CC BY
74
джи, содержащие все необходимые для выделения ДНК, амплификации и капиллярного электрофореза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Эксперименты выполнялись с использованием, в качестве основного и предпочтительного варианта, мультиплексной панели RapidHIT GlobalFiler Express Kit: эта панель относится к последнему поколению аналитических STR-панелей и позволяет проводить генотипирование сразу 24 полиморфных локусов хромосомной ДНК.
В ходе данной работы были получены генетические профили для всех взятых на исследование 45 образцов, из них 16 образцов буккального эпителия и 29 образцов крови. Для каждого типа образцов были подобраны оптимальное количество для внесения в картридж и протокол для работы.
Показано, что система позволяет успешно работать с образцами буккального эпителия. Лучшие результаты были достигнуты при использовании протокола Buccal Swab, позволившего получить более сбалансированный профиль и оптимальный уровень сигнала. Примечательно, что оставшийся в картридже образец букального эпителия можно использовать для повторного анализа: уровень полезного сигнала уменьшается не более чем в два раза.
Оптимальным протоколом для работы с образцами крови является Run Other Samples: данный протокол позволяет получить полный профиль при работе с вырезкой размером 3x3 мм и даже с минивырезкой диаметром 1,2 мм.
■ валидация некоторых методик экстрагирования днк из костных останков
Т. В. Тимошенко, к.м.н. Е. Ю. Земскова, к.м.н. М. М. Бордюков, д.б.н., проф. П. Л. Иванов • ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (дир. - д.м.н., проф. А. В. Ковалев)
• Аннотация: Проведен сравнительный анализ протоколов для экстрагирования ДНК из костных фрагментов (модифицированный метод с использованием стандартных реагентов и протокол с полной деминерализацией) с использованием роботизированных станций AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) и QIAcube (QIAGEN, Германия). Полученные результаты показали высокую производительность и пропускную способность методов автоматизированного экстрагирования ДНК для обеих указанных роботизированных станций с предварительной деминерализацией исследуемых костных фрагментов.
• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ская экспертиза, идентификационная экспертиза, типирование хромосомной ДНК, экстрагирование ДНК из костных останков, метод полной деминерализации
ВВЕДЕНИЕ
Целью работы явилось сравнительное исследование автоматизированных методов выделения суммарной ДНК из костной ткани с использованием двух роботизированных станций: AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) и QIAcube (QIAGEN, Германия)
с использованием стандартного протокола для выделения (для AutoMate Express™ DNA Extraction System) и предварительного этапа - полной деминерализации с некоторыми модификациями.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли с помощью полимеразной цепной реакции с использованием систем количественной энзиматической амплификации ДНК Quantifiler* TRIO DNA Quantification Kit (ThermoFisher, США).
ПЦР-амплификацию полиморфных локусов проводили с использованием специализированных наборов реагентов Investigator ESSplex SE Plus Kit (QIAGEN, Германия) и AmpFlSTR* MiniFiler™ PCR Amplification Kit (ThermoFisher, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Среди используемых протоколов для выделения ДНК на этапе оценки концентрации получены интересные данные для автоматизированного протокола для AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) с предварительным этапом полной деминерализации: несмотря на то, что по сравнению с протоколом QIAcube (QIAGEN, Германия) суммарное количество ДНК коротких мишеней было незначительно ниже, количество длинных мишеней превышало на 10-15 % результаты, полученные с использованием других протоколов.
Возможно, полученный эффект является стохастическим, особенно учитывая предельно низкую область определения концентрации ДНК. Тем не менее нами было проведено дальнейшее исследование - амплификация STR-локусов и сравнение полученных результатов с теоретически рассчитанными.
Сравнительный анализ количественных оценок при экстрагировании из длинных трубчатых костей показал преимущества автоматизированных протоколов с предварительным этапом полной деминерализации по сравнению со стандартным протоколом выделения ДНК из костных останков. Вместе с тем отмечаем, что в отдельных случаях, связанных, по-видимому, со специфическими особенностями костных останков, получить результаты с использованием некоторых протоколов не удалось ввиду ингибирования препаратов ДНК, хотя для других протоколов количество суммарной ДНК варьировало в допустимых пределах.
ВЫВОДЫ
В целом полученные результаты показали высокую производительность и пропускную способность методов автоматизированного экстрагирования ДНК из костных фрагментов с предварительной деминерализацией для обеих использованных роботизированных станций. Однако надо понимать, что пока это пилотное исследование, результаты которого позволяют поставить целый ряд задач и дополнительных вопросов. В настоящее время такого рода исследования нами продолжаются.
snp-марке-ры в аспекте
идентификационной судебно-медицинском молекулярно-ге-не-тиче-ской экспертизы и экспертизы биологического родства
Т. В. Тимошенко, к.м.н. Е. Ю. Земскова, д.б.н., проф. П. Л. Иванов
• ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н., проф. А. В. Ковалев)
• Аннотация: Проведенное исследование демонстрирует перспективность применения технологии высокопроизводительного секве-нирования в аспекте судебно-медицинских молекулярно-генетических идентификационных экспертиз и экспертиз биологического родства. На примере нескольких экспериментов показана приемлемость SNP-анализа деградированных образцов ДНК, проведено сравнительное исследование на предмет случайного совпадения среди неродственных лиц.
• Ключевые слова: молекулярно-гене-тическая экспертиза, идентификационная экспертиза, типирование хромосомной ДНК, SNP-маркеры, NGS, технологии секвенирования следующего поколения
ВВЕДЕНИЕ
Одним из перспективных направлений современной судебно-медицинской генетики является поиск возможных путей повышения эффективности молекулярно-био-логического идентификационного анализа. Решением этой задачи может оказаться переход к альтернативным (более информативным) методам исследования.
Так, классическим подходом к исследованию коротких тандемных повторов ДНК человека является определение полиморфизма длины амплифицированных фрагментов методом капиллярного электрофореза. При этом известно, что подавляющему большинству областей человеческого генома свойствен полиморфизм последовательности. Однако электрофоретическое разделение ДНК-фрагментов не дает никакой информации о полиморфизме этого типа, так как позволяет определить только длину анализируемого ампликона.
Потенциально перспективным направлением считается анализ однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) - вариантов последовательности, которые имеют, как правило, всего два аллеля и обнаруживаются один на несколько сотен нуклеотидов на протяжении всего генома и которые могут выступить в качестве альтернативы традиционному анализу STR-фрагментов.
В настоящий момент активно развиваются технологии и появляются новые технологические решения, которые позволяют выявлять, детектировать и анализировать данные об однонуклеотидных заменах в ДНК человека. В роли наиболее прогрессивно совершенствующихся методов анализа и оцифровки генетической информации в современной молекулярной биологии выступают технологии высокопроизводительного секвенирования - секве-нирование нового, или следующего, поколения (англ. Next Generation Sequencing, NGS).
Ранее нами было проведено исследование приемлемости платформ высокопроизводительного секве-нирования для целей и задач судебно-медицинской молекулярно-генетической экспертизы. Результаты проведенного исследования будут отражены в отдельной публикации.
В рамках настоящего исследования нами была предпринята попытка оценки технологий секвенирования следующего поколения в рамках идентификационной экспертизы и экспертизы биологического родства.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве одного из экспериментов нами были исследованы препараты ДНК, полученные от 39 неродственных индивидуумов, 7 образцов деградированной ДНК, полу-
ченной из гистологических блоков, и три образца ДНК от лиц, состоящих в прямом родстве.
Для секвенирования целевых участков ДНК использовалась платформа Ion Torrent™ PGM Sequencer™ System (Life Technologies, США) и специализированные наборы реагентов.
Полученный массив последовательностей был проанализирован с использованием алгоритмов генотипиро-вания, реализованных в модуле HID_SNP_Genotyper_39 (v4.1) штатного программного обеспечения Torrent Suite Software.
• анализ проведен со следующими параметрами алгоритма генотипирования:
• баланс гетерозигот - не менее 0,3;
• минимальное покрытие - 10;
• минимальное покрытие по второй цепи - 5;
• дисбаланс чтений прямой и обратной цепи - не учитывать;
• порог QC (качества прочтений) - 20.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Полученные результаты - данные прочтений 119 SNP-мишеней (90 аутосомальных и 29 мишеней Y-хро-мосомы) были проанализированы с нескольких ракурсов. Весьма интересным представлялся анализ деградированных образцов, в частности приемлемость указанной тест-системы для проведения молекулярно-генетической идентификационной экспертизы. Техническая часть анализа препаратов ДНК с высокой степенью деградации показала заметное смещение распределения длины чтений в более короткую область. То есть, согласно ожидаемым данным, успешно протипированными оказались порядка 65-75 % маркеров (=120-190 bp). Анализ на воспроизводимость данных показал наличие (< 5 % случаев) ошибочного определения генотипа, в частности связанного с появлением ложной гомозиготности - результата низкого покрытия исследованной области и, как следствие, малого количества прочтений.
Тем не менее попарный сравнительный анализ частичного ДНК-профиля (полученного в автоматическом режиме с отсутствием каких-либо допусков) не выявил ни одного случая случайного совпадения со всеми исследованными ранее препаратами ДНК (полученными в ходе настоящего эксперимента и ранее протипированными).
Это говорит о том, что использование SNP-маркеров в рамках идентификационной экспертизы представляется весьма перспективным, особенно в случаях высокодеградированной ДНК, когда максимально достоверный STR-профиль может быть представлен не более чем 5-6 маркерами (в иных случаях их может быть и меньше, например когда в качестве объектов исследования выступают костные останки, длительное время подвергавшиеся воздействию разнообразных негативных факторов), против 60-70 SNP-маркеров.
Вторым аспектом проводимого исследования была идея оценки приемлемости SNP-анализа для разрешения экспертиз прямого биологического родства.
Полученные на ранних этапах данные частот SNP-мар-керов (результаты которых также будут отражены в отдельной публикации) позволили провести структурный анализ и дать характеристику разнообразия исследованной панели маркеров: согласно полученным данным, дискриминирующая способность системы из 90 аутосом-ных локусов SNP в целом на 15-17 % превышает дискриминирующую способность современных мультиплексных STR-наборов.
Проведенный сравнительный анализ результатов ти-пирования 39 образцов ДНК, полученных от неродствен-
ных лиц на предмет случайного совпадения как ребенок/ родитель, дал положительные результаты (определение заведомо неродственных лиц в качестве возможных прямых родственников).
В частности, при полном попарном сравнении всего массива данных нами были выявлены два случая обнаружения в качестве возможных родственников неродственных лиц. В обоих случаях успешно и достоверно полученными были данные для =60 % установленного генетического профиля, что тоже является достаточно высоким результатом. Для сравнения приведем пример исследования на предмет ложного определения заведомо неродственных лиц по панели 8 локусов: в результате указанного исследования среди проанализированного массива данных (несколько тысяч генотипов) нами были выявлены порядка 50 случаев случайного совпадения.
ВЫВОДЫ
Учитывая, что пока это лишь пилотное исследование, полученные данные позволяют поставить целый ряд дополнительных вопросов.
В целом результаты проведенной работы демонстрируют перспективность анализа однонуклеотидных последовательностей как дополнительного источника информативности в рамках проводимого исследования, либо в качестве альтернативного метода исследования.
В настоящий момент такого рода исследования нами продолжаются.
■ молекулярно-генетическая экспертиза при расследовании обстоятельств гибели людей, летевших на авиалайнере airbus 321 рейсом ei-etj (шарм-эль-шейх - санкт-петербург) к.м.н. Е. Ю. Земскова, Т. В. Тимошенко, д.б.н., проф. П. Л. Иванов
• ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н., проф. А. В. Ковалев). • Аннотация: Работа выполнена в рамках судебно-экспертного исследования, целью которого явилась молекулярно-генетическая идентификация останков 224 погибших пассажиров и членов экипажа российского авиалайнера Airbus 321 Metrojet (рейс EI-ETJ Шарм-эль-Шейх - Санкт-Петербург), потерпевшего крушение в результате теракта над территорией Египта в 2015 г., и установление местоположения лиц, находившихся в момент катастрофы на борту разбившегося воздушного судна. Общее количество объектов экспертизы составило 1049 (собранные на месте катастрофы образцы биологического материала от фрагментов тел погибших, смывы с приборных панелей кабины и вырезы тканей кресел, референтные биологические образцы от родственников погибших лиц). В беспрецедентно короткий срок (25 дней) установлены останки 217 погибших пассажиров и членов экипажа разбившегося воздушного судна. Не обнаружены фрагменты тел 7 женщин из списочного состава находившихся на борту лиц. Работа по их поиску продолжается. В настоящее время проводится дополнительная молекулярно-генетическая экспертиза еще 200 фрагментов тел, обнару-
женных при повторном осмотре места происшествия.
• Ключевые слова: авиакатастрофа, моле-кулярно-генетическая экспертиза, молекулярно-генетическая идентификация погибших, непрямая идентификация
ВВЕДЕНИЕ
31 октября 2015 г. самолет Airbus 321 c бортовым номером EI-ETJ, принадлежавший авиакомпании Metrojet («Когалым-Авиа»), следовавший по маршруту Шарм-эль-Шейх (Египет) - Санкт-Петербург (Россия), потерпел крушение на территории Египта, что повлекло смерть 217 пассажиров и 7 членов экипажа (впоследствии эта катастрофа признана терактом).
В рамках возбужденного уголовного дела по установлению обстоятельств гибели людей, летевших рейсом EI-ETJ, была назначена молекулярно-генетическая экспертиза. Проведение экспертизы поручено ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава РФ.
Вопросы, поставленные на разрешение экспертов, касались идентификации обнаруженных останков погибших, а также установления локализации членов экипажа и пассажиров в кабине и в салоне разбившегося воздушного судна в момент катастрофы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
• Выделение ДНК из мягких тканей, смывов и вырезов обшивки кресел проводили с применением сорбентных технологий с помощью применения роботизированных станций, выпускаемых Applied Biosystems (США), Promega Corporation (США) и QIAGEN GmbH (Германия).
• Выделение ДНК из костных фрагментов проводили на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System (Applied Biosystems, США) после предварительного измельчения костной ткани с помощью гомогенизатора TissueLyser II (QIAGEN, Германия), с использованием набора реагентов PrepFiler Express BTATM Forensic DNA Extraction Kit (Applied Biosystems, США).
• Выделение ДНК из образцов буккального эпителия проводили на роботизированной станции Maxwell® 16 Instrument AS2000 (Promega Corporation, США) с использованием набора реагентов DNA IQ™ Casework Sample Kit for Maxwell® 16 (Promega Corporation, США).
• Анализ матричной активности ДНК в полученных препаратах проводили с использованием систем количественной ПЦР-амплификации ДНК серии Quantifiler® DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США) и специализированного амплификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, США).
• Выделение ДНК из образцов крови, а также ее количественную и качественную оценку (анализ матричной активности), как отдельную процедуру не проводили -поскольку для типирования полиморфных STR-локусов ДНК применяли специализированные наборы реагентов, предназначенные для прямой ПЦР-амплификации ДНК непосредственно в образцах биологического материала (это методика «direct PCR»: лизис ядросодержа-щих клеток в анализируемом биологическом материале и высвобождение хромосомной ДНК происходит прямо в реакционной смеси для ПЦР).
• Генотипирование полиморфных STR-локусов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием энзиматической амплификации следующих мультилокусных панелей: 17-локусной панели AmpFlSTR® NGMSElectTM PCR Amplification
