CC BY
158
УДК 576.851.49:579.842.17:612.112.3.014.46:578.08
© В.М. Изикаев, З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева, Р.С. Суфияров, Р.Р. Суфияров, А.А.Камалова, Ю.З. Габидулин, 2011
В.М. Изикаев, З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева, Р.С. Суфияров,
Р.Р. Суфияров, А.А.Камалова, Ю.З. Габидулин ИССЛЕДОВАНИЕ ФАГОЦИТОЗА И КИСЛОРОДЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ МЫШЕЙ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ СОКУЛЬТИВИРУЕМЫХ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER CLOACAE И STAPHYLOCOCCUS AUREUS ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Изучены фагоцитарная и метаболическая активность перитонеальных макрофагов (ПМф) мышей на модели острой экспериментальной инфекции. Результаты показали, что энтеротоксигенные культуры E.cloacae и St.aureus при совместном культивировании проявляют более агрессивное действие на фагоцитоз и внутриклеточный метаболизм ПМф мышей в сравнении с энтеротоксигенной монокультурой E.cloacae. Данный факт может иметь клиническое значение в диагностике гнойно-воспалительных процессов в случае обнаружения микст-инфекции.
Ключевые слова: термолабильный энтеротоксин, перитонеальный макрофаг, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus, фагоцитоз, кислородзависимый метаболизм.
V.M. Izikayev, Z.G. Gabidullin, A.A. Akhtariyeva, R.S. Sufiyarov,
R.R. Sufiyarov, A.A.Kamalova, Yu.Z. Gabidulin INVESTIGATION OF PHAGOCYTOSIS AND OXYGEN-DEPENDENT METABOLISM OF PERITONEAL MACROPHAGES IN MICE AFTER EXPOSURE TO CO-CULTURED BACTERIA ENTEROBACTER CLOACAE AND STAPHYLOCOCCUS AUREUS
We have studied the phagocytic and metabolic activities of peritoneal macrophages (PMph) in murine acute experimental infection models. The results have shown that activity of phagocytosis and intracellular metabolism of peritoneal macrophages in mice is strongly depressed by the influence of co-cultured enterotoxigenic Enterobacter cloacae and Staphylococcus aureus in contrast to enterotoxigenic E.cloacae monoculture. The given fact can have a clinical significance in diagnosing purulent-inflammatory processes in cases of mixed infections.
Key words: thermolabile enterotoxin, peritoneal macrophage, Enterobacter cloacae, Staphylococcus aureus, phagocytosis, oxygen-dependent metabolism.
В преодолении защитной функции иммунной системы при инфекционных процессах важную роль играют особенности реагирования клеточных факторов врожденного иммунитета в ответ на возбудителя. Одними из главных клеток врожденного иммунитета, осуществляющих первую линию защиты организма от инфекции, являются макрофаги. В основе их защитной функции лежит фагоцитарный процесс, заключающийся в их способности поглощать и уничтожать чужеродный материал. Активация фагоцитов сопровождается усилением кислородного метаболизма - респираторного взрыва, характеризующегося резким увеличением потребления кислорода клеткой и образованием активных форм кислорода: синглетного кислорода, перекиси водорода, гидроксильного радикала, обладающих мощным бактерицидным действием [7].
Функциональные возможности фагоцитов могут меняться при действии разных объектов фагоцитоза [2].
Течение и исход ассоциированных инфекций, вызванных представителями разных таксономических групп, в значительной мере определяются адекватной реакцией фагоцитирующих клеток, поэтому оценка фагоцитоза
и кислородзависимого метаболизма перитонеальных макрофагов может иметь клиническое значение для диагностики ассоциированных инфекций, что и явилось целью настоящих исследований.
Mатериал и методы
В работе был использован депонированный нами в музее бактериальных культур ГИСК им. Л.А.Тарасевича клинический штамм E.cloacae №258, обладающий комплексом факторов патогенности, среди которых ведущим является продукция LT-энтеротоксина (патент на изобретение №2164942 от 10.04.2001), и клинический штамм St.aureus, выделенный из гноя больного с абсцессом легкого.
Для экспериментов были использованы белые мыши линии СВ А.
Модель острой экспериментальной инфекции воспроизводили в 2-х экспериментальных группах:
I группа: осуществляли внутрибрю-
шинное введение сокультивируемых бульонных культур E.cloacae №258 и St.aureus в дозе LD50 - 5х1014 КОЕ/мл.
II группа: осуществляли внутрибрю-шинное введение бульонной культуры E.cloacae №258, содержащей LT-энтеротоксин
в дозе LD50 - 5х1010 КОЕ/мл) (термолабильный энтеротоксин).
Контрольная группа: осуществляли
внутрибрюшинное введение 0,9% раствора
NaCl .
При введении дозы LD50 (5х1010
КОЕ/мл) развивался инфекционный процесс у мышей, сопровождающийся выраженными
изменениями их активности, массы и состояния шерстяного покрова.
Оценку всех тестируемых параметров проводили на 1-е, 3-и и 5-е сутки.
Все животные содержались в стандартных условиях вивария. При выполнении экспериментов соблюдались Международные рекомендации по использованию животных в биологических и медицинских исследованиях согласно Хельсинкской декларации.
Полученные перитонеальные макрофаги (ПМф) мышей выделяли путем трехкратного промывания брюшной полости средой 199 при 40 С с последующим центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут.
Для оценки жизнеспособности клеток брали по 0,05 мл суспензии и добавляли равное количество 0,2% раствора трипановой сини. Через 10 минут в 1 капле раствора на предметном стекле под микроскопом (10x40) подсчитывали клетки, вычисляли процент жизнеспособных (неокрашенных) клеток.
Исследование фагоцитарной активности ПМф проводили на модели поглощения частиц полистирольного латекса [13]. К 0,05 мл ПМф добавляли равное количество приготовленной суспензии латекса, содержащей 100250 тыс. частиц/мкл. Инкубацию проводили при 370 С в течение 30 минут. Затем готовили мазки, которые фиксировали метанолом в течение 3 минут и окрашивали в течение 30 минут по Романовскому - Гимзе. Определялись активность и интенсивность фагоцитоза.
Исследование внутриклеточного кисло-родзависимого метаболизма фагоцитов проводили с использованием метода спонтанного и индуцированного НСТ - теста [7]. В основе этого метода лежит определение интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (НСТ) в его нерастворимую форму
- диформазан, выпадающую внутри фагоцитов и на их цитоплазматической мембране в виде темных гранул.
Для постановки спонтанного НСТ - теста к 0,05 мл ПМф добавляли равное количество НСТ и инкубировали при 37С0 в течение 30 минут. Для прекращения реакции клеточного монослоя промывали физиологическим раствором.
Для индуцированной НСТ- реакции к 0,05 мл ПМф добавляли столько же НСТ и взвеси частиц латекса в концентрации, при которой соотношение фагоцитов и частиц латекса составляет 1:20. Остальные манипуляции выполняли в той последовательности и аналогичным образом, что и при определении спонтанной НСТ - реакции. Сушили, фиксировали глутаровым альдегидом и окрашивали 0,1 % водным раствором сафронина Т в течение 5 минут.
Учет реакции проводили с помощью иммерсионного микроскопа (Биолам). Активность НСТ-реакции определяли по процентному содержанию клеток, восстанавливающих НСТ, из расчета на 100 учтенных клеток. Определение активности заключалось в выделении четырех групп клеток: 1) клетки с отложениями диформазана, не превышающими 1/3 площади ядра; 2) фагоциты, в которых гранулы диформазана занимали площадь более 1/3, но не более размеров ядра клетки; 3) клетки с отложениями диформазана, превышающие размер ядра; 4) “нулевые” фагоциты с единичными пылевидными гранулами или без них.
Для получения индекса интенсивности реакции количество клеток первой группы, выраженное в процентах, умножали на 1; процент фагоцитов, отнесенных ко второй группе, - на 2; к третьей - на 3. Результаты суммировали и делили на 100.
Статистическую обработку результатов проводили с применением современных программных пакетов математико-
статистического анализа. Для межгрупповых сравнений использовался критерий Ньюмена
- Кейлса [5].
Результаты и обсуждение
Результаты изучения активности фагоцитоза выявили тенденцию к снижению активности фагоцитоза в экспериментальных группах мышей с 3-го дня исследования.
Так, в I группе животных активность фагоцитоза через сутки относительно контроля составила 90,3±0,75% (р<0,001), на 3-и сутки - 75,2±2,84% (р<0,001) и оставалась в пределах этих значений через 5 суток. Во II группе животных активность фагоцитоза относительно контроля составила через сутки 81,0±0,31% (р<0,001), через 3-е суток -75,1±0,91% (р<0,001), через 5 суток -
70,2±1,56% (р<0,001). В контрольной группе мышей показатели активности фагоцитоза были относительно постоянными и составили через сутки 53,2±0,44 %, через 3-е суток -56,1±0,31%, через 5 суток - 54,7±1,90%.
В следующей серии опытов была изучена интенсивность фагоцитоза. Установлено, что в I группе животных показатель интенсивности фагоцитоза был выше, чем во II группе. Так, в I группе животных интенсивность фагоцитоза через сутки относительно контроля составила 429,5± 17,07 усл.ед. (р<0,001), через 3-е суток - 298,3±3,42 усл.ед. (р<0,001), через 5 суток - 418,2±5,44 усл.ед. (р<0,001). Во II группе интенсивность фагоцитоза относительно контроля составила через сутки - 344,8±5,55 усл.ед. (р<0,001), через 3-е суток - 283,6±2,09 усл.ед. (р<0,001), через 5 суток - 345,8±6,25 усл.ед. (р>0,05). В контрольной группе мышей показатели оставались относительно постоянными и составили через сутки 302,2±5,48 усл.ед., а через 5 суток
- 310,0±2,29 усл.ед.
Оценка активности спонтанной НСТ-реакции перитонеальных макрофагов показала снижение их НСТ-редуцирующей способности. Обращает на себя внимание тот факт, что в клетках мышей II группы активность процессов образования активных форм кислорода несколько ниже по сравнению с I группой, причем максимальное снижение образования супероксидного аниона относительно контроля наблюдается уже на 3-й день экспериментов (44,80±0,25 %; р<0,001).
В другой серии экспериментов установлено, что индуцированная НСТ-реакция ПМф была ниже, чем спонтанная, и имела тенденцию к снижению. Следует отметить, что во II группе мышей показатели имели достоверно низкие значения по сравнению с контролем и через сутки составили 65,60±0,30% (р<0,001). Данные свидетельствуют о предельных возможностях работы гексозомонофосфатного шунта клеток под действием токсина, которого характеризовались недостаточной антиок-сидантной системой фагоцитов, поскольку показатели количества образования свободных радикалов без индукции были намного выше.
Результаты показывают, что в ПМф мышей, инфицированных ЬТ-энтеротоксином Е.с1оасае и 81.аигеш, происходит достоверное снижение способности к восстановлению НСТ, что отражает дефекты кислородзависи-мых механизмов бактерицидности.
Взаимодействие микроорганизма с Мф приводит к следующим последствиям. Если микроорганизм захватывается и переваривается внутри Мф, этих событий может оказаться достаточно для предотвращения дальнейшего развития инфекции. Однако многие патогенные микроорганизмы в процессе эволю-
ции паразитизма приобрели эффективные стратегии ускользания от действия фагоцитарных клеток; некоторые из них способны противостоять поглощению фагоцитами, другие активно внедряться в антигенпредстав-ляющие клетки (АПК) и свободно развиваться и реплицироваться в клетках [2].
Активность и интенсивность фагоцитоза являются показателями функционального состояния макрофагов, поэтому нарушение фагоцитоза может привести к иммунной недостаточности, поскольку нарушаются процессы распознавания продукции провоспали-тельных цитокинов и хемокинов, процессинга бактериальных антигенов и презентации их эффекторами врожденного иммунитета к Т-лимфоцитам [12, 13].
Результаты изучения активности и интенсивности фагоцитоза выявили тенденцию к снижению активности фагоцитоза с 3-го дня исследования, особенно во II группе. Снижение активности фагоцитоза можно объяснить тем, что при изучении иммунологических показателей не всегда реализуется складывание суммарного воздействия двух антигенов на активацию иммунных клеток. Это зависит от многих причин, в частности от наличия синергизма или антагонизма внутриклеточных сигналов, возникающих внутри клеток-мишеней (макрофагов, нейтрофилов).
Факторы патогенности условно-
патогенных энтеробактерий различным образом нарушают эволюционно отлаженные механизмы регуляции иммунной защиты макроорганизма [10]. В частности, LT-энтеротоксин E.cloacae подавляет антигенпрезентирующую и антигенпроцессинговую функции макрофагов [1].
Фагоцитоз сопряжен с наработкой активных форм кислорода (АФК) с последующим внутриклеточным киллингом патогена [10].
Исследование в динамике спонтанной активации фагоцитов к восстановлению нит-росинего тетразолия в диформазан сопровождается первоначальной активацией системы НАДФ. Н-оксидазы с последующим снижением количества образования АФК. Обращает на себя внимание тот факт, что в клетках мышей II группы активность процессов образования активных форм кислорода несколько ниже по сравнению с I группой, а максимальное снижение образования супероксидного аниона наблюдается уже на 3-й день экспериментов.
В другой серии экспериментов установлено, что индуцированная НСТ-реакция мак-
рофагов была ниже, чем спонтанная, и имела тенденцию к снижению. Следует отметить, что во II группе мышей показатели имели достоверно низкие значения по сравнению с контролем и через сутки составили 65,60±0,30% (р<0,001).
Полученные результаты констатируют факт нарушения генерации активных форм кислорода в системе НАДФ Н-оксидазы, в частности во II группе мышей, что отражает дефекты кислородзависимых механизмов бак-терицидности.
Исход фагоцитарной реакции, где участвуют фагоциты и бактериальные патогены, далеко не всегда заканчивается в пользу фагоцита. В ряде ситуаций микробной клетке удается, несмотря на ее поглощение фагоцитом, избежать последующего киллинга, что связано с различными приемами, выработанными патогеном в процессе микроэволюции.
Фактор изменения реактивности фагоцитов многими авторами рассматривается как ключевой момент в патогенезе инфекционного процесса [14].
Ключевая роль в развитии респираторного «взрыва» принадлежит НАДФН-оксидазе, которая является непосредственным транспортером электронов от НАДФ цитозоля
к молекулярному кислороду. Стимуляторами НАДФН-оксидазы выступают фагоцитированные бактерии, иммунные комплексы, ци-токины, опсонизированные частицы, продукты комплемента [7]. Однако кислородзависи-мая микробицидная активность фагоцитов может меняться под действием патогенных бактерий и их факторов патогенности. Установлено, что экзотоксины токсического шока 8.аигеш подавляют продукцию биоцидных соединений фагоцитами [4]. Сомова Л.М. с соавт. [8] показала, что вирулентные штаммы 8.аигеш и L.monocitogenes устойчивы к действию кислородзависимых и нитроксидзави-симых ферментных систем макрофагов.
Заключение
Обобщая полученные результаты по изучению фагоцитоза и кислородзависимого метаболизма ПМф мышей, можно заключить, что энтеротоксигенная культура Е.с1оасае и St.aureus при сокультивировании проявляют более агрессивное действие на функциональную активность ПМф по сравнению с энтеро-токсигенной монокультурой Е.с1оасае, что должно учитываться при диагностике гнойновоспалительных процессов в случае обнаружения микст-инфекции.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ахтариева, А.А. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter cloacae на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей / А. А .Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. №4. - С.58-61.
2. Бухарин, О.В. Механизм выживания бактерий / О.В.Бухарин, А.Л.Гинцбург, Ю.М.Романова [и др.].- М.: Медицина, 2005. -367с.
3. Галактионова, В.Г. Сингенные и аллогенные отношения при макрофагальной индукции иммунного ответа у мышей разных генотипов / В.Г.Галактионова, Т.В. Анфаловa // Ж.общ. биологии. - 1974.- Т.35, - №3 - С. 365-370.
4. Гончарук, Ю.Н. Функциональная активность перитонеальных макрофагов мышей, зараженных грамположитель-ными бактериями / Ю.Н.Гончарук, Н.Г.Плехова, Л.М. Сомова [и др.] // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. - 2006. - № 1. - С. 48-51.
5. Зайцев, В.М. Прикладная медицин / В.М.Зайцев, В.Г.Лифляндский, В.И.Маринкин. - СПб.: Фолиант, 2006.-432 с.
6. Маянский А.Н, Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1983.
7. Маянский, А.Н. Способ оценки функциональной активности нейтрофилов человека по реакции восстановления нитросинего тетразолия: метод. реком / А.Н.Маянский, М.К. Винсман. - Казань, 1979.
8. Сомова, Л.М. Кислородзависимая и нитроксидзависимая ферментные системы макрофагов при стафилококковой и листериозной инфекции / Л.М.Сомова, Н.Г.Плехова, Ю.Н.Гончарук // Иммунология. - 2006. - № 3. - С. 39-43.
9. Фрейдлин, И.С. Методы изучения фагоцитирующих клеток при оценке иммунного статуса человека: учебное пособие. - Л., 1986.
10. Хаитов, Р.М. Современные представления о защите организма от инфекции / Р.М.Хаитов, Б.В.Пинегин // Иммунология. - 2000. - № 1. - С. 61-64.
11. McCormick D.A., Colgan S.P. et. Al. Salmonella tuphimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signaling to subepitelial neutrophils. J.Cell.Biol.-1993, 123: 895-907.
12. Soriani M., Williams N.A., Hirsh T.R. Escherichia coli enterotoxin B subunit trigger apoptosis of CD8+ T - cells by activating transcription factors c - Myc. Infect. Immunol. 2001, 69: 4923 - 4930.
