CC BY
104
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ п аразитология ♦
УДК 619: 616.07: 636.1
Трипаносомные положительные и отрицательные сыворотки лошадей
Х. Георгиу, доктор биологических наук (chgeorgiou@rambler.ru)
Государственное научное учреждение «Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)» (Москва).
Приведены результаты получения трипаносомных положительных и отрицательных сывороток крови для серологических реакций (РДСК, РНГА и ИФА). Кровь от паразитоносителей и иммунизированных трипаносомными антигенами кроликов можно использовать для приготовления положительной сыворотки для диагностических исследований. При этом титр антител должен быть не ниже 1:20 в РДСК, 1:200 в РНГА и ИФА. Для приготовления отрицательных сывороток можно использовать только кровь от здоровых животных, отрицательно реагирующих в серологических реакциях с трипаносомным антигеном.
Ключевые слова: ИФА, лошади, РДСК, РНГА, серология, трипаносомоз
Сокращения: ИФА (ELISA) — иммуноферментный анализ (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), МЕМ—международная единица мутности, МТ — масса тела, РДСК — реакция длительного связывания комплемента, РНГА — реакция непрямой гемагглютинации
Введение
На территории России серьезную проблему представляют такие трипаносомозы, как случная болезнь однокопытных (возбудитель Trypanosoma еquiperdum), сурра лошадей и верблюдов (возбудитель T. еvansi). Данные инвазии являются бичом коневодства, подрывая и парализуя работу хозяйств [8], так как от 30 до 50 % заболевших лошадей (иногда больше) погибает.
Проблема диагностики трипаносомозов лошадей остается актуальной. Диагноз на случную болезнь устанавливают в соответствии с «Инструкцией о мероприятиях по борьбе со случной болезнью однокопытных» от 14.01.1997 — на основании эпизоотологических, клинических, патолого-анатомических данных и результатов лабораторных исследований (микроскопического, серологического). Для микроскопии берут соскобы с пораженных слизистых оболочек половых органов и пунктат (сукровицу) из краев талерных бляшек. Соскобы берут уретральной ложкой или даже краем предметного стекла, а для получения пунк-тата делают укол иглой или надрез скальпелем. Исследуют по методу раздавленной капли или из соскоба готовят тонкие мазки и окрашивают их по Романовскому.
Для постановки серологических реакций необходимы положительные и отрицательные сыворотки.
Цель исследования
Выявить возможность получения сывороток от лошади: положительных — от животных-паразитоносителей и от иммунизированных трипаносомными антигенами кроликов; отрицательных — от животных, отрицательно реагирующих на трипаносомоз.
Материалы и методы
В качестве антигена использовали приготовленные нами антигены Т. equiperdum и T. evansi [1]. Кроме того, использовали отечественный фабричный антиген (Омск).
Отрицательную сыворотку получили от лошадей (n=30), отрицательно реагирующих на трипаносомный антиген [2].
Положительную сыворотку получили от лошадей (n=30), положительно реагировавших в РДСК на трипаносомный антиген, и от иммунизированных трипано-сомными антигенами кроликов.
Использовали беспородных кроликов в возрасте 6.. .7 месяцев, МТ 2,5.3,0 кг
В первом опыте животных разделили на две группы. В первой группе (n=3) кроликам ввели внутримышечно три-паносомный антиген в рабочем разведении (содержащий 10 МЕМ). Кролики второй группы (n=2) служили контролем.
Второй опыт ставили, чтобы уточнить результаты, полученные в первом опыте. Кроликов (n=6) разделили на две равные группы. Первой группе ввели антиген в рабочем разведении. Вторая группа служила контролем.
Чтобы определить общность антител в сыворотках крови кроликов, которым ввели приготовленные нами три-паносомные антигены Т. equiperdum и Т. evansi, ставили третий опыт. Животных разделили на три группы. Кроликам 1-й группы (n=3) ввели внутримышечно антиген Т. equiperdum в рабочем разведении, кроликам 2-й группы (n=3) — антиген Т. evansi в рабочем разведении. Кролики 3-й группы (n=2) служили контролем.
РДСК ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК» [3]; РНГА — согласно «Методическим рекомендациям по диагностике трипаносомозов лошадей (T. equiperdum и T. evansi)» [4, 5]; ИФА — согласно «Методическим рекомендациям для серологической диагностики случной болезни лошадей с применением экзоантигенов T. equiperdum в иммуно-ферментном анализе» [5, 6].
Сублимационное высушивание приготовленных серий позитивных и негативных сывороток проводили в ВИГИС без защитной среды [7].
Лиофилизированные позитивные и негативные сыворотки, хранили в бытовом холодильнике (4 С).
Результаты
1. Результаты титрования позитивных и негативных сывороток крови лошадей с трипаносомным антигеном
№ Титры положительных сывороток Титры отрицательных сывороток
РДСК РНГА ИФА РДСК РНГА ИФА
1 1:20 1:200 1:400 - - -
2 1:40 1:800 1:800 - - -
Позитивные серии сывороток были активными и не антикомплементарными, негативные — отрицательными и не антикомплиментарными в РДСК, РНГА и ИФА (табл. 1).
Трипаносомные положительные и отрицательные сыворотки лошадей
Поставленные нами опыты показали, что кровь от ло-шадей-паразитоносителей для приготовления позитивной сыворотки можно брать, когда антитела в РДСК находятся в титрах 1:20 и выше; в РНГА — от 1:200, в ИФА — 1:800; для приготовления негативной — когда сыворотка крови лошадей отрицательно реагирует в РДСК, РНГА и ИФА.
Чтобы установить общность антител в сыворотках крови, полученных от лошадей, положительно реагирующих с трипаносомным антигеном, была поставлена перекрестная реакция. Сыворотки лошадей исследовали с антигенами Т. equíperdum и Т.еуаш! в РДСК, РНГА и ИФА и получили результаты, идентичные описанным выше.
Таким образом, поставленные нами опыты показали возможность получения положительных сывороток от лошадей-паразитоноси-телей и отрицательных сывороток от лошадей, отрицательно реагирующих на трипаносомоз. Кроме того, получили идентичные результаты при испытании указанных сывороток с приготовленными нами антигенами Т. вдирвгёит и Т. вчапв!.
Титры антител у кроликов первого и второго опытов приведены в таблицах 2, 3; результаты третьего опыта показаны в таблице 4.
Таким образом, результаты эксперимента показали возможность получения трипаносомных сывороток от иммунизированных кроликов, а также идентичные результаты при испытании указанных сывороток с приготовленными нами антигенами Т. вдшрвгёит и Т. вчапв!. Сыворотки крови кроликов контрольной группы давали отрицательный результат.
Следовательно, в качестве отрицательных и положительных сывороток в серологических реакциях (РДСК, РНГА и ИФА) могут быть использованы не только сыворотки крови лошадей, но и кроликов.
Полученные нами положительные сыворотки от ло-шадей-паразитоносителей смешали и приготовили пул положительной сыворотки. Второй пул положительной сыворотки получили, смешивая в одну серию три серии положительной сыворотки крови от иммунизированных трипаносомными антигенами кроликов. Одну серию негативной сыворотки крови лошадей и одну серию негативной сыворотки крови кроликов использовали в качестве контроля. Позитивные и негативные серии сывороток крови титровали в РДСК, РНГА и ИФА (табл. 5).
5. Титры нативных сывороток (позитивных и негативных) крови лошадей и кроликов в РДСК, РНГА и ИФА
Животное РДСК РНГА ИФА
Лошади-паразитоносители 1:40 1:800 1:800
Иммунизированные кролики 1:80 1:1600 1:1600
Контрольные лошади - - -
Контрольные кролики - - -
Положительные сыворотки крови лошадей и кроликов были высокоактивными и не антикомплементарными, отрицательные сыворотки также не обладали антикомплементарными свойствами (табл. 5).
В дальнейшем позитивные и негативные сыворотки крови лошадей и кроликов с целью длительного хранения высушивали в объеме 2,0 мл (в ВИГИС), но без защитной среды. После лиофилизации сыворотку разводили в 2 мл физиологического раствора и вновь титровали в сравнении с нативными. При этом были получеы результаты, аналогичные результатам с нативными сыворотками.
Таким образом, высушенные сыворотки крови от лошадей-паразитоносителей и от иммунизированных трипаносомным антигеном кроликов полностью сохранили свою активность и не были антикомплементарными. Негативные сыворотки тоже не были антикомплементарными.
Выводы
Поставленные нами опыты показали, что кровь для приготовления позитивной сыворотки от паразитоносителей и иммунизированных кроликов можно брать, когда титры антител в РДСК находятся в титрах 1:20 и выше, в РНГА и ИФА — не ниже 1:200. Для приготовления негативной сыворотки пригодна сыворотка крови лошадей, дающая отрицательные результаты в РДСК с трипаносомным антигеном.
Библиография
1. Заблоцкий, В.Т. Методические рекомендации для серологической диагностики случной болезни лошадей c применением экзоантигенов Т. equiperdum в иммуноферментном анализе (ИФА). / В.Т. Заблоцкий, Х. Георгиу // В кн. Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины / А.М. Смирнов, Н.В. Скира, А.В. Суворов и др. — М.: ( РАСХН, 2006). — С. 163-172.
2. Георгиу, Х. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток / Х. Георгиу // Ветеринария и кормление.? 2014. — №1. — С. 26-27.
3. Георгиу. Х. Эксериментальный анаплазмоз овец (симптомокомплекс, иммунологические реакции): автореф. дис. ... канд. вет. наук; защищена 27.05.1980. / Х. Георгиу—М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 1980. — 17 с.
4. Георгиу, Х. Методические наставления по диагностике бабезиоза рогатого скота с применением экзоантигенов в РНГА. В сборнике «Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных» / Х. Георгиу, В.Т. Заблоцкий. — М.: РАСХН, 2011. — С. 160-162.
5. Георгиу, Х. РДСК, РНГА и ИФА при диагностике трипаносомозов лошадей / Х. Георгиу // Материалы Пятой научно-практической конференции по болезням лошадей, 2004. — С. 19-21.
6. Георгиу, Х. ИФА для диагностики трипаносомоза (дурина) лошадей / Х. Георгиу // Ветеринарная патология. — 2003. — №1. — С. 99-101.
7. Георгиу, Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей: автореф. дис. ... докт. биол. наук; защищена 26.06.1997. / Х. Георгиу — М.:ВИЭВ, 1997. — 56 с.
8. Ломакина, Н.Ф. Изучение генома возбудителей трипаносомозах лошадей (T. еquiperdum и T. evansi) / Н.Ф. Ломакина, Х. Георгиу, В.Т. Заблоцкий и др. // Ветеринария. — 2013. — № 3. — С. 29-33.
SUMMARY Ch.Georgiou
All-Russian Research Institute for Expermental Veterinary Medicine (VIEV) (Moscow).
Tripanosomosis Positive and Negative Sera for Serological Tests. Results of producing of positive and negative Tripanosomosis horses sera for IHAT, ICFT, ELISA have been discribed in the article. Blood from tripanosomosis carries can be used for producing of positive serum when lebel of antibodies against tripanosomosis is more than 1:20 in ICFT, 1:200 in IHAT and 1:200 in ELISA and from the immunized rabbits only. For producing negative serum blood from health horses can be used only.
2. Титр антител у кроликов, иммунизированных трипаносомным антигеном (первый опыт)
№ Первая группа кроликов № Вторая группа кроликов (контроль)
РДСК РНГА ИФА РДСК РНГА ИФА
1 1:20 1:400 1:400 1 - - -
2 1:80 1:1600 1:1600 2
3 1:40 1:800 1:800
3. Титр антител у кроликов, иммунизированных трипаносомным антигеном (второй опыт)
№ Первая группа кроликов Вторая группа кроликов (контроль)
РДСК РНГА ИФА РДСК РНГА ИФА
1 1:40 1:800 1:800 - - -
2 1:40 1:800 1:800 - - -
3 1:160 1:3200 1:3200 - - -
4. Титры антител в сыворотках крови кроликов, иммунизированных трипаносомными антигенами (Т. едшреМит и Т.еуапэ¡)
Введенный Т. equiperdum T. evansi
антиген РДСК РНГА, ИФА РДСК РНГА, ИФА
Т. equiperdum 1:40...1:160 1:400.1:3200 1:40.1:160 1:400.1:3200
Т. evansi 1:40...1:160 1:400.1:3200 1:40.1:160 1:400.1:3200
