CC BY
80
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ Иммунология / паразитология ♦
УДК 619:616.085.37
Получение активных и специфических противобабезийных антигенов крупного рогатого скота
Х. Георгиу, доктор биологических наук (chgeorgiou@rambler.ru)
Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии» (ВИЭВ) (Москва).
Приведены результаты получения бабезийных соматических и экзоантигенов с активностью 95...97% от зараженных бабезиозом спленэктомированных животных для диагностических исследований в РДСК, РНГА и ИФА, их лиофилизации и сохранения.
Ключевые слова: антиген, бабезиоз, инвазия, ИФА, па-разитемия, РДСК, РНГА, экзоантиген Сокращения: ИФА — иммуноферментный анализ, КРС — крупный рогатый скот, РДСК — реакция длительного связывания комплемента, РНГА — реакция непрямой гемагглютинации
Введение
Кровепаразитарные болезни животных, вызываемые возбудителями, относящимися к семейству Babesidae, широко распространены во многих странах мира среди домашнего рогатого скота и диких парнокопытных, филогенетически родственных домашним. Эти болезни представляют большой интерес для науки, так как характеризуются своеобразием паразито-хозяинных взаимоотношений, иммуно-биохимического и клинического проявления. К бабезиозу восприимчив КРС всех возрастов и пород. К сожалению, бабезиоз наносит значительный вред животноводству.
У КРС возбудителями бабезиоза являются следующие кровепаразиты: Babesia bovis (Fr. colchica), В. bigemina (P. bigeminum), B. divergens.
К настоящему времени бабезиоз КРС зарегистрирован во многих странах Европы и Азии, во всех государствах Африки, Америки, Австралии, в Российской Федерации и в странах СНГ.
Пироплазмидозы протекают остро, подостро, хронически и сопровождаются лихорадкой, анемией, желтуш-ностью и кровоизлияниями на слизистых оболочках, ге-моглобинурией (при пироплазмозе — бабезиозе) и нередко заканчиваются гибелью животных [5...7].
Диагноз на пироплазмидозы ставят на основании эпи-зоотологических, клинических, патолого-анатомичес-ких данных и результатов лабораторных исследований (микроскопического, серологического).
Лабораторные исследования на бабезиозы (пироплазми-дозы) включают в себя микроскопию мазков крови, внутренних органов, головного мозга, пунктатов лимфатических узлов. При микроскопии, во-первых, обнаруживают пироплазмы (бабезии) в эритроцитах и клетках лимфо-идной ткани в виде различной формы шизонтов, при этом
цитоплазма пироплазмид окрашивается в голубовато-синеватый цвет, глыбки хроматина — в красно-фиолетовый или красный; а во-вторых, проводят морфологическую дифференциацию возбудителей. Пироплазмид дифференцируют между собой по их форме, углу соединения парных грушевидных форм, отношению их размера к радиусу эритроцита, локализации в эритроците, а также от анаплазм и эперитрозоон (табл. 1).
Лабораторные исследования на пироплазмидозы КРС также включают в себя постановку и учет РДСК, РНГА и ИФА с бабезийным антигеном.
Из вышесказанного видно, что проблема диагностики бабезиоза КРС по-прежнему остается актуальной.
Цель исследования
Выявить возможность получения антигенов, как соматических, так и экзоантигенов, из крови зараженных возбудителем бабезиоза спленэктомированных животных.
Материалы и медоды
Материалом для получения бабезийного антигена послужила кровь больных животных (КРС), инфицированных соответствующим возбудителем с пораженностью эритроцитов от 40...60% и более. Для получения выраженной паразитарной реакции животных спленэктомирова-ли. На высоте паразитемии животное обескровливали, но не позднее 5.8 дней с момента операции, чтобы избежать антикомплементарности антигена [3, 4].
Кровь собирали в стерильные колбы с антикоагулянтом из расчета 50 мл 20%-го раствора цитрата натрия на 1 л крови. Дальнейщую обработку крови проводили в день ее взятия или не позднее следующих суток по методике Х. Георгиу [1]. Полученный антиген консервировали и титровали в РДСК и ИФА с заведомо положительными и отрицательными сыворотками.
Экзогенные антигены из плазмы крови и надосадоч-ной жидкости (супернатанта), полученной после первого центрифугирования лизированных эритроцитов, выделяли посредством осаждения в 20%-м растворе полиэти-ленгликоля по стандартной методике и титровали в РДСК и ИФА (табл. 2).
1. Дифференциальная диагностика возбудителей бабезиоза рогатого скота
Возбудитель Форма Размер парных грушевидных форм по отношению к радиусу эритроцита Угол соединения парных форм Локализация
B. bovis Кольцевидная, амебовидная, грушевидная Равны Тупой В центре эритроцитов
B. bigemina Овальная, кольцевидная, круглая, амебовидная, грушевидная Больше Острый То же
B. divergens Круглая, амебовидная, грушевидная Меньше Тупой По периферии эритроцитов
B. ovis Круглая, кольцевидная » » В центре эритроцитов
Получение активных и специфических противобабезийных антигенов крупного рогатого скота
РДСК ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента» (утв. ГУВ Госагропрома СССР 6 мая 1988 года); РНГА — согласно «Методическим наставлениям по диагностике бабезиоза рогатого скота с применением эк-зоантигенов в РНГА» (утв. Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.06.2010 г.). ИФА проводили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики нутталлиоза лошадей в ИФА», одобренному Главным управлением ветеринарии 01.12.1989 г.
Полученный антиген проверяли на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Романовскому—Гимзе, на активность, отсутствие антикомплементарных свойств.
Для проверки антигена на активность его разводили физиологическим раствором в соотношении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64 и 1:128. Остальные компоненты, используемые в РДСК при определении активности антигена (сыворотки - позитивная, нормальная, гемолизин эритроциты барана), брали в рабочих дозах. Реакцию ставили по схеме, приведенной в таблице 2.
2. Схема постановки РДСК при определении активности бабезийного антигена
Компоненты реакции Разведение бабезийного антигена
1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Контроль
Антиген 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Одно разведение сыворотки 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Комплемент 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Холодильник при 2. ..4 "С — 18. При комнатной температуре — ■ ..20 ч 30 мин
Гемолитическая система 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Водяная баня при 37.38 "С — 20 мин Холодильник при 2...4 "С — 4.5ч
Результаты реакции оценивали по степени гемолиза и выражали в крестах:
«++++» — гемолиз отсутствует — реакция положительная;
«+++» — 25% гемолиза — реакция положительная;
«++» — 50% гемолиза — реакция положительная;
«+» — 75% гемолиза —реакция сомнительная;
«-» — 100% гемолиза — реакция отрицательная.
По этой схеме учитывали реакцию и с другими разведениями сыворотки.
Титром антигена считали то наибольшее разведение, при котором проходит 50%-я задержка гемолиза зрит-роцитов, с наибольшим разведением 1:20...1:40 позитивной контрольной сыворотки.
Антикомплементарные свойства антигена устанавливали в РДСК при определении активности и спенцифичнос-ти антигена путем добавления в пробирки двойной дозы антигена в рабочем разведении в присутствии комплемента, причем в пробирках не должно быть задержки гемолиза зритроцитов барана. После чего консервировали и определяли рабочий титр в РДСК в объеме 0,5 мл с положительными и отрицательными сыворотками. На специфичность антиген проверяли с сыворотками животных, перенесших паразитарные или инфекционные болезни не-протозойной природы.
Сублимационное высушивание приготовленных серий антигена проводили на базе ВГНКИ. Лиофилизиро-ванные серии антигена хранили в бытовом холодильнике (при 4 °С).
Результаты и обсуждение
Результаты титрования соматического и экзогенного (растворимого) бабезийного антигена приведены в табл. 3.
Титры супернатанта лизированных эритроцитов не уступали титрам экзогенного антигена, полученного из
3. Титры серий бабезийных антигенов
Соматический Экзоантиген
антиген из плазмы крови из супернатанта лизированных эритроцитов
РДСК ИФА РДСК ИФА РДСК ИФА
1:16 1:32 1:256 1:512 1:16 1:32
1:8 1:16 1:64 1:128 1:8 1:16
1:8 1:16 1:64 1:128 1:8 1:16
1:4 1:8 1:16 1:32 1:4 1:8
плазмы, и соматического антигена. По-видимому, определенное количество растворимого бабезийного антигена фиксируется на мембране эритроцитов и лейкоцитов, после лизиса которых переходит в супернатант.
Таким образом, опыты показали, что кроме соматических антигенов можно выделить и использовать в диагностике и экзоантигены.
Результаты исследования полученного бабезийного антигена на специфичность и чувствительность в РСК и РДСК с сыворотками крови от КРС и овец, зараженных анаплазмозом, бабезиозом и бруцеллезом, а также от здоровых овец и КРС приведены в табл. 4.
4. Определение специфичности бабезийного антигена в РДСК
Источник сыворотки Полученный результат при разведении сывороток 1:5 1:10 Бабезийный антиген
КРС, зараженный бабезиозом Положительный Положительный Отрицательный
Овца, зараженная бабезиозом
Здоровый КРС Отрицательный Отрицательный
Здоровая овца
КРС, переболевщий бруцеллезом
Овца, переболевшая бруцеллезом
Овца, переболевшая бабезиозом
Из данных, приведенных в табл. 4, видно, что эти сыворотки ни в одном случае, кроме сывороток, полученных от зараженных бабезиозом животных, не реагировали с бабезийным антигеном.
Кроме того, нами установлено, что предложенный антиген с активностью 95...97% можно использовать для диагностики бабезиоза в РДСК, РНГА и ИФА с аналогичным результатом.
Как видно из приведенных результатов, предложенный способ позволяет получить чувствительный и специфичный бабезийный антиген.
Выводы
Полученные нами результаты показывают, что кровь от зараженных бабезиозом спленэктомированных животных можно использовать для приготовления антигенов (соматических и экзоантигенов). Предложенный нами бабезийный антиген с активностью 95.97% пригоден для диагностики бабезиоза КРС в РДСК, РНГА и ИФА.
Библиография
1. Георгиу Х. Экспериментальный анаплазмоз овец (симптомокомплекс, иммунологические реакции) / Х. Георгиу: авто-реф. дис. ... канд. вет. наук, 1980 — 17 с.
2. Георгиу, Х. Методические наставления по диагностике бабезиоза рогатого скота /Х. Георгиу, ВТ. Заблоцкий // В сборнике «Современные средства и методы обеспечения ветеринарного благополучия по инфекционной и протозойной патологии животных. рыб и пчел». — М.: Агентство творческих технологий, 2011. — С. 160-162.
3. Георгиу, Х. Проверка антигенной структуры бабезийных антигенов / Х. Георгиу // Веткорм. — 2013. — № 4. — С. 27-28.
4. Георгиу, Х. Получение высокоактивных и высокоспецифичных противобабезийных сывороток крупного рогатого скота / Х. Георгиу // РВЖ. СХЖ. — 2014. — №3, — С. 10-11.
5. Гулюкин, М.И. Мониторинг эпизоотической ситуации по протозойным кровепаразитарным болезням домашних животных в Российской Федерации (2007-2012) / М.И. Гулюкин, В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко // РВЖ.СХЖ. — 2013. — №2. — С. 36-40.
6. Заблоцкий, В.Т. Профилактика кровепаразитарных болезней домашних животных / ВТ. Заблоцкий, В.В. Белименко // Веткорм. — 2013. — № 4. — С. 38-40.
7. Заблоцкий, В.Т. Бабезиоз (пироплазмоз) крупного рогатого скота. Часть 1. /В.Т.Заблоцкий, В.В.Белименко, НААхмадов // РВЖ. СХЖ. — 2012. — №1. — С. 43-44.
SUMMARY Ch. Georgiou
All-Russian Scientific Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after Ya.R. Kovalenko (Moscow).
Producing of Highly Active and Highly Specific Аntibabe-sю-sis Аntigens. The results of obtaining of besiny somatic and exogenic antigens with activity 95... 97% from splenectomised animals infected with babesiosis for diagnostic studies in ICFT, IHAT and ELISA, their lyophilizations and retention are given.
