CC BY
21
150
ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИИ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
джи, содержащие все необходимые для выделения ДНК, амплификации и капиллярного электрофореза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Эксперименты выполнялись с использованием, в качестве основного и предпочтительного варианта, мультиплексной панели RapidHIT GlobalFiler Express Kit: эта панель относится к последнему поколению аналитических STR-панелей и позволяет проводить генотипирование сразу 24 полиморфных локусов хромосомной ДНК.
В ходе данной работы были получены генетические профили для всех взятых на исследование 45 образцов, из них 16 образцов буккального эпителия и 29 образцов крови. Для каждого типа образцов были подобраны оптимальное количество для внесения в картридж и протокол для работы.
Показано, что система позволяет успешно работать с образцами буккального эпителия. Лучшие результаты были достигнуты при использовании протокола Buccal Swab, позволившего получить более сбалансированный профиль и оптимальный уровень сигнала. Примечательно, что оставшийся в картридже образец букального эпителия можно использовать для повторного анализа: уровень полезного сигнала уменьшается не более чем в два раза.
Оптимальным протоколом для работы с образцами крови является Run Other Samples: данный протокол позволяет получить полный профиль при работе с вырезкой размером 3x3 мм и даже с минивырезкой диаметром 1,2 мм.
■ валидация некоторых методик экстрагирования днк из костных останков
Т. В. Тимошенко, к.м.н. Е. Ю. Земскова, к.м.н. М. М. Бордюков, д.б.н., проф. П. Л. Иванов • ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (дир. - д.м.н., проф. А. В. Ковалев)
• Аннотация: Проведен сравнительный анализ протоколов для экстрагирования ДНК из костных фрагментов (модифицированный метод с использованием стандартных реагентов и протокол с полной деминерализацией) с использованием роботизированных станций AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) и QIAcube (QIAGEN, Германия). Полученные результаты показали высокую производительность и пропускную способность методов автоматизированного экстрагирования ДНК для обеих указанных роботизированных станций с предварительной деминерализацией исследуемых костных фрагментов.
• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ская экспертиза, идентификационная экспертиза, типирование хромосомной ДНК, экстрагирование ДНК из костных останков, метод полной деминерализации
ВВЕДЕНИЕ
Целью работы явилось сравнительное исследование автоматизированных методов выделения суммарной ДНК из костной ткани с использованием двух роботизированных станций: AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) и QIAcube (QIAGEN, Германия)
с использованием стандартного протокола для выделения (для AutoMate Express™ DNA Extraction System) и предварительного этапа - полной деминерализации с некоторыми модификациями.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли с помощью полимеразной цепной реакции с использованием систем количественной энзиматической амплификации ДНК Quantifiler* TRIO DNA Quantification Kit (ThermoFisher, США).
ПЦР-амплификацию полиморфных локусов проводили с использованием специализированных наборов реагентов Investigator ESSplex SE Plus Kit (QIAGEN, Германия) и AmpFlSTR* MiniFiler™ PCR Amplification Kit (ThermoFisher, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Среди используемых протоколов для выделения ДНК на этапе оценки концентрации получены интересные данные для автоматизированного протокола для AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) с предварительным этапом полной деминерализации: несмотря на то, что по сравнению с протоколом QIAcube (QIAGEN, Германия) суммарное количество ДНК коротких мишеней было незначительно ниже, количество длинных мишеней превышало на 10-15 % результаты, полученные с использованием других протоколов.
Возможно, полученный эффект является стохастическим, особенно учитывая предельно низкую область определения концентрации ДНК. Тем не менее нами было проведено дальнейшее исследование - амплификация STR-локусов и сравнение полученных результатов с теоретически рассчитанными.
Сравнительный анализ количественных оценок при экстрагировании из длинных трубчатых костей показал преимущества автоматизированных протоколов с предварительным этапом полной деминерализации по сравнению со стандартным протоколом выделения ДНК из костных останков. Вместе с тем отмечаем, что в отдельных случаях, связанных, по-видимому, со специфическими особенностями костных останков, получить результаты с использованием некоторых протоколов не удалось ввиду ингибирования препаратов ДНК, хотя для других протоколов количество суммарной ДНК варьировало в допустимых пределах.
ВЫВОДЫ
В целом полученные результаты показали высокую производительность и пропускную способность методов автоматизированного экстрагирования ДНК из костных фрагментов с предварительной деминерализацией для обеих использованных роботизированных станций. Однако надо понимать, что пока это пилотное исследование, результаты которого позволяют поставить целый ряд задач и дополнительных вопросов. В настоящее время такого рода исследования нами продолжаются.
snp-марке-ры в аспекте
идентификационной судебно-медицинском молекулярно-ге-не-тиче-ской экспертизы и экспертизы биологического родства
Т. В. Тимошенко, к.м.н. Е. Ю. Земскова, д.б.н., проф. П. Л. Иванов
• ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства
журнал СУДЕБНАЯ МЕДИЦИНА наука | практика | образование
www.cудебная-медицина.рф • том 2 №2, апрель 2016
