесь и в табл. 2-5: * - р < 0,05 по отношению к показателям у первичных пациентов; ** - р < 0,05 по отношению к показателям у доноров.
иммунология № 4, 2014
0,18 л 0,160,140,120,100,080,060,040,02-о-
-0,02 -I
Рис. 2. Количественный вклад субпопуляций Т-клеток в общий прирост Т-клеток у первичных пациентов с ММ по сравнению с таковым у доноров. 1 - CD4+Tnaive; 2 - CD4+Tcm; 3 - CD4+Tem; 4 - CD4+Temra; 5 - CD8+Tnaive; 6 - CD8+Tcm; 7 - CD8+Tem; 5 -CD8+Temra. По оси ординат - разница в количестве клеток соответствующей субпопуляции (в млн/л) у первичных пациентов с ММ и здоровых доноров
(Applied Biosystems). Для определения содержания TREC использовали следующие праймеры: прямой 5'-CGTGAGAAC GGTGAATGAAGAGCAGACA-3'; обратный 5'-CATCCC TTTCAACCATGCTGACACCTCT-3'; флюоресцентно-меченный олигонуклеотид (зонд) 5'-FAM-TTTTTGTAAAGGTGC CCACTCCTGTGCACGGTGA-MGB-3' [10]. Для определения количества геномной ДНК применяли ß-актин (Applied Biosystems). Амплификацию проводили на приборе «7300 Applied Biosystems Real-time PCR System». Реакцию ставили в объеме 25 мкл по следующей программе: 1 цикл - 50°С в течение 2 мин, 95°С в течение 10 мин; 50 циклов - 94°С в течение 30 с, 60°С в течение 30 с.
Количество копий TREC определяли, используя стандартную кривую, построенную по разведениям плазмиды, синтезированной путем клонирования ДНК TREC человека в вектор pJet1.2/Blunt (Fermentas). Количество копий TREC рассчитывали автоматически с помощью программного обе-
спечения SDS (Applied Biosystems) при экстраполяции данных на стандартную кривую, полученную по разведениям плазмиды с известной концентрацией ДНК TREC. Количество копий TREC пересчитывали на 1 л крови и 1000 CD3+-клеток.
Результаты статистически обрабатывали, используя методы непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представляли в виде Ме (L-H), где Ме - медиана, L - нижний квартиль, Н - верхний. Для сопоставления двух групп по количественным признакам применяли б'-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р < 0,05. Обработку данных проводили с помощью программы Microsoft Excel.
результаты и обсуждение
При исследовании периферической крови у пациентов с впервые диагностированной ММ выявили лимфоцитоз, полностью обусловленный ростом количества Т-клеток (табл. 1). Основной вклад в рост количества CD3+-лимфоцитов вносили клетки с фенотипом CD3+8+62L-45RA+ - терминально-дифференцированных эффекторных Т-клеток (рис. 2) при одновременном статистически значимом увеличении их процента и снижении процента наивных CD8+-Т-клеток -CD3+8+62L+45RA+ (табл. 2, 3). Также отметили достоверный рост количества и процента CD3+4+FOXP3+-клеток (табл. 4, 5). В целом эта картина соответствовала описанному ранее активному Т-клеточному иммунному ответу на раково-тестикулярные антигены, экспрессируемые при ММ [11, 12]. Эта точка в нашем исследовании получила название «первичные».
Через 4 дня после проведения курса химиотерапии производили повторный забор крови у этих же пациентов. Эта точка в дальнейшем на графиках обозначалась как "лимфопения". Еще через 30 дней по окончании курса лечения при повторной госпитализации проводили последний анализ МНПК в точке, обозначенной на графиках как "восстановление". На 4-е сутки после окончания индукционного курса VCP отметили развитие лимфопении (см. табл. 1) с достоверным снижением количества всех субпопуляций Т-клеток, причем не только относительно первичных показателей, но также и относительно
Таблица 2
возрастная структура cD4+ Т-лимфоцитов периферической крови, определяемая по экспрессии cD62L и cD45RA, в процентах у доноров и первичных пациентов с ММ до и после лечения
Показатель Квартиль Доноры До лечения По завершении лечения После восстановления
CD62L+45RA+ H 31,2 47,1 28,3 39,9 36,4 40,1 39,3 43,6
L 23,9 22,1 23,2 26,5
CD62L+45RA- H 42,5 48,3 38,0 48,5 38,5 43,0 37,7 42,0
L 38,7 28,3 29,4 32,6
CD62L-45RA- H 20,8 25,2 26,0 30,1 18,3 22,7 20,8 30,4
L 13,5 15,6 16,5 15,0
CD62L-45RA+ H 1,2 2,4 3,0** 6,8 2,0 3,4 1,7 4,4
L 0,7 1,9 1,0 1,0
Таблица
возрастная структура cD8+ Т-лимфоцитов периферической крови, определяемая по экспрессии cD62L и cD45RA, в процентах у
доноров и первичных пациентов с ММ до и после лечения
Показатель Квартиль Доноры До лечения По завершении лечения После восстановления
CD62L+45RA+ H 37,4 45,5 20,2** 31,5 19,8** 11,4 15,2** 24,3
L 25,7 13,4 6,3 11,8
CD62L+45RA- H 9,9 15,3 7,5 9,9 7,5 13,5 7,1 9,2
L 6,4 5,6 6,1 5,5
CD62L-45RA- H 15,7 18,7 15,3 21,5 18,1 34,4 17,5 26,6
L 13,7 7,7 13,3 14,1
CD62L-45RA+ H 35,4 55,1 49,9** 62,4 45,7 50,1 55,6 62,7
L 18,9 41,5 36,6 38,5
Таблица 4
Изменение количества (в • 109/л) и процента регуляторных Т-клеток периферической крови у доноров и первичных пациентов с
ММ до и после лечения
Показатель Квартиль Доноры До лечения По завершении лечения После восстановления
CD3+4+FOXP3+, число клеток Н 0,026 0,048 0,040 0,059 0,018* 0,023 0,030 0,034
Ь 0,018 0,026 0,011 0,020
FOXP3+/CD3+4+, процент клеток Н 3,0* 4,5 4,6^ 6,3 3,9 5,4 3,8 5,8
Ь 2,4 3,6 2,9 3,0
Таблица 5
Изменение количества sjTREC (в • 106/л) в МНПК и их содержания в Т-клетках (на 1000 клеток) у доноров и первичных пациентов с ММ до и после лечения
Показатель Квартиль Доноры До лечения По завершении лечения После восстановления
Количество sjTRECs Н 5,66 11,46 4,85 8,51 1 64*,** 3,46 3,59** 4,36
Ь 3,68 3,37 1,06 1,97
sjTRECs/1000 CD3+-клеток Н 4,53 9,09 3,35** 4,85 2,58** 4,03 2,7^ 3,58
Ь 3,20 2,26 1,83 1,8
показателей у доноров. Исключение составили регуляторные Т-клетки - клетки с фенотипом CD3+4+FOXP3+ (см. табл. 4), часть из которых могла быть представлена активированными эффекторными Т-клетками с транзиторной экспрессией FOXP3 [13, 14]. Снижение количества клеток данного фенотипа было достоверным только по отношению к первичным пациентам, т. е. к собственным показателям до лечения. Более подробный анализ экспрессии FOXP3 будет представлен позднее. При восстановлении на 30-е сутки количество всех суб-
1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
1
! Первичные Лимфопения
I Восстановление
Рис. 3. Изменение количества лимфоцитов и Т-клеток периферической крови у пациентов с ММ до и после лечения, нормированное по показателям у здоровых доноров. 1 - лимфоциты; 2 - CD3+.
1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0
популяций Т-клеток приближалось к показателям у доноров, что особенно наглядно представлено на графиках, нормированных по количеству клеток соответствующих субпопуляций у доноров (рис. 3, 4).
Исследуя возрастную структуру Т-лимфоцитов, основываясь на литературных данных [15] и результатах наших исследований по восстановлению Т-клеточного звена иммунной системы у сублетально облученных мышей [16], мы предполагали, что обнаружим конверсию фенотипа наивных Т-клеток в Т-клетки памяти при восстановлении после проведенного курса химиотерапии. Однако процентное соотношение всех возрастных субпопуляций Т-клеток не претерпело никаких достоверных изменений в результате проведенного лечения и при последующем восстановлении численности клеток (см. табл. 2, 3). Тем не менее хотелось бы еще раз обратить внимание на отмеченную нами ранее особенность возрастной структуры CD3+8+-лимфоцитов, которая характеризуется уменьшением доли наивных и накоплением терминально-дифференцированных эффекторных клеток, не экспрессирующих CD62L, но при этом восстанавливающих экспрессию CD45RA. Это соотношение даже несколько изменялось в пользу CD3+8+62L-45RA+ в ходе курса проводимой химиотерапии, что являлось свидетельством сохранения иммунного ответа на клетки опухоли. Хотя стоит отметить, что, несмотря на увеличение доли этих клеток, различие с
1,8-1 1,61,4 -1,21,00,80,70,60,50,40,30,20,1 -о 4
1 2 Первичные Лимфопения
I Восстановление
% РОХРЗ+ среди Сй4+ Количество СОЗ+4+РОХРЗ+
Рис. 4. Изменение количества основных субпопуляций Т-клеток периферической крови пациентов с ММ до и после лечения, нормированное по показателям у здоровых доноров. 1 - CD3+CD4+; 2 - CD3+CD8+; 5 - CD3+4+FOXP3+.
Рис. 5. Изменение количества и процента FOXP3+-клеток в CD4+-субпопуляции Т-клеток периферической крови у пациентов с ММ до и после лечения, нормированное по показателям у здоровых доноров.
Здесь и на рис. 7: 1 - первичные; 2 - лимфопения; 3 - восстановление.
Рис. 6. Изменение процента пролиферирующих (Кл-67+) Т-клеток периферической крови у пациентов с ММ до и после лечения в сравнении с показателями у здоровых доноров.
1 - СБ3+4+; 2 - СБ+8+- По оси ординат - процент К>67+-клеток внутри соответствующей субпопуляции (Ме (Ь-И)). * -р < 0,05 относительно показателей в контроле.
донорами становилось статистически недостоверным скорее всего в силу большого разброса данных, что могло быть обусловлено разнородностью исследованной группы в контексте ответа на проводимое лечение. Среди CD4+-T-лимфоцитов также отметили статистически значимое увеличение процента клеток с фенотипом 62L-45RA+ у первичных пациентов, в ходе лечения процент этих клеток уменьшался, но не достигал уровня у здоровых доноров, что в целом не противоречит сделанному ранее предположению о сохранении Т-клеточного противоопухолевого ответа.
При исследовании CD4+FOXP3+ Т-клеток установили (рис. 5, см. табл. 4), что их изначально высокое содержание у первичных пациентов с ММ снижалось по окончании курса химиотерапии даже по отношению к таковому у здоровых доноров, но при этом отличие от показателей у доноров не являлось достоверным, и уже в точке «восстановление» превосходило показатели у доноров в 1,2 раза. Одновременно с этим процент FOXP3+-клеток среди CD3+4+-лимфоцитов значимо не менялся на всем протяжении процесса наблюдения за пациентами с ММ, оставаясь в 1,3-1,5 раза выше уровня у здоровых доноров. Как уже упоминалось ранее, клетки с фенотипом CD3+4+FOXP3+, представляя в основном фракцию регуляторных Т-клеток, также могли быть активированными эффекторными Т-клетками с транзиторной экспрессией FOXP3. И, даже рассматривая фракцию регуляторных Т-клеток с учетом быстрой динамики (порядка 1 мес) восстановления численности FOXP3+-клеток после проведенного курса химиотерапии, можно с большой долей уверенности говорить об адаптивной природе их происхождения, т. е. об индуцированных регуляторных Т-клетках. Таким образом, данные по экспрессии FOXP3, как и ранее описанное увеличение количества терминально-дифференцированных эффекторных Т-клеток, говорят о сохранении активного иммунного ответа у пациентов с первичной ММ на всем протяжении периода наблюдения.
Обнаружив достаточно полное восстановление Т-кле-точного звена иммунной системы после проведенного курса химиотерапии VCP, мы оценили вклад тимопоэза и гомео-статической пролиферации в восстановление численности Т-клеток. При исследовании пролиферативной активности по экспрессии внутриклеточного маркера пролиферации Ki-67 обнаружили, что доля пролиферирующих Т-клеток в 1,3-1,9 раза превышала показатели у доноров во всех точках исследования. До начала лечения увеличение процента Ki-67+-клеток было статистически значимым как внутри CD3+4+-, так и внутри CD3+8+-субпопуляций (рис. 6). На фоне развития лимфопении отметили выраженный (в 2,6 раза) рост про-
Рис. 7. Изменение количества sjTREСs и содержания sjTREСs в Т-клетках периферической крови у пациентов с ММ до и после лечения, нормированное по показателям у здоровых доноров.
цента пролиферирующих CD8+-Т-клеток, однако этот рост не был статистически достоверным по отношению к показателям, предшествующим лечению. Доля пролиферирующих клеток в остальных субпопуляциях Т-лимфоцитов, оставаясь выше показателей у доноров, значимо не изменялась в процессе лечения пациентов с ММ.
Вклад тимуса в восстановление Т-клеток оценивали по уровню TREC в лимфоцитах. TREC образуются при перестройке генов Т-клеточного рецептора и обнаруживаются в виде кольцевых молекул ДНК [17]. Вырезанное кольцо не реплицируется и при делении Т-клетки остается только в одной дочерней клетке, с каждым последующим делением количество TREC на общее количество дочерних Т-клеток уменьшается в геометрической прогрессии. Таким образом, уменьшение количества TREC по отношению к количеству Т-клеток отражает количество делений, которому подверглась популяция, а при одинаковом уровне пролиферации - степень ее зрелости. На рис. 7 представлены данные по количеству TREC в периферической крови и содержанию TREC на 1000 Т-клеток, нормированные по показателям у доноров. Отметили значимое снижение количества TREC после курса химиотерапии на 4-е сутки. При восстановлении количество TREC увеличивалось, но не достигало уровня у первичных пациентов. Показатель же содержания TREC на 1000 Т-клеток был достоверно ниже, чем у доноров, на все сроки до и после химиотерапии. Выявленное повышение уровня TREC без увеличения доли TREC-содержащих Т-клеток свидетельствовало о преобладании вклада пролиферации в восстановление периферических Т-клеток. Однако ввиду высокого уровня пролиферации у первичных пациентов до начала лечения мы не смогли определить природу ее происхождения - го-меостатическую или индуцированную иммунным ответом на опухолевые антигены.
Изначально же сниженное содержание TREC на 1000 Т-клеток у первичных пациентов с ММ (3,35 копии) по сравнению с таковым у здоровых доноров (4,53 копии) объясняли повышенной пролиферативной активностью периферических Т-клеток и инволюцией тимуса у пациентов, которая обусловлена самим заболеванием и возрастом пациентов (средний возраст 59 лет у больных и 46 лет у доноров).
Подводя итоги, можно констатировать, что у пациентов с впервые выявленной ММ наблюдается Т-лимфоцитоз, обусловленный активным противоопухолевым ответом. После индукционного курса химиотерапии по протоколу vCP развивается Т-лимфопения с последующим восстановлением всех субпопуляций Т-клеток до уровня у здоровых доноров и сохранением активного противоопухолевого ответа. В восстановлении Т-клеточного звена иммунной системы принимают участие как центральные органы через тимопоэз, так и
периферический отдел иммунной системы путем усиления пролиферативной активности Т-клеток с преобладанием вклада последнего.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований РАН России; грант 11-04-01741-а.
литература
1. Hakim F. T., Cepeda R., Kaimei S. et al. Constraints on CD4 recovery postchemotherapy in adults: thymic insufficiency and apoptotic decline of expanded peripheral CD4 cells. Blood. 1997; 90: 3789-98.
2. Small T.N., Papadopoulos E.B., Boulad F. et al. Comparison of immune reconstitution after unrelated and related T-cell-depleted bone marrow transplantation: effect of patient age and donor leukocyte infusions. Blood. 1999; 93: 467-80.
3. Ярилин А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов. Иммунология. 2004; 25 (5): 312-20.
4. Ярилин А.А. Возрастные изменения тимуса и Т-лимфоцитов. Иммунология. 2003; 24 (2): 117-28.
5. van Baren N., Brasseur F., Godelaine D. et al. Genes encoding tumor-specific antigens are expressed in human myeloma cells. Blood. 1999; 94: 1156-64.
6. Jungbluth A.A., Ely S., DiLiberto M. et al. The cancer-testis antigens CT7 (MAGE-C1) and MAGE-A3/6 are commonly expressed in multiple myeloma and correlate with plasma-cell proliferation. Blood. 2005; 106: 167-74.
7. Голенков А.К., Барышников А.Ю., Караулов А.В., Митина Т.А. Лечение множественной миеломы. М.; 2008.
8. Durie B.G.M., Harousseau J.L., S. Miguel J., Blade J. et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia. 2006; 20 (9): 1467-73.
9. Appay V., van Lier R.A, Sallusto F., Roederer M. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: consensus and issues. Cytometry A. 2008; 73 (11): 975-83.
10. Hochberg E. P., Chillemi A.C., Wu C.J. et al. Quantitation of T-cell neogenesis in vivo after allogeneic bone marrow transplantation in adults. Blood. 2001. 98: 1116-21.
11. Goodyear O.C., Pratt G., McLarnon A. et al. Differential pattern of CD4+ and CD8+ T-cell immunity to MAGE-A1/A2/A3 in patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and multiple myeloma. Blood. 2008; 112: 3362-72.
12. Atanackovic D., Arfsten J., Cao Y. et al. Cancer-testis antigens are commonly expressed in multiple myeloma and induce systemic immunity following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 2007; 109: 1103-12.
13. Allan S.E., Crome S.Q., Crellin N.K. et al. Activation-induced FOXP3 in human T effector cells does not suppress proliferation or cytokine production. Int. Immunol. 2007; 19: 345-54.
14. Wang J., Ioan-Facsinay A., vander Voort E.I., Huizinga T.W., Toes R.E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+T cells. Eur. J. Immunol. 2007; 37: 129-38.
15. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naïve cells into memory-phenotype cells. Nature Immunol. 2011; 12 (6): 478-84.
16. Митин А.Н., Литвина М.М., Комогорова В.В., Шарова Н.И., Ярилин А.А. Вклад гомеостатической пролиферации и связанных с ней процессов в восстановление популяции периферических Т-клеток в условиях лимфопении, индуцированной облучением. Иммунология. 2013; 34(5): 242-7.
17. Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F. et al. Changes in thymic function with age and during
the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396 (6712): 690-5.
Поступила 25.04.14
references
1. Hakim F.T., Cepeda R., Kaimei S. et al. Constraints on CD4 recovery postchemotherapy in adults: thymic insufficiency and apoptotic decline of expanded peripheral CD4 cells. Blood. 1997; 90: 3789-98.
2. Small T.N., Papadopoulos E.B., Boulad F. et al. Comparison of immune reconstitution after unrelated and related T-cell-depleted bone marrow transplantation: effect of patient age and donor leukocyte infusions. Blood. 1999; 93: 467-80.
3. Yarilin A.A. Homeostatic processes in immune system. Lymphocytes quantity control. Immunologiya. 2004; 25 (5): 312-20. (in Russian)
4. Yarilin A.A. Age-related changes of thymus and T lymphocytes. Immunologiya. 2003; 24 (2): 117-28. (in Russian)
5. van Baren N., Brasseur F., Godelaine D. et al. Genes encoding tumor-specific antigens are expressed in human myeloma cells. Blood. 1999; 94: 1156-64.
6. Jungbluth A.A., Ely S., DiLiberto M. et al. The cancer-testis antigens CT7 (MAGE-C1) and MAGE-A3/6 are commonly expressed in multiple myeloma and correlate with plasma-cell proliferation. Blood. 2005; 106: 167-74.
7. Golenkov A.K., Baryshnikov A.Yu., Karaulov A.V., Mitina T.A. Multiple Myeloma Treatment. [Lechenie mnozhestvennoy miwlomy]. Moscow; 2008. (in Russian)
8. Durie B.G.M., Harousseau J.L., S. Miguel J., Blade J. et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia. 2006; 20 (9): 1467-73.
9. Appay V., van Lier R.A, Sallusto F., Roederer M. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: consensus and issues. Cytometry A. 2008; 73 (11): 975-83.
10. Hochberg E. P., Chillemi A.C., Wu C.J. et al. Quantitation ofT-cell neogenesis in vivo after allogeneic bone marrow transplantation in adults. Blood. 2001. 98: 1116-21.
11. Goodyear O.C., Pratt G., McLarnon A. et al. Differential pattern of CD4+ and CD8+ T-cell immunity to MAGE-A1/A2/A3 in patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) and multiple myeloma. Blood. 2008; 112: 3362-72.
12. Atanackovic D., Arfsten J., Cao Y. et al. Cancer-testis antigens are commonly expressed in multiple myeloma and induce systemic immunity following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 2007; 109: 1103-12.
13. Allan S.E., Crome S.Q., Crellin N.K. et al. Activation-induced FOXP3 in human T effector cells does not suppress proliferation or cytokine production. Int. Immunol. 2007; 19: 345-54.
14. Wang J., Ioan-Facsinay A., vander Voort E.I., Huizinga T.W., Toes R.E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+T cells. Eur. J. Immunol. 2007; 37: 129-38.
15. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naïve cells into memory-phenotype cells. Nature Immunol. 2011; 12 (6): 478-84.
16. Mitin A.N., Litvina M.M., Komogorova V.V., Sharova N.I., Yarilin A.A. Contribution of homeostatic proliferation and related processes to restoration of peripheral T cell population in irradiation induced lymphopenia. Immunologiya. 2013; 34 (5): 242-7. (in Russian)
17. Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., Gage E.A., Massey J.M., Haynes B.F. et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 1998; 396 (6712): 690-5.
Received 25.04.14
