CC BY
189
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ и ммунология ♦
УДК 619: 616.99: 616-074
Противотрипаносомный T. equiperdum антиген
Х. Гэоргиу, доктор биологических наук (chgeorgiou@rambler.ru)
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ) Россельхозакадемии (Москва).
Приведены результаты получения от зараженных собак, мышей и крыс трипаносомных соматических и экзоантигенов с активностью 95.97 % для диагностических исследований в РДСК, РНГА и ИФА.
Ключевые слова: антиген, инвазия, ИФА, паразите-мия, РДСК, РНГА, трипаносомоз, экзоантиген Сокращения: ИНАН — инфекционная анемия, ИФА — иммуноферментный анализ, МЭБ — Международное эпизоотическое бюро, РДСК—реакция длительного связывания комплемента, РНГА—реакция непрямой гема-гглютинации, РСК—реакция связывания комплемента
Введение
Трипаносомы — одноклеточные простейшие жгутиковые паразиты класса кинетопластид. На территории России встречаются возбудители случной болезни однокопытных (Trypanosoma еquiperdum) и сурры лошадей и верблюдов (T. еуажi) [1].
По данным МЭБ, случную болезнь, вызываемую T. еqui-perdum, регистрируют в Южной Африке, на юге Западной Европы, в Южной Америке, КНР, Среднем Востоке, Средней Азии (Киргизии, Узбекистане) и в России (Сибири). У лошадей случная болезнь протекает наиболее тяжело с высоким уровнем смертности (30...50 %) [15].
T. evansi широко распространена в Азии, Северной Африке, Центральной и Южной Америке. К ней восприимчивы большинство видов домашних и многие виды диких животных. У непривитых лошадей и верблюдов вызываемая этой трипаносомой болезнь сурра (су-ауру), как правило, заканчивается летально [16].
По международным правилам, ввоз лошадей из неблагополучных по случной болезни стран разрешен только при условии исключения у них данного трипаносомоза. С этой целью, в основном, применяют серологические тесты (чаще РСК и дополнительно ИФА) микроскопию и биопробу на лабораторных животных. При диагностических исследованиях особую сложность представляет видовая дифференциация T. еquiperdum и T. evansi, поскольку они неразличимы морфологически, имеют перекрестно-реагирующие антигены и многочисленные сходные участки генома [1, 4, 9, 11].
Мировая практика борьбы со случной болезнью показала, что наиболее эффективным способом является убой больных и положительно реагирующих в РСК животных. Лечение дает временный положительный эффект и не позволяет искоренить болезнь. В связи с этим разработка и внедрение новых способов изготовления ди-агностикумов трипаносомозов остается весьма актуальным направлением в современной ветеринарии.
Диагноз на случную болезнь устанавливают в соответствии с «Инструкцией о мероприятиях по борьбе со случной болезнью однокопытных» от 14.01.1997 г., на основании эпизоотологических, клинических, патолого-анатомических данных и результатов лабораторных исследований (микроскопического, серологического). Для микроскопии берут соскобы с пораженных слизистых
оболочек половых органов и пунктат (сукровицу) из краев талерных бляшек. Соскобы берут уретральной ложкой или даже краем предметного стекла, а для получения пунктата делают укол иглой или надрез скальпелем. Исследуют методом раздавленной капли или из соскоба приготавливают тонкие мазки и окрашивают их по методу Романовского.
Цель исследования
Выявить возможность получения антигенов — как соматических, так и экзоантигенов из крови зараженных собак, мышей и крыс.
Материалы и методы
Материалом для получения трипаносомного антигена послужила кровь больных животных (собак, мышей и крыс), инфицированных соответствующим возбудителем с пораженностью 250 и более трипаносом в 1 поле зрения микроскопа. На высоте паразитемии животных обескровливали.
Кровь собирали в стерильные колбы с антикоагулянтом из расчета 50 мл 20%-го раствора цитрата натрия на 1 л крови. Дальнейшую обработку крови проводили в день ее взятия или не позднее следующих суток по методике Х. Георгиу [13]. Полученный антиген консервировали и титровали в РДСК и ИФА с заведомо положительными и отрицательными сыворотками.
Экзогенные антигены из плазмы крови и надосадоч-ной жидкости (супернатанта), полученной после первого центрифугирования лизированных эритроцитов, выделяли посредством осаждения в 20%-м растворе по-лиэтиленгликоля по стандартной методике [18] и титровали в РДСК и ИФА (табл. 1).
РДСК ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК» [14]; РНГА — согласно «Методическим рекомендациям по диагностике трипаносомозов лошадей (Т. equiperdum и Т. еуапэ!)» [15]; ИФА — согласно «Методическим рекомендациям для серологической диагностики случной болезни лошадей с применением экзоантигенов Т. equiperdum в иммуноферментном анализе» [16].
Полученный антиген проверяли на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Романовскому—Гимзе, на активность, отсутствие антикомплементарных свойств.
Для проверки антигена на активность его разводили физиологическим раствором в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Остальные компоненты, используемые в РДСК при определении активности антигена (сыворотки — позитивная, нормальная, комплемент, гемолитическая система), брали в рабочих дозах. Реакцию ставили по схеме, приведенной в таблице 1.
Противотрипаносомный T. equiperdum антиген
1. Схема постановки РДСК при определении активности трипаносомного антигена Количество трипаносомного антигена, мл, Компоненты реакции при разных разведениях
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Контроль
Антиген 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Одно разведение сыворотки 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Комплемент 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Холодильник при 2...4°С — 18...20 ч, затем 30 мин при комнатной температуре
Гемолитическая система
0,2 0,2 0,2 0,2
Водяная баня при 37...38°С — 20 мин, затем холодильник при 2...4°С — 4...5 ч
2. Титры серий трипаносомных антигенов
Соматический антиген
из плазмы крови
Экзоантиген
из супернатанта лизированных
РДСК ИФА РДСК ИФА РДСК ИФА
1 1:32 1:64 1:256 1:512 1:32 1:128
2 1:16 1:32 1:64 1:128 1:32 1:64
3 1:8 1:16 1:64 1:128 1:8 1:16
4 1:16 1:32 1:32 1:64 1:32 1:64
3. Определение специфичности трипаносомного антигена в РДСК
Происхождение сывороток Разведение сывороток 1:5 1:10 Без антигена
Положительные сыворотки от лошадей, переболевших разными болезнями (по п=1): бруцеллезом сапом ИНАН ринопневмонией вирусным артериитом ОТ ОТ ОТ
Здоровые лошади (п=2) ОТ ОТ ОТ
Фабричная сыворотка (Омская) № 1 от лошади, зараженной Т. еquiperdum ПОЛ ПОЛ ПОЛ
Положительная сыворотка от кролика, зараженного Т. еуапэ: ПОЛ ПОЛ ПОЛ
Положительная сыворотка от лошади из Китая, зараженной Т. еуапэ: ПОЛ ПОЛ ПОЛ
| Примечание: ОТ — отрицательная, ПОЛ — положительная
Номер серий
Результаты реакции оценивали по степени гемолиза и выражали в крестах: «++++» — гемолиз отсутствует — реакция положительная; «+++» — 25 % гемолиза — реакция положительная; «++» — 50 % гемолиза — реакция положительная; «+» — 75% гемолиза — реакция сомнительная; «-» — 100 % гемолиза — реакция отрицательная.
По этой схеме учитывали реакцию и с другими разведениями сыворотки.
Титром антигена считали то наибольшее разведение, при котором проходит 50%-я задержка гемолиза эритроцитов, с наибольшим разведением 1:20...1:40 позитивной контрольной сыворотки.
Антикомплементарные свойства антигена устанавливали в РДСК при определении активности и специфичности антигена путем добавления в пробирки двойной дозы антигена в рабочем разведении в присутствии комплемента, причем в пробирках не должно быть задержки гемолиза эритроцитов барана. После чего консервировали и определяли рабочий титр в РДСК в объеме 0,5 мл с положительными и отрицательными сыворотками. На специфичность антиген проверяли с сыворотками животных, перенесших паразитарные или инфекционные болезни непротозойной природы.
Сублимационное высушивание приготовленных серий антигена проводили на базе ВГНКИ. Лиофилизирован-ные серии антигена хранили в бытовом холодильнике при (при 4 °С).
Результаты и обсуждение
Результаты титрования соматического и экзогенного (растворимого) трипаносомного антигена приведены в таблице 2.
Титры супернатанта лизированных эритроцитов уступали титрам экзогенного антигена, полученного из плазмы, но не соматического антигена. По-видимому, определенное количество растворимого трипаносомного антигена фиксируется на мембране эритроцитов и лейкоцитов, после лизиса которых переходит в супернатант.
Таким образом, опыты показали, что кроме соматических антигенов можно выделить и использовать в диагностике и экзоантигены трипаносом, которые по титрам не уступают первым.
Результаты исследования полученного трипаносом-ного антигена на специфичность и чувствительность в РСК и РДСК с сыворотками крови от лошадей, зараженных случной болезнью, суррой, нутталлиозом, сапом, ИНАН, ринопневмонией, вирусным артериитом, а также от здоровых лошадей приведены в таблице 3.
Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что эти сыворотки ни в одном случае, кроме сывороток, полученных от зараженных случной болезнью и суррой животных, не реагировали с трипаносомным антигеном. Кроме того, нами установлено, что предложенный нами антиген с активностью 95.97 % можно использовать для диагностики трипаносомоза лошадей в РДСК, РНГА и ИФА с аналогичным результатом.
Как видно из приведенных результатов, предложенный способ позволяет получить чувствительный и специфичный трипаносомный антиген.
Выводы
Полученные нами результаты показывают, что кровь от зараженных животных (собак, мышей или крыс) можно использовать для приготовления антигенов (соматических и экзоантигенов). Предложенный нами трипаносомный антиген с активностью 95.97 % пригоден для диагностики трипаносомоза лошадей в РДСК, РНГА и ИФА.
Библиография
1. Георгиу, Х. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток / Х. Георгиу // Вет-корм. — 2014. — №1. — С. 26-28.
2. Георгиу, Х. Экспериментальный анаплазмоз овец (симптомокомплекс, иммунологические реакции) / Х. Георгиу: автореф. дис. ... канд. вет. наук; защищена 27.05.1980. — М.: МГАВМиБ, 1980. — 18 с.
3. 3. Георгиу, Х. РДСК, РНГА, И ИФА при диагностике трипаносомозов лошадей / Х. Георгиу // Мат-лы Пятой научно-практической конференции по болезням лошадей, 2004. — С. 19-21.
4. Георгиу, Х. ИФА для диагностики трипаносомоза (дурина) лошадей / Х. Георгиу // Ветеринарная патология. — 2003. — № 1. — С. 99-101.
5. Георгиу, Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей / Х. Георгиу: автореф. дис. ... докт. биол. наук; защищена 26.06.1997; утв. 31.10.1997. — М.: ВИЭВ, 1997. — 56 с.
6. Георгиу, Х. Применение экзоантигенов трипаносом для серодиагностики случной болезни лошадей / Х. Георгиу, В.Т. Заблоцкий // Мат-лы международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозой патологии животных, рыб и пчел», 2008. — С. 402-406.
7. Заблоцкий, В.Т. Методические рекомендации для серологической диагностики случной болезни лошадей с применением экзоантигенов T. equiperdum в иммуноферментном анализе (ИФА) / В.Т. Заблоцкий, Х. Георгиу / В кн. «Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины» / А.М. Смирнов, Н.В. Скира, А.В. Суворов и др. — М.: РАСХН, 2006. С. 163-172.
8. Ломакина, Н.Ф. Изучение генома возбудителей трипаносомозах лошадей (T. еquiperdum и T. evansi) / Н.Ф. Ломакина, Х. Георгиу, В.Т. Заблоцкий, М.И. Гулюкин, Люис Тюрейтер // Ветеринария. — 2013. — № 3. — С. 29-33.
9. Ломакина, Н.Ф. Трудности дифференциации трипаносом T. evansi и T. equiperdum / Н.Ф. Ломакина, Х. Георгиу, М.И. Гулюкин // Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика». — 2014. — Том II. — С. 491-492.
10. Claes, F. Trypanosoma equiperdum: master of disguise or historical mistake? / F. Claes, P. Buscher, L. Touratier, B.M. God-deeris // Trends Parasitol. — 2005. — Vol. 21(7). — P. 316-321.
11. Claes, F. Variable surface glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection of Trypanosoma evansi infections / F. Claes, M. Radwanska, T. Urakawa et al. // Kinetoplastid Biol. Dis. — 2004. — Vol. 3. — P. 3.
12. Clausen, P.H. A field study to estimate the prevalence of Trypanosoma equiperdum in Mongolian horses / P.H. Clausen, S. Chuluun, R. Sodnomdarjaa et al. // Vet. Parasitol. — 2003. — Vol. 115. — P. 9-18.
13. Lai, D.H. Adaptations of Trypanosoma brucei to gradual loss of kinetoplast DNA: Trypanosoma equiperdum and Trypanosoma evansi are petite mutants of T. brucei / D.H. Lai, H. Hashimi, Z.R. Lun et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2008. — Vol. 105(6). — P. 1999-2004.
14. Li, Fj. HCR approach for the detection of Trypanosoma brucei and Tr. Equiperdum and their differentiation from T. evansi based on maxicircle kinetoplast DNA / Fj Li, R.B. Gasser, D.H Lai., F. Claes et al. // Mol Cell Propes. — 2007. — Vol. 21(1). — P. 1-7.
15. OIE Terrestrial Manual. 2008. Chapter 2.5.3. P. 845-851. Режим доступа: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_stan-dards/tahm/2.05.03_D0URINE.pdf.
16. Интернет-ресурс. Режим доступа: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_TRY-PANO_SURRA.pdf.
17. Young, R. Isolation and analysis of the genetic diversity of repertoires of VSG expression site containing telomeres from Trypanosoma brucei gambiense, T.b.brucei and T. equiperdum / R. Young, J.E. Taylor, A. Kurioka, M. Becker et al. // BMC Genomics. — 2008. — Vol. 9. — P. 385.
18. Zablotskij, V.T. The current challenges of dourine: difficulties in differentiating Trypanosoma equiperdum within the subgenus Trypanozoon / V.T. Zablotskij, C. Georgiu, T. De Waal et al. // Rev. Sci. Tech. — 2003. — Vol. 22(3). — P. 1087-1096.
SUMMARY
Ch. Georgiou
All Russian Institute of Experimental Veterinary Medicine named after YR. Kovalenko (Moscow).
Antitripanosomosis ^ equiperdum Antigen. Received data showed that developed tripanosomosis exoantigen is specific, highly active and does not need significant expenses because initial material for manufacturing is earlier thrown out plasma of blood of infected animals. We proposed besiny antigen activity 95...97 % can be used to diagnose tripanosomosis of horses the ICFT, IHAT and ELISA.
