CC BY
29
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579,842.1/.2 © Коллектив авторов, 2015
Ю.З. Габидуллин, Р.С. Суфияров, М.М. Туйгунов, М.Ю. Градусова, А.Ю. Лазарева ВЛИЯНИЕ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER SPP., CITROBACTER SPP., SERRATIA SPP., E.COLI, PROTEUS SPP.
И ИХ СОКУЛЬТИВИРУМЫХ ВАРИАЦИЙ НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ
В статье приведено сравнение влияния монокультур и сокультивируемых вариаций отдельных представителей условно-патогенных энтеробактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. на фагоцитарный процесс, который направлен на уничтожение чужеродного материала. Нарушение фагоцитоза под действием монокультур и ассоциаций условно-патогенных энтеробактерий может привести к иммунной недостаточности, поскольку нарушаются процессы продукции противовоспалительных цитокинов и хемокинов, процессинга бактериальных антигенов и презентации их эффекторами врожденного иммунитета Т-лимфоцитам. Было проведено сравнение показателей активности и интенсивности фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей, которые являются критерием при оценки иммунного статуса хозяина.
Эксперименты проводились на белых мышах-самцах линии СВА в количестве 100 животных в контрольной группе и по 100 животных в каждой экспериментальной группе. Оценку всех тестируемых параметров проводили через 12 - 36 - 72 часа после инокуляции монокультур и сокультивируемых вариаций.
Ключевые слова: бактерии, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., сокультивируемые вариации, фагоцитарный процесс, чужеродный материал, фагоцитоз, активность фагоцитоза, интенсивность фагоцитоза, иммунная недостаточность, бактериальные антигены, перитонеальные макрофаги мышей.
Yu.Z. Gabidullin, R.S. Sufiyarov, M.M. Tuigunov, M.Yu. Gradusova, A.Yu. Lazareva INFLUENCE OF STRAINS OF BACTERIA ENTEROBACTER SPP., CITROBACTER SPP., SERRATIA SPP., E.COLI, PROTEUS SPP. SPECIES
AND THEIR CO-CULTIVATED VARIATIONS ON PHAGOCYTE ACTIVITY OF PERITONEAL MICE MACROPHAGES
The paper presents a comparison of the influence of monocultures and co-cultivated variations of some species of opportunistic pathogenic species Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. on phagocyte activity, directed to foreign substances elimination. Phagocytosis impairment can result in immune failure because the processes of detection of anti-inflammatory cytokines and chemokines production, processing of bacterial antigens and their presentation by effectors of hereditary immunity for T-lymphocytes are disturbed. The research was undertaken to study phagocyte activity and intensity indicators for mice peritoneal macrophages, which are the indices of their functional state.
The experiments were carried out on white male mice of CBA series. Both the experimental and control groups consisted of 100 animals. All the tested parameters were evaluated after 12-36-72 hours following the inoculation of monocultures and co-cultivated variations.
Key words: bacteria, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., co-cultivated variations, phagocytic process, foreign material, phagocytosis, phagocytosis activity, phagocytosis intensity, immune failure, bacterial antigens, mice peritoneal macrophages.
Выделенные при различных инфекционных процессах культуры условно-патогенных энтеробактерий характеризуются наличием ряда свойств, определяющих их потенциальную способность выживать в условиях внутренней среды макроорганизма благодаря их способности прикрепляться к энтероцитам и колонизировать их поверхность, а также противостоять факторам специфической резистентности организма хозяина [3]. Механизм взаимодействия многих патогенов с клеткой хозяина отличается значительной вариабельностью и неспецифичностью, что предопределяет многообразие клинических проявлений инфекционных процессов, вызванных ассоциациями микроорганизмов [8]. В связи с этим на сегодняшний день особую актуальность приобретает изучение особенно-
стей и характера взаимоотношений микроорганизмов в системе «патоген - хозяин».
Защита организма от факторов окружающей среды в значительной мере связана с макрофагами, которые могут действовать самостоятельно или в совокупности с клетками воспаления или иммунной системы в целом. В основе защитной функции макрофагов лежит фагоцитарный процесс, который направлен на уничтожение чужеродного агента.
Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования явилось сравнительное изучение фагоцитарной активности перитоне-альных макрофагов при воздействии монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp.
Материал и методы
Эксперименты проводились на белых мышах-самцах линии СВА. Всего было задействовано 300 особей: 100 животных в контрольной группе и по 100 животных в каждой экспериментальной группе:
группа I - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли внутрибрю-шинным введением смеси бульонных монокультур Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., содержащих LT-энтеротоксин в дозе LD50 - 5-108 КОЕ/мл;
группа II - моделирование экспериментальной инфекции осуществляли внутрибрю-шинным введением смеси сокультивируемых вариаций: Enterobacter spp.+Citrobacter spp., Enterobacter spp.+Serratia spp., Citrobacter spp.+Serratia spp, Enterobacter spp.+E.coli, Citrobacter spp.+E.coli, Serratia spp.+E.coli, Proteus spp.+Enterobacter spp., Proteus spp.+Citrobacter spp., Proteus spp.+Serratia spp., Proteus spp.+E.coli штаммов, содержащих LT-энтеротоксин в дозе LD50 - 5-108 КОЕ/мл;
группа III (контрольная) - проводилось введение стерильного бульона Хоттингера для исключения влияния внешних и внутренних факторов на характеристики оцениваемых иммунологических параметров.
Нами также были использованы штаммы E.coli ГИСК №280 (патент № 2293765); E.coli ГИСК №281 (патент № 2293764), которые были депонированы и запатентованы в Государственном НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича, данные штаммы являются приоритетными как суперпродуценты термолабильного энтеротоксина.
При введении животным дозы LD50 развивался инфекционный процесс, сопровождающийся выраженным снижением аппетита, веса, двигательной активности и изменением общего состояния, а также состояния шерстяного покрова [5]. Данный подход исследований продиктован тем, что липополисахарид (ЛПС) клеточной стенки бактериальной клетки является мощным иммуномодулятором таким, как и энтеротоксин. Комбинация их в эксперименте обеспечила дифференциальное влияние LT-энтеротоксина и ЛПС на клетки организма хозяина.
Фагоцитарную активность исследуемых клеток оценивали по их способности к захвату частиц полистирольного латекса. В основе этого метода лежит выделение макрофагов (Мф) и моноцитов (Мн) из перитонеального экссудата мыши. Сепарацию фагоцитирующих клеток проводили следующим образом:
резидентные ПМф у мышей получали промыванием брюшной полости охлажденной средой 199 с гепарином в концентрации 10 ед/мл или раствором Хенкса. Клетки после отмывания разводили до концентрации 106 клеток на 1 мл средой 199, содержащей 200 мг/л Ь -глютамина, и вносили по 1 мл в «сапожки», на дне которых помещались покровные стекла. Инкубированные в течение 1 часа при температуре 37°С Мф прочно прикреплялись к поверхности стекла. Монослойную культуру 3 раза промывали раствором Хенкса. В полученной популяции клеток Мф составляли 2535%, лимфоциты 60-70%. Примесь грануло-цитов не превышала 5%. Селезенку после извлечения и взвешивания разрезали ножницами на несколько частей и помещали в стеклянный гомогенезатор Поттера с неплотно притертым пестиком и путем 2-3 тракций выдавливали клеточную массу в охлажденную среду 199. Кровь у животных забирали из ре-троорбитального синуса в силиконированные пробирки с 50 Ед гепарина [5].
Мононуклеарные клетки периферической крови получали путем градиентного центрифугирования в феколл-верографине 1,077) в течение 30 минут при 1500 об/мин. Клетки белого кольца отсасывали в силиконовые пробирки [5].
Полученные суспензии клеток фильтровали через слой капроновой сетки, отмывали средой 199 посредством центрифугирования в течение 10 минут при 1000 об/мин. Осадок ресуспензировали в необходимом количестве охлажденной среды 199 и определяли число клеток в камере Горяева. С помощью 0,1% раствора трепанового синего подсчитывали количество живых клеток. Полученные клеточные взвеси разводили средой 199 до нужной концентрации и использовали для постановки реакций.
Фагоцитарную активность исследуемых клеток определяли по их способности к захвату частиц полистирольного латекса. В основе метода лежит выделение Мф и Мн из клеточной суспензии в процессе культивирования, связанное с их адгезивной способностью (метод Хейфетца Л. Б.) [4].
К прилипшим и отмытым культурам мононуклеаров добавляли 0,1 мл взвеси стандартных частиц латекса диаметром 1,7 мкм в концентрации 108 частиц/мл. Через 1 час культивирования в термостате при 37°С препараты ополаскивали в растворе Хенкса, монтировали на предметном стекле, фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому -Гимзе [8]. Микроскопию проводили с иммер-
сией. Учитывали активность фагоцитоза -количество мононуклеарных фагоцитов, содержащих частицы латекса в цитоплазме - и его интенсивность - число частиц латекса в 100 подсчитанных клетках в пересчете на 1 клетку или 100 клеток [4].
Статистическая обработка результатов проводилась общепринятыми методами вариационной статистики, а также с помощью компьютерной программы для статистических расчетов «StatBase» [1].
Результаты и обсуждение
В основе защитной функции макрофагов лежит фагоцитарный процесс, который направлен на уничтожение чужеродного материала. Взаимодействие микроорганизмов с макрофагами влечет за собой несколько последствий. Если микроорганизмы захватываются и перевариваются внутри макрофагов, то эти события могут оказаться достаточными для предотвращения дальнейшего развития инфекционного процесса. Однако многие патогенные и условно-патогенные микроорганизмы в процессе эволюции паразитизма приобрели эффективные пути ускользания от действия фа-
Увеличение активности фагоцитоза можно объяснить тем, что при изучении иммунологических показателей реализуется суммация воздействия двух патогенов на активацию иммунных клеток.
Это зависит от многих причин, в частности от наличия синергизма или антагонизма внутриклеточных сигналов, возникающих между микроорганизмами.
Исходя из вышеизложенного в следующей серии опытов нами было проведено изучение интенсивности фагоцитоза при действии монокультур и сокультивирумых вариаций
гоцитарных клеток; некоторые из них способны противостоять поглощению фагоцитами, другие активно внедряются в антигенпрезен-тирующий комплекс (АПК) и свободно развиваются и реплицируются в клетках [9]. Нарушение фагоцитоза может привести к иммунной недостаточности, поскольку нарушаются распознавание продукции противовоспалительных цитокинов и хемокинов, процессинг бактериальных антигенов и презентация их эффекторами врожденного иммунитета Т-лимфоцитам [2]. Исходя из вышеизложенного нами были сравнительно изучены активность и интенсивность фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей под действием монокультур и сокультивируемых вариаций Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp, являющихся показателем их функционального состояния.
Результаты изучения активности фагоцитоза выявили тенденцию к увеличению показателей активности фагоцитоза во всех экспериментальных группах с первых 12 часов исследования (рис.1). Статистическая обработка результатов приведена в табл. 1.
Таблица 1
Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. (рис. 2). Результаты статистической обработки представлены в табл. 2.
Результаты исследований показали отсутствие существенных различий в интенсивности фагоцитоза макрофагов у мышей, зараженных монокультурами бактерий Enterobac-ter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp., тогда как при сравнительном изучении активности фагоцитоза макрофагов монокультур и сокультивируемых вариаций обнаружена тенденция к увеличению изучаемого признака.
Активность фагоцитоза монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp.
Активность фагоцитоза культуры бактерий Сроки исследования, часы после введения культур
12 часов 36 часов 72 часа
Enterobacter spp. (LT+) 30,92±9,53% 46,4±2,79% 58,33±9,53%
Citrobacter spp. (LT+) 33,6±4,51% 40,80±3,67% 59,09±8,59%
Serratia spp. (LT+) 33,0±3,1% 44,2±1,99% 55,4±11,1%
E.coli (LT+) 29,2±2,32% 40,28±7,36% 50,32±4,68%
Proteus spp. (LT+) 34,3±18,23% 46,0±6,14% 56,0±6,19%
Ent.(LT+)+Citr. (LT+) 50,3±0,33% 77,8±7,8% 87,8±7,8%
Ent.(LT+)+Ser. (LT+) 55,5±0,75% 63,17±3,83% 87,7±1,77%
Citr. (LT+)+Ser. (LT+) 59,9±0,99% 78,8±1,18% 90,8±1,88
Ent. (LT+)+E.coli (LT+) 53,03±1,33% 67,17±1,17% 79,99±2,19%
Citr.(LT+)+E.coli (LT+) 59,3±1,33% 66,8±2,68% 78,2±2,82%
Serr.(LT+)+E.coli (LT+) 55,5±0,75% 69,5±2,75% 85,5±2,45%
Prot.(LT+)+Ent.(LT+) 53,33±0,33% 68,8±2,68% 85,2±2,82%
Prot.(LT+)+Citr.(LT+) 55,5±0,75% 67,7±2,73% 86,6±2,64%
Prot.(LT+)+Serr. (LT+) 54,4±0,76% 67,8±2,20% 84,22±2,82%
Prot.(LT+)+E.coli (LT+) 51,3±0,77% 66,6±2,44% 85,5±2,55%
Контроль 21,3±0,77% 20,6±2,44% 20,5±2,55%
^ / / / / ^ <?• & $ $ / ¿у л? V ^ Xs Vv Jkf vV vV * v7
Л
л
■ч»"4 ¿г
Рис. 1. Влияние монокультур и сокультивируемых Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, полученных через 12, 36 и 72 часа после инокуляции (активность фагоцитоза), %
Рис. 2. Влияние монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp. на фагоцитарную интенсивность перитонеальных макрофагов, полученных через 12, 36 и 72 часа после инокуляции (интенсивность фагоцитоза), усл. ед.
Интенсивность фагоцитоза монокультур и сокультивируемых вариаций бактерий родов Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E. coli, Proteus spp.
Таблица 2
Интенсивность фагоцитоза культуры бактерий Сроки исследования, часы после введения культур
12 часов 36 часов 72 часа
Enterobacter spp. (LT+) 375,55±1,15 усл.ед. 384,6±6,44 усл.ед. 393,33±7,67 усл.ед.
Citrobacter spp. (LT+) 376,66±4,34 усл.ед. 385,88±4,12 усл.ед. 395,68±4,32 усл.ед.
Serratia spp. (LT+) 378,85±1,15 усл.ед. 387,8±2,21 усл.ед. 396,12±2,88 усл.ед.
E.coli (LT+) 375,58±4,42 усл.ед. 385,88±2,22 усл.ед. 394,2±2,8 усл.ед.
Proteus spp. (LT+) 377,77±2,33 усл.ед. 387,99±2,11 усл.ед. 398,68±1,32 усл.ед.
Ent.(LT+)+Citr. (LT+) 390,3±0,77 усл.ед. 417,8±2,22 усл.ед. 435,2±2,88 усл.ед.
Ent.(LT+)+Ser. (LT+) 400,25±0,75 усл.ед. 422,8±3,22 усл.ед. 434,4±2,60 усл.ед.
Citr. (LT+)+Ser. (LT+) 390,8±1,22 усл.ед. 417,8±2,22 усл.ед. 435,5±4,55 усл.ед.
Ent. (LT+)+E.coli (LT+) 388,8±1,22 усл.ед. 415,5±2,55 усл.ед. 433,33±2,77 усл.ед.
Citr.(LT+)+E.coli (LT+) 393,3±0,77 усл.ед. 416,5±3,55 усл.ед. 430,3±2,22 усл.ед.
Serr.(LT+)+E.coli (LT+) 379,9±1,11 усл.ед. 407,5±2,55 усл.ед. 426,6±2,44 усл.ед.
Prot.(LT+)+Ent.(LT+) 386,6±0,44 усл.ед. 403,8±2,22 усл.ед. 422,2±2,88% усл.ед.
Prot.(LT+)+Citr.(LT+) 391,1±0,99 усл.ед. 410,5±1,55 усл.ед. 425,5±5,55 усл.ед.
Prot.(LT+)+Serr. (LT+) 387,7±0,33 усл.ед. 408,88±2,22 усл.ед. 428,5±1,55 усл.ед.
Prot.(LT+)+E.coli (LT+) 395,5±0,75 усл.ед. 415,8±4,22 усл.ед. 430,3±1,77 усл.ед.
Контроль 302,3±1,77 усл.ед. 300,6±2,44 усл.ед. 303,5±2,55 усл.ед.
Заключение
Таким образом, действие монокультур бактерий Enterobacter spp., Citrobacter spp., Serratia spp., E.coli, Proteus spp. способно увеличивать показатели активности и интенсивности фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей, тогда как суммарное действие сокуль-
тивируемых вариаций штаммов, продуцирующих LT-энтеротоксин (LT+)+(LT+), оказывает более выраженное влияние на вышеуказанные признаки, что может служить предпосылкой к отнесению ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae к этиологически значимым.
Сведения об авторах статьи: Габидуллин Юлай Зайнуллович - к.м.н., ассистент кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: guz010877@mail.ru.
Суфияров Ринат Сабитович - д.м.н., профессор кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: rinat suf@mail.ru.
Туйгунов Марсель Маратович - д.м.н., зав. кафедрой микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: tuygunov@mail.ru.
Градусова Мария Юрьевна - студентка ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: gradusova@mail.ru.
Лазарева Анна Юрьевна - студентка ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: nyrok.laz@gmail.com.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях. / И. П. Ашмарин, А.А. Воробьев. - Спб.: изд-во мед. литературы, 1962. - С.180.
2. Бухарин, О.В. Механизмы выживания бактерий. / О.В. Бухарин, А.Л. Гинцбург, Ю.М. Романова, Г.И. Эль-Регистан. - М.: Медицина. - 2005. - 367 с.
3. Бухарин, О.В. Экологическая детерминированность внутривидового разнообразия патогенных бактерий / О.В. Бухарин, В.А. Гриценко // Микробиолог. - 2000. - №1. - С.103-105.
4. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и гомеостаз / И.И. Долгушин, О.В. Бухарин. - Екатеринбург, 2001. - 259 с.
5. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов: монография/ И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А. Ю. Савочкина. - М.: РАМН, 2009. - 208 с.
6. Ивашина, И.Б. Большой практикум «Микробиология». / И.Б. Ивашина. - М.: Проспект науки, 2014. - 112 с.
7. Камышева, К. С. Микробиология, основы эпидемиологии и методы микробиологических исследований / К.С. Камышева. -Ростов: Феникс, 2014. - С. 346.
8. Хуснутдинова, Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека: автореф. дис.... канд. мед. наук. - Оренбург, 2004. - 23 с.
9. Шишкова, Ю.С. Роль нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек: автореф. дис.. д-ра мед. наук. - Челябинск, 2010. - 38 с.
УДК 616-009.28
© Р.А. Ибатуллин, Р.В. Магжанов, В.Ф. Туник, 2015
Р.А. Ибатуллин1, Р.В. Магжанов1, В.Ф. Туник2 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ КАБИНЕТА БОТУЛИНОТЕРАПИИ В РЕСПУБЛИКАНСКОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ БОЛЬНИЦЕ (Г. УФА)
1ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа 2ГБУЗ «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова», г. Уфа
С 2012 г. на базе поликлиники Республиканской клинической больницы (г. Уфа) организована работа кабинета боту-линотерапии. Наиболее эффективна ботулинотерапия при спастической кривошее, блефароспазме, лицевом гемиспазме, спастических состояниях, вызванных детским церебральным параличом, инсультом и рядом других неврологических заболеваний. Ежедневно на прием в кабинет ботулинотерапии обращаются от 2 до 5 и более пациентов. Одной из причин недостаточной эффективности работы кабинета ботулинотерапии является малая осведомленность врачей и пациентов о показаниях и преимуществах такого вида специализированной помощи больным. Дальнейшему совершенствованию работы кабинета будут способствовать внедрение новых современных методов исследования и лечения, изучение эпидемиологии экстрапирамидных заболеваний в РБ, широкое информирование медицинских работников и пациентов.
Ключевые слова: ботулинотерапия, кабинет ботулинотерапии, мышечные дистонии.
R.A. Ibatullin, R.V. Magjanov, V.F. Tunik MANAGEMENT OF THE CENTER OF BOTULINUM TOXIN THERAPY IN REPUBLICAN CLINICAL HOSPITAL (CITY OF UFA)
The Center of botulinum toxin therapy in Republican Clinical Hospital (city of Ufa) was founded in 2012. Botulinum toxin therapy is the most effective in cervical dystonia, blepharospasm, facial hemispasm, spasticity related to cerebral palsy, stroke and other neurological disorders. Up to 5 patients and more come to the Center every day. One of the causes of relatively low effectiveness of the work of the Center is little awareness of physicians and patients about indications and advantages of such specialized method of treatment. Further optimization of the work at the Center will make possible implementation of new methods of diagnosing and treatment and study of epidemiology of extrapyramidal diseases in the Republic of Bashkortostan as well as promoting public awareness of health care professionals and patients.
Key words: center of botulinum toxin therapy, botulinum toxin therapy, muscular dystonias.
Ботулинотерапия (БТ) - это метод лечения ботулотоксином различных заболеваний, проявляющихся мышечным спазмом, болью и вегетативной дисфункцией. Ботулинический токсин типа А (БТ-А) является наиболее сильнодействующим из 7 нейротоксинов, вы-
рабатываемых анаэробом Cl. botulinum. Принцип действия БТ-А заключается во временном блоке передачи импульса с нервного волокна на мышцу, в результате чего мышца ослабевает. Локальное введение БТ-А в лечебных дозах приводит к развитию дозозави-
