CC BY
124
УДК 593.553.2
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ВНУТРИВИДОВОЙ СТРУКТУРЫ ПРОМЫСЛОВЫХ ВИДОВ РЫБ МЕТОДАМИ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ
Н. Ю. Шпигальская, О. А. Пильганчук, В. В. Савенков, А. С. Кустова, У. О. Муравская,
О. Н. Сараванский
Зав. лаб., н. с., ст. иссл., инж., тех., инж., Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии 683000 Петропавловск-Камчатский, Набережная, 18 Тел., факс: (4152) 41-27-01; (4152) 22-68-33 E-mail: shpigalskaya.n. u@kamniro.ru
ГОРБУША, НЕРКА, ЧАВЫЧА, МИНТАЙ, ТИХООКЕАНСКАЯ ТРЕСКА, МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК,
МИКРОСА ТЕЛЛИТНАЯ ЯДЕРНАЯ ДНК
Представлены результаты исследований с применением современных молекулярно-генетических методов выявления популяционной изменчивости у промысловых видов рыб — горбуши, нерки, чавычи, минтая и тихоокеанской трески, которые были получены в течение 2003-2011 гг. В анализе использованы частоты полиморфных генетических маркеров у особей из природных популяций, нагульных и нерестовых скоплений (более пяти тысяч рыб, около 100 выборок).
RESULTS ON STUDYING INTRASPECIFIC STRUCTURE OF COMMERCIAL FISH SPECIES WITH METHODS OF POPULATION GENETICS
N. Yu. Shpigalskaya, O. A. Pilganchuk, V. V. Savenkov, A. S. Kustova, U. O. Muravskaya, O. N. Saravansky
Head of the lab., scientist, probat.-researcher, еngineer, techn., Kamchatka Research Institute of Fisheries and Oceanography 683000 Petropavlovsk-Kamchatsky, Naberezhnaya, 18 Tel., fax: (4152) 41-27-01, (4152) 22-68-33 E-mail: shpigalskaya.n.u@kamniro.ru
PINK SALMON, SOCKEYE SALMON, CHINOOK SALMON, WALLEYE POLLOCK, PACIFIC COD, MITOCHONDRIAL DNA, MICROSATELLITE NUCLEUS DNA
Results of studies (2003-2011) on the base of modem methods of molecular genetics to assess population variation for commercial fish species, including pink salmon, sockeye salmon, chinook salmon, walleye pollock and pacific cod, have been demonstrated. Frequencies of polymorph genetic markers from fish of natural populations and foraging or spawning aggregations (more than five thousand individuals, about 100 samples) were used for the analysis.
Среди направлений современной рыбохозяйственной науки все большее значение приобретают популяционно-генетические исследования, результаты которых востребованы при решении как теоретических, так и практических задач рационального использования и управления рыбными ресурсами. Существование в пределах промысловых видов рыб генетически отличающихся, репродуктивно изолированных единиц хозяйственной деятельности — популяций — дает основание для утверждения, что успех прогнозирования и сохранения их численности на оптимальном уровне зависит от наличия, наряду с демографическими и экологическими данными, информации о генетической внутривидовой структуре.
До недавнего времени для выявления внутри-и межпопуляционной дифференциации, а также оценки биологического разнообразия азиатских популяций промысловых рыб, наиболее широко использовали такие маркеры генетической изменчивости как полиморфные белковые локусы, но в
последние десятилетия все большее значение приобретают работы на уровне ДНК.
В КамчатНИРО популяционно-генетические исследования на основе аллельной изменчивости белковых генов были начаты в 1970-х годах. До 2000-х гг. данный метод являлся единственным инструментом выявления и изучения популяционной структуры. Необходимо отметить важность более чем 20-летнего периода работ на основе белкового полиморфизма. Под руководством Н.В. Варнавской были проведены широкомасштабные исследования тихоокеанских лососей, охватившие большую часть ареалов пяти видов, результаты которых будут востребованы еще многие годы при анализе данных по генетической изменчивости внутривидовых структурных единиц (Варнавская, 2006). С 2003 г. применяются молекулярно-генетические методы, основные из которых — анализ полиморфизма длины ре-стриктных фрагментов (ПДРФ-анализ) митохондриальной ДНК (мтДНК) и анализ аллельной изменчивости микросателлитной ядерной ДНК (мсДНК).
Основной целью генетических исследований, проводимых в КамчатНИРО, является оценка уровня дифференциации популяций тихоокеанских лососей как основы для идентификации региональной принадлежности смешанных морских скоплений в период нагульных и преднерестовых миграций, а также выявление внутривидовой подразде-ленности единиц прогнозирования наиболее массовых видов морских промысловых рыб.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом для популяционно-генетических исследований на основе изменчивости митохондриальной и ядерной ДНК послужили выборки тихоокеанских лососей — горбуши, нерки, чавычи, а также морских промысловых рыб — минтая и тихоокеанской трески, собранные в период с 2001 по 2010 гг. сотрудниками различных лабораторий КамчатНИРО, МагаданНИРО, ХоТИНРО, а также Института биологии моря (ИБМ ДВО РАН им. А.В. Жирмунского). Весь использованный материал включает более пяти тысяч рыб.
Следует отметить, что до недавнего времени основным объектом генетических исследований являлись тихоокеанские лососи. В 2010 г. сотрудниками лаборатории популяционной генетики промысловых видов рыб начаты работы по выявлению генетической изменчивости минтая восточной части Охотского моря и трески прикамчатских вод Тихого океана.
Оценку генетической дифференциации четных поколений горбуши проводили по частотам гапло-типических вариантов мтДНК в 32 выборках из 25 локальностей (1612 экз.), нечетных — в 17 выборках из 16 локальностей (805 экз.). Региональную идентификацию смешанных скоплений горбуши проводили по материалам осенней траловой съемки 2009 г. — 13 выборок (595 экз.). Популяционную гетерогенность чавычи исследовали на основе частот гаплотипов в 13 выборках из рек Камчатки (579 экз.). Гаплотипическую изменчивость минтая анализировали на примере пяти выборок из восточной части Охотского моря (202 экз.; выборка № 1 — 55°30'3" с. ш., 154°39'7" в. д., выборка № 2 — 57°08'0'' с. ш., 154°46'6'' в. д., выборка № 3 — 58°41'4'' с. ш., 156°31'7'' в. д., выборка № 4 —51 °01 '3'' с. ш., 156°02'8'' в. д., выборка № 5 — 56°31'6'' с. ш., 143°50'5'' в. д.).
Оценку генетической дифференциации по аллельным частотам микросателлитных локусов ядерной ДНК (мсДНК) проводили для камчатских популяций нерки (15 выборок, 731 экз.), горбуши четного и нечетного поколений из рек о. Сахалин и
п-ова Камчатка (10 выборок, 558 экз.), минтая восточной части Охотского моря (138 экз.; выборки № 1, 2, 3) и тихоокеанской трески (257 экз.; выборка № 1 — 50°29' с. ш., 155°37' в. д., выборка № 2 — 51°43' с. ш., 158°16' в. д., выборка № 3 — 50°00' с. ш., 156°32' в. д., выборка № 4 — 51°07' с. ш., 157°40' в. д., выборка № 5 — 50° 18' с. ш., 156°22' в. д.).
Лабораторную обработку материалов для анализа гаплотипической изменчивости в десяти выборках горбуши 2008 г. возврата проводили в лаборатории генетики Института биологии моря под руководством д.б.н. Вл. А. Брыкова. Обработку материалов для анализа аллельной изменчивости мсДНК горбуши (за исключением выборок из р. Фирсовка) проводили в лаборатории генетических проблем идентификации Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН под руководством к.б.н. Г.А. Рубцовой и д.б.н. Л.А. Животовского. Все остальные материалы обработаны самостоятельно в результате поставленных и отработанных авторами методик в лаборатории популяционной генетики промысловых видов рыб ФГУП «КамчатНИРО».
Тотальную ДНК выделяли из ткани сердечной мышцы или фрагмента грудного плавника стандартным способом с использованием метода протеи-назного гидролиза в присутствии додецилсульфа-та натрия с последующим высаливанием белков, удалением их вместе с клеточными обломками, центрифугированием и осаждением ДНК из супернатанта изопропанолом (Маниатис и др., 1984; Sambrook et al., 1989).
Методика исследования полиморфизма длины рестриктных фрагментов мтДНК (ПДРФ-анализ)
Изменчивость мтДНК исследовали, используя рестрикционный анализ пяти участков, которые ам-плифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) (PCR Technology, 1989) с использованием праймерных последовательностей, разработанных на двух видах лососей — микиже, Oncorhynchus mykiss, и кижуче, Oncorhynchus kisutch (Zardoya et al., 1995; Gharrett et al., 2001). Обозначения исследуемых в данной работе участков мтДНК приведены на рис. 1.
Амплификацию проводили с использованием готовых лиофилизированных смесей для ПЦР GenePakPCR Core фирмы «ИзоГен» (Россия). Инкубационная смесь 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеотида (dTTP, dCTP, dATP, dGTP), 1,5 мкМ MgCl2, 50 нг геномной ДНК и 100 нг специфического праймера.
Реакцию начинали процессом денатурации в течение 3-5 мин при 94-95 °С, затем проводили 30-33 цикла, включающих 1 мин денатурации ДНК-мат-рицы при температуре 94 °С, 1 мин отжига праймеров при X °С и синтез новых цепей в течение 2,5-3 мин при 72 °С, затем следовала завершающая элонгация 5 мин при 68 °С (X° — температура отжига для индивидуальной пары праймеров варьировала в пределах 50-55 °С).
Изменчивость нуклеотидной последовательности горбуши анализировали, используя набор рес-триктных ферментов: Ddel, Hin6.l, Hinfl, MspI, Rsal, Cfr13.1; чавычи: BstNl, Hinfl, Mbol, Rsal, Ddel, TaqI, MspI, С£г13.1; минтая: Rsal, Haelll, Hinfl, Cfr 13.I, Hin6.l, Ama87l, Vspl, MspI.
После реакции эндонуклеазного гидролиза пробы подвергали электрофорезу в горизонтальном блоке 1,8-2% агарозного геля в трис-боратном буфере. Для определения молекулярной массы образующихся фрагментов использовали маркерный набор фрагментов ДНК, кратных 100 парам оснований. Фрагменты ДНК в геле окрашивали этидиумбромидом и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Результаты анализа изменчивости длины рес-триктных фрагментов мтДНК каждой особи по всем рестрикционным сайтам объединяли, получая, таким образом, комбинированные гаплотипы.
Методика исследования аллельной изменчивости мсДНК
Амплификацию проводили с использованием готовых лиофилизированных смесей для ПЦР GenePakPCR Core фирмы «ИзоГен» (Россия). ПЦР для микросателлитных локусов лососей — 0ne103, 0ne104, 0ne109 (Olsen et al., 2000), Oke3 (Buchholtz et al., 2001), Ssa197 (Olsen, Seeb, 1998), 0tsG68, 0tsG85 (Williamson et al., 2002), 0ts107
(Nelson, Beacham, 1999), Oki1a,b (Smith et al., 1998), Oki6 (Smith et al., 1998) — проводили по следующей схеме: денатурация в течение 2 мин при 94 °C, затем проводили 8 циклов, включающих: 1 мин при t=94 °C, 30 с отжига праймеров при X °C, 15 с элонгация при 72 °C; затем следовал 21 цикл, включающий: 30 с при 94 °C, 30 с X °C и 15 с при 72°C; завершающая элонгация 3 мин при 72°C (X° — температура отжига для индивидуальной пары праймеров варьировала в пределах 48-57,5 °C).
Схема ПЦР для микросателлитных локусов минтая и тихоокеанской трески — Gmo35, Gmo34, Gmo8, Gmo19, PGmo32 (Miller et al., 2000) — включала: денатурацию в течение 4 мин при 95 °С, затем 29 циклов, включающих 20 с денатурации ДНК-матрицы при 94 °С, 1 мин отжига праймеров при X °С и синтез новых цепей в течение 1 мин при 72 °С, затем следовала завершающая элонгация 5 мин при 72 °С; или для локусов Gma101, Gma102, Gma107, Gma108 (Canino et al., 2005): денатурацию в течение 2 мин при 95 °С, затем 5 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК-матри-цы при 95 °С, 1 мин отжига праймеров при 60 °С (-1 °С/цикл) и синтез новых цепей в течение 1 мин при 72 °С, затем 20 циклов, включающих 30 с денатурации ДНК-матрицы при 95 °С, 30 с отжига праймеров при X °С и синтез новых цепей в течение 30 с при 72 °С (X° — температура отжига для индивидуальной пары праймеров варьировала в пределах 45-60 °С).
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в вертикальном блоке 6%-го неденатурирующего акриламидного геля в 0,5х TBE-буфере, pH 8,0 (Маниатис и др., 1984) при напряжении 270-300 В в течение 2,0-2,5 ч. В качестве маркеров длин фрагментов использовали ДНК плазмиды pBR322, обработанную рестриктазами Hpall или HaelII. Электрофореограммы визуа-
1-----Г----Г"—I—П-------------------------1-1-1-Г
6000 8000 10,000 12,000 14,000
Base pairs
Рис. 1. Расположение ПЦР-амплифицированных фрагментов (обозначены горизонтальными отрезками) в соответствии с линейной генной картой митохондриальной ДНК позвоночных животных (по: Zardoya et al., 1995). * — фрагменты не использованы в настоящем исследовании
лизировали в результате окрашивания этидиум-бромидом и фотографировали в проходящем УФ-свете.
Статистическая обработка данных
Для оценки значимости межпопуляционных различий по частотам гаплотипов использовали методы F-статистики в пакете программ Arlequin ver. 2.000 (Schneider et al., 2000). Степень дифференциации популяций на основе частот аллелей микросателлитных локусов оценивали величиной Qst (аналог Fst) в пакете программ GDA (Lewis, Zaykin, 2001). Иерархический анализ молекулярной изменчивости исследуемых популяций выполняли в программе AMOVA (пакет программ Arlequin ver. 2.000).
Как мера количественных различий между популяциями, были вычислены генетические расстояния с использованием хордового метода (Cavalli-Sforsa, Edwards, 1967) и метода Нея (Nei, 1972). Полученная матрица количественных значений дивергенции между популяциями была использована для кластерного анализа (программы UPGMA и NJ, пакеты программ NTSYS и GDA) и построения дендрограмм (Rolf, 1990). Графическое изображение дендрограмм было получено в программе TreeView (http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/ rod/rteeview.html). Другим подходом к оценке генетического сходства популяций был метод многомерного шкалирования (Kruskal, 1964).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Тихоокеанские лососи
Горбуша. Длина исследованного участка Cytb/D-loop составляет 2720 пар нуклеотидов (п. н.), или около 15% всего митохондриального генома горбуши (Gharrett et al., 2001). Примеры электрофоретического разделения продуктов эндонук-леазного гидролиза в агарозном геле представлены на рис. 2. В результате анализа полиморфизма длин рестриктных фрагментов мтДНК в исследованных выборках четного и нечетного поколений горбуши было выявлено 59 комбинированных гаплотипов. У особей четной линии воспроизводства обнаружено 39 гаплотипических вариантов, у нечетной — 34. Общими для обоих поколений являются 14 комбинированных гаплотипов. Только три гаплотипа присутствуют во всех 49 исследованных выборках. Большая часть гаплотипов — 39 — оказались редкими и встречаются только в какой-либо одной из проанализированных локальностей. Распределения частот комбинированных гаплотипов в 25 популяциях горбуши четных лет и в 16 популяциях горбу-
ши нечетных лет воспроизводства представлены на рис. 3 и 4.
На основании изменчивости частот комбинированных гаплотипов подтверждены значимые различия между четным и нечетным поколениями горбуши. Полученные данные также свидетельствуют о неоднородности как четного, так и нечетного поколений горбуши азиатской части ареала. При попарном сравнении всех выборок (коэффициенты ^ ) значимые различия были обнаружены в 55,1% случаев. При анализе выборок четного поколения достоверные различия выявлены в 33,7% попарных сравнений, для выборок нечетного поколения достоверно различаются 33,8% пар выборок.
На основе частот комбинированных гаплотипов был проведен кластерный анализ. При представлении полученных результатов в виде ИРОМА-дендрограммы вся совокупность выборок образует два четко обособленных кластера линий четных и нечетных лет воспроизводства (рис. 5). Для выборок четных лет имеет место достаточно выраженная региональная подразделенность на северную и южную группы популяций (рис. 5, 6). Для выборок нечетного поколения кластеризация в соответствии с региональной принадлежностью отсутствует.
Оценки генетической дифференциации популяций горбуши четных лет показали, что величина изменчивости, приходящаяся на межрегиональную компоненту, заметно превышает долю межпопуля-ционной дисперсии внутри региональных групп популяций (табл. 1).
Нечетное поколение горбуши более дифференцировано на популяционном уровне, чем четное. Статистические оценки межпопуляционной изменчивости нечетной линии значительно превышают оценки межрегиональной изменчивости (табл. 2).
Исходя из полученных результатов, дифференциация четного поколения горбуши на уров-
Таблица 1. Иерархический анализ молекулярной изменчивости (АМОУА), наблюдаемой в четных поколениях горбуши
Вариант анализа Источник изменчивости Доля изменчивости, %
Все выборки Mежпопуляционная 1,88
Внутрипопуляционная 98,12
5 региональны« Mежгрупповая 2,10
групп популяций: Mежпопуляционная 0,30
Камчатка, о. Сахалин, в популяционных
р. Амур, Приморье, группах
материковое побережье Охотского моря Внутрипопуляционная 97,60
не регионов не вызывает сомнений. Что касается внутрирегиональной дифференциации, то этот вопрос требует продолжения исследований с подключением в анализ максимально возможного количества выборок из наиболее значимых нерестовых водоемов. Возможность использования полиморфизма фрагмента Су1Ь/Б-1оор мтДНК в качестве информативного регионального маркера для анализа смешанных уловов четного поколения горбуши представляется достаточно перспективной.
На основе популяционной изменчивости частот комбинированных гаплотипов горбуши линии четных лет п-ова Камчатка, о. Сахалин, рек северного побережья Охотского моря, Приморья и р. Амур была проведена вероятностная оценка точности идентификации особей из этих регионов. Вероят-
ность популяционной идентификации камчатской горбуши в целом невысока, точность ее находится в пределах 42,9-68,8%. Для популяций о. Сахалин, точность идентификации которых, в целом,
Таблица 2. Иерархический анализ молекулярной изменчивости (ЛМОУЛ), наблюдаемой в нечетных поколениях горбуши
Вариант анализа Источник изменчивости Доля изменчивости, %
Все выборки Межпопуляционная 3,10
Внутрипопуляционная 96,90
3 региональных Межгрупповая 1,00
группы популяций: Межпопуляционная 2,69
Камчатка, о. Сахалин, в популяционных
материковое побере- группах
жье Охотского моря Внутрипопуляционная 96,31
А В В В В В А Г М А В А А В В С
и- и-Ьии -
С/г 13.1
А А В Е А V В V м В V В V А V А
• * •— •—
— _ _ м * - •— ■ •— тт
= — тт *— — — тшт •—
_ м тят ц • ф — ~ •*- тшт
-"Р т 5? тт Рв
ССА АА АА А М В АА — — еве = е^мес В В А А ка ка В С ===== =
Ябо!
Т I А А А АА А М С А А ►-< ► * »>4 • • ► *• м і * м • - • фиф * * * "* С С А А і*4 фчф ■
Ніп/І
А А А А Є А М А А тшт щшт ш * * - — •:: ■ * А А А - - її
НіпбЛ Всієї
Рис. 2. Примеры электрофоретического разделения в агарозном геле рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Анализируемый участок — СуЛ/О-Іоор; эндонуклеазы рестрикции: С/г 13.1, Rsal, Ызр\ ИіпД, ИіпбІ, Ddel; А, В, С, Б, Е, Б, в, V — варианты расщепления, М — маркер молекулярного веса (+100 п. н.)
несколько ниже, данный показатель варьировал в больших пределах — от 40,8% до 83,2%. Горбушу бассейна р. Амур возможно идентифицировать с точностью 66,1%. Вероятность идентификации особей из рек Приморья и северного побережья Охотского моря находится на уровне 40,7-78,3%.
При оценке состава симулированных выборок на региональном уровне выявлено, что точность
Камчатка
р. Большая, 2008, 2010 р. Утка, 2008, 2010
р. Колпакова, 2010
р. Хайлюля, 2008
т. с,
р. Дранка, 2008
р. Палана, 2008
р. Хайрюзова, 2008
р. Коль, 2008
46 С17
Г—
і V А с,з
р. Апука, 2008, 2010 р. Навыринваям, 2010
Р. Амур
С20 1ІІС7І С1
идентификации в данном случае повышается до 94,2% для п-ова Камчатка, и до 84,7% для горбуши о. Сахалин (табл. 3). При раздельном выявлении групп популяций западного и восточного побережий Камчатки точность их идентификации снижается по сравнению с объединенным вариантом расчетов, хотя и остается на достаточно высоком уровне.
О. Сахалин
С17 | і
р. Водопадная, 2008
С15Л17С20 С21
р. Фирсовка, 2008, 2010
сго^2^647
р. Бахура, 2008, 2010
С21 ол/
сг
р. Урюм, 2010
р. Поронай,2010
С!'
С20 I
р. Найба, 2010
р. Айнская, 2010
р. Очепуха, 2010
Материковое побережье Приморье Охотского моря
С47 С50 С69
С17С47 С56.С67С6((
р. Наяхан, 2010
С17^2® С37
р. Тауй, 2010
р. Серебряная, 2008
С'Ч_ I .. а«еи, °“ о.
р. Яма, 2010 р. Ботчи, 2008
Для оценки возможности использования полученных данных по гаплотипической изменчивости митохондриальной ДНК горбуши при идентификации смешанных морских скоплений была проведена их апробация (Шпигальская и др., 2011). Материал для анализа регионального состава нагуливающейся молоди горбуши был собран в период проведения осенней траловой съемки в 2009 г. на НИС «Профессор Кагановский» в объеме 595 экз. В качестве реперной базы данных использовали частоты гаплотипов в выборках производителей четного поколения горбуши из девяти камчатских нерестовых рек, восьми локальностей о. Сахалин и из р. Амур (всего 980 особей).
В результате суммарной идентификации всех смешанных выборок, доли особей различных регионов воспроизводства распределились следующим образом: Западная Камчатка — 52,4%, Во-
сточная Камчатка — 7,2%, о. Сахалин — 27,1%, р. Амур — 11 ,9%, неизвестные — 1,4% (Шпигальская и др., 2011). Можно предположить, что наблюдаемое осенью 2009 г. в районах смешения соотношение молоди различных регионов воспроизводства, при условии равной морской смертности, сохранится и к моменту возврата производителей на нерест. Полученные в настоящем исследовании оценки сравнили с региональным соотношением подходов горбуши в 2010 г., когда произошел возврат анализируемого поколения на нерест в регионы воспроизводства. Сравнение расчетных оценок и фактических данных позволяет сделать вывод об их достаточно высоком соответствии (рис. 7).
В 2010 г. начаты исследования по аллельной изменчивости мсДНК в локальных популяциях горбуши. Были апробированы 44 микросателлитных локуса — 0пе102, 0пе103, 0пе104, 0пе109,
Oke3, 0my301, OmylOll, Ssa197, Ssa20.19, 0tsG68, One 100, One 101, One 106, One 108, One 110, One 111, One 114, One115, Oki1, Oki2, Oki3, Oki7, Oki9, Oki10, Oki13, Oki18, Oki20, Oki23, Oki100, Ogo1a, Ogo2, Ogo5, Ogo8, Ots1,
Ots2, Ots3, 0ts103, Oke5, Oke8, Oke9, Oke 11, Ssa419, Ssa417, F43. Большинство из них оказались непригодными для анализа микросателлитной изменчивости горбуши вследствие того, что не происходит отжиг праймеров (в нуклеотидной по-
Поколения четных лет
Lr^
г
• р. Амур, 1004
> р. Поронай, 1010
• р. Серебряная, 2008
■ р. Амур, 2010
• р. Водопадная, 2003
■р.Бахура.ШЗ
■ р. Фирсовка, 2010
.р. Наймом
■ р.Бахура, 2010
■ р. Фирсовка, 2003
• р.0чепуха,2010
■ р. Айнская, 2010
з-e Николая, 3
Р. Амур
Приморье
О, Сахалин
Поколения нечетных лет
• р. У пса, 2010
* р. Крлпакова, 2010 р. Коль, 2003
р. Большая, 2010 р.Тауй, 2010 р, Хайрюзова, 2008* р. Коль, 2003' р.Хайлюля,2008 р. Налит, 2010 р. Яма, 2010 р. Большая, 2008 р. Навыринваям, 2010 р. Апука, 2010 р, Палана, 2008 р. Дранка, 2008 р. Утка, 2003 р. Апука, 2008 р. Б от ни, 2003 р.Урмм, 2010 р.О чепуха,2009 р.Тауй, 2009
р. Большой Гарамай, 2009 р. Поронай, 2009 р. О ссор а, 2009 р. Тымь,2009 р. Айнская, 2009 р.Авача, 2009 р. Дранка, 2009* р.Бахура, 2009 р. Дранка, 2007 р, Фирсовка, 2009 р. Большая, 2009 р. Колпакова, 2009 р. Палана, 2009 р.Кихчик,2009 р. Хайлюля, 2009
Материковое побережье Охотского моря
Камчатка
О. Сахалин
Камчатка
0.96
—Г—
0.72
7oi
Coefficient
Рис. 5. UPGMA-дендрограмма, построенная на основе хордовых генетических расстояний (Cavalli-Sforsa, Edwards, 1967), вычисленных по частотам комбинированных гаплотипов горбуши различных регионов (49 выборок)
• Камчатка
♦ Материковое побережье Охотского моря ч
#0. Сахалин •
•Р. Амур \ \
^ \ / ^ N • ч S
X "Ч \ / . \ / \ •• • \ ч • •: -\
/ в • • \ V Северные популяции
г 1 1 I
\ * • /
\ . /
\ /
Южные популяции^ .. _
-1,88 -1,17 -0,47 0,24 0,95
следовательности отсутствуют специфичные участки) или размер ПЦР-продукта не позволил интерпретировать полученные результаты. Выявлено десять высокополиморфных локусов (первые в вышеприведенном списке), использование которых в качестве маркеров межрегиональной изменчивости горбуши представляется перспективным, по шести из них проанализированы частоты аллелей в десяти выборках из рек Камчатки и о. Сахалин.
Пять из шести локусов горбуши (табл. 4) характеризуются тетра-нуклеотидными повторами.
Р. Амур
Рис. 7. Региональное соотношение молоди из морских нагульных скоплений (осень 2009 г.) уловов и нерестовых подходов горбуши в 2010 г.: I — результаты идентификации по генетическим данным; II — подход производителей (фактический вылов и заполнение нерестилищ) (по: Шпигальская и др., 2011)
Исключением является локус ОквЗ, имеющий три-надцати-нуклеотидные повторы основного мотива. На рис. 8 представлены примеры электрофоретического разделения аллельных вариантов. Число обнаруженных аллелей в разных локусах колебалось от 12 до 44. Всего в исследованных выборках обнаружено 164 аллеля. Среднее число аллелей на локус составило 27,3. Следует отметить, что этот показатель свидетельствует об очень большой изменчивости исследуемого вида по данному типу генетических маркеров. Например, при изучении популяционной структуры кеты, когда в анализ было включено 10 микросателлитных локусов и 852 экз. рыб, среднее число аллелей на локус составило 12,5 (Рубцова, 2008). В связи с тем, что исследованные локусы у горбуши характеризуются очень высоким уровнем полиморфизма, ни по одному из них не был обнаружен четко выраженный основной аллель. В выборках из различных популяций число выявленных аллельных вариантов микросателлитных локусов заметно различалось. Межпопуляционные различия в распределении частот аллелей отражены на рис. 9 и 10. Диапазон варьирования числа аллелей в исследованных выборках изменялся от 7 до 28. Можно отметить, что поколения горбуши четных и нечетных лет воспроизводства заметно различаются не только по чис-
Таблица 3. Оценка регионального состава симулированных смешанных выборок горбуши поколения четных лет, % (в скобках указано стандартное отклонение. Оценки, выделенные жирным шрифтом, теоретически должны быть равны 100%)
I вариант анализа
№ Регион 1 2
1 Северные популяции 93,6(6,3) 12,8
2 Южные популяции 6,0 86,8(7,3)
Неизвестные 0,4 0,4
II вариант анализа
№ Регион 1 2 3 4 5
1 О. Сахалин 84,7(9,8) 19,3 12,0 14,2 2,3
2 Р. Амур 2,2 66,1 (14,1) 0,1 0,4 0,1
3 Материковое побережье
Охотского моря 2,8 2,3 52,0(167) 3,7 2,6
4 Приморье 2,7 2,4 2,8 64,5(14,2) 0,4
5 Камчатка 7,5 8,8 32,4 16,1 94,2(6 2)
Неизвестные 0,1 1,1 0,7 1,1 0,4
III вариант анализа
№ Регион 1 2 3 4 5 6
1 О. Сахалин 84,7(9,8) 19,3 12,0 14,2 2,4 2,1
2 Р. Амур 2,2 66,1 (14,1) 0,1 0,4 0,0 0,1
3 Материковое побережье
Охотского моря 2,8 2,3 52,0 (16,7) 3,7 3,5 5,6
4 Приморье 2,7 2,4 2,8 64,5(14 2) 0,3 0,4
5 Западная Камчатка 4,9 2,5 11,5 11,6 74 7 (14,3) 23,6
6 Восточная Камчатка 2,6 6,3 20,9 4,5 18,6 68,0
Неизвестные 0,1 1,1 0,7 1,1 0,5 0,2
лу выявленных аллелей для каждого из локусов, но и по частоте их встречаемости.
При попарном сравнении всех выборок значимые различия были обнаружены в 27 случаях из 45. Следует отметить, что между выборками из р. Фирсовка нечетных лет (2003 и 2009 гг.), также как и между выборками четных лет (2004 и 2010 гг.), достоверных отличий не выявлено, что указывает на временную стабильность данных генетических признаков.
Для оценки уровня межпопуляционных различий на основе изменчивости частот аллелей микроса-теллитных локусов были рассчитаны генетические дистанции Нея (Nei, 1972) и хордовые расстояния (Cavalli-Cforza, Edwards, 1967). Результаты мно-
гомерного шкалирования хордовых генетических расстояний представлены на рис. 11. Все выборки разделились на две неперекрывающиеся, дифференцированные области четных и нечетных лет воспроизводства. Расположение в трехмерном пространстве выборок из р. Фирсовка 2004 и 2010 гг., также как и нечетных лет — 2003 и 2009 гг., отражает их сходство по исследованным локусам мсДНК.
Таким образом, можно заключить, что полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о временной стабильности частот микросателлитных локусов. Межгодовая изменчивость исследованных выборок не является статистически значимой, в то время как межпопу-ляционная — в большинстве случаев попарных
Опе109 Ої$С68
Рис. 8. Примеры электрофоретического разделения в акриламидном геле аллельных вариантов микросателлитных локусов 0пе103, 0пе104, 0пе109, ОкеЗ, &а197, OtsG68 горбуши. М — маркер молекулярного веса (рБК322/ИраМ)
сравнений достигает уровня достоверности. Частоты аллельных вариантов могут быть использованы для создания базы генетических данных, не требующей ежегодного обновления популяционных характеристик и пригодной для использования в различных направлениях популяционных исследований в течение длительного периода времени.
Нерка. Для выявления и оценки региональной дифференциации нерки была проведена апробация 26 локусов мсДНК — 018107, ОкИа, ОкИЬ, 0т104, 0пе109, 018068, 018085, ОЫб, 01и108, 01и2, 01и3, 01и100, 01и103, 0ту77, 0пе102, 0пе8, 0пе103, 0ке3, 0ту301, 0ту1011, ^иа197,
^иа20.19, 0тт10370, 0go20, ^иа197, 0тт1070. Так же, как и при исследовании горбуши, большая часть локусов оказалась непригодной для анализа микросателлитной изменчивости — объективная интерпретация результатов была невозможна из-за размера ПЦР-продукта или имело место затрудняющее отжиг праймеров несоответствие специфичных участков ДНК-матрицы используемым праймерным последовательностям. Для дальнейшего анализа нерки были отобраны восемь полиморфных микросателлитных локусов (первые в вышеприведенном списке).
Семь из восьми локусов характеризуются тет-ра-нуклеотидными повторами, исключение — ло-кус 0клб, являющийся динуклеотидом. На рис. 12
представлены примеры электрофоретического разделения аллельных вариантов. Число обнаруженных аллелей в исследованных локусах колебалось от 6 до 26 (табл. 4). Всего в 15 выборках выявлено 110 аллельных вариантов. Среднее число аллелей на локус составило 13,8. Межпопуляционные различия в распределении аллельных частот восьми микросателлитов представлены на рис. 13-20.
Локусы 0пе109, 0пе104, 0ts085 характеризуются высоким уровнем полиморфизма (18, 25 и 26 аллелей соответственно), четко выраженный основной аллель у них не выявлен. Для 0ts107 отмечено наличие основного аллеля (116 п. н.), в северных популяциях восточного побережья Камчатки он представлен с частотой 0,90-0,98. По ло-кусу 0кИа наблюдается наличие основного аллеля (148 п. н.), преобладающего во всех выборках (с частотой 0,56-0,70), кроме лагуны Северной, где происходит смена доминирующего аллеля (156 п. н.). Для локуса 0кИЬ основной аллель (112 п. н.) доминирует во всех популяциях (0,53-0,88), кроме р. Бушуйка, где наблюдается смена основного аллеля (116 п. н.). По локусу 0ts068 в девяти популяциях в наибольшей степени представлен аллель с длиной 140 п. н. (0,490,68), в остальных популяциях доминирует аллель 144 п. н. (0,48-0,58%). Локус 0Ы6 характеризуется преобладанием аллеля с длиной 88 п. н.
Таблица 4. Характеристика использованных в анализе микросателлитных локусов горбуши, нерки, минтая и тихоокеанской трески
Локус Горбуша Нерка Минтай Треска
N аллелей/ N особей Размер фрагмента, п. н. N аллелей/ N особей Размер фрагмента, п. н. N аллелей/ N особей Размер фрагмента, п. н. N аллелей/ N особей Размер фрагмента, п. н.
0пе103 44/550 114-326 - - - - - -
0пе104 37/551 108-316 25/722 104-204 - - - -
0пе109 18/547 124-188 18/716 108-180 - - - -
0ке3 12/549 231-400 - - - - - -
^а197 21/551 119-203 - - - - - -
0tsG68 32/551 128-292 8/724 128-156 - - - -
0ts107 - - 9/728 84-132 - - - -
0кі1а - - 9/723 124-164 - - - -
0кі1Ь - - 6/725 92-124 - - - -
0tsG85 - - 26/711 128-242 - - - -
0кі6 - - 9/711 74-100 - - - -
Gmo35 - - - - 6/137 113-131 5/247 113-125
Gmo34 - - - - 14/138 90-186 26/245 110-208
Gmo8 - - - - 34/138 162-406 45/240 150-402
PGmo32 - - - - 6/138 107-128 9/248 104-131
Gmo19 - - - - - - 29/232 120-240
Gma101 - - - - - - 21/220 137-253
Gma102 - - - - - - 16/224 192-252
Gma107 - - - - - - 14/210 164-216
Gma108 - - - - - - 15/221 190-250
(0,53-0,64) во всех популяциях, кроме р. Апука, где отмечено преобладание особей с основным аллелем 76 п. н. (0,60).
Оценки межпопуляционной дифференциации
по микросателлитным локусам заметно раз-
личались (табл. 5). Максимальный вклад в дифференциацию нерки исследованных локальностей внес локус 0ts107. При девяти выявленных аллелях значение $5^ оказалось равным 8,3%. Минимальный вклад внес локус 0ts085 — 0,1% (26 ал-
Таблица 5. Дифференциация популяций нерки (в %) по микросателлитным локусам
0ts107 Okila 0к11Ь 0ne104 0ne109 0tsG68 0tsG85 0ki6 Среднее 95%-й бутстреп-интервал
нижний верхний
8,3
1,1
5,2
1,5
1,1
4,3
0,1
3,3
2,6
1,3
4,3
Линия нечетных лет
Линия четных лет
■ р.Большая;2009 ■р.Лангры, 2009
■ р.Хайлюля, 2009 1 р.Фирсовка, 2003
1 р. Поронай, 2009 1 р.Фирсовка, 2009
■р.Фирсовка, 2004 "р.Фирсовка, 2010 ■ р. Большая, 2008 ■ р.Хайлюля, 2008
On el 04
1 р. Хайлюля, 2009 1 р.Фирсовка, 2003
р. Поронай, 2009 р. Фирсовка, 2009
■р.Фирсовка,2004 ■ р.Фирсовка, 2010 "р.Большая,2008 ■ р.Хайлюля,2008
Onel 09
124 128 132 136 140 144 148 152 156 160 164 168 172 176 180 184 188
■ р. Большая, 2009
■ р. Лангры, 2009
■ р.Хайлюля, 2009 1 р.Фирсовка, 2003
■ р. Поронай, 2009 1 р.Фирсовка, 2009
124 128 132 136 140 144 148 152 156 160 164 168 172 176 180 184 188 ■ р.Фирсовка, 2004 ■ р.Фирсовка, 2010 ■ р.Большая,2008 ■ р.Хайлюля,2008
Рис. 9. Распределение частот аллелей микросателлитных локусов 0ne103, 0ne104, One 109 в выборках горбуши линий четных и нечетных лет (по оси абсцисс указаны аллельные варианты, по оси ординат — суммарная частота аллелей в исследованных популяциях; цветом обозначена доля каждой популяции в суммарной частоте выявленных аллелей)
лелей). Можно отметить, что высокополиморфные локусы оказались для проанализированных выборок наименее дифференцирующими.
В среднем, величина межпопуляционной дифференциации по всем локусам составила 2,5% и оказалась статистически значимой (95%-й бутстреп-интервал положительный, нижняя граница 1,3).
Кластеризация исследованных выборок на основе генетических дистанций, вычисленных по частотам аллелей восьми микросателлитных локусов, отражает степень их генетического сходства (рис. 21).
На представленной №-дендрограмме выборки сформировали три четко выраженных кластера — оз. Курильское, р. Камчатка и реки северо-восточной части побережья. В каждом из двух последних кластеров имеют место две внутренние ветви.
В кластере, образованном выборками нерки из оз. Курильское, дифференциация статистически незначима, в среднем по восьми локусам она составила 0,02% (нижняя граница бутстреп-интерва-ла имеет отрицательную величину -0,003). Внутри остальных групп выборок межпопуляционная дифференциация во всех случаях оказалась стати-
Рис. 10. Распределение частот аллелей микросателлитных локусов 0ке3, 88'а197, 0(8068 в выборках горбуши линий четных и нечетных лет (по оси абсцисс указаны аллельные варианты, по оси ординат — суммарная частота аллелей в исследованных популяциях; цветом обозначена доля каждой популяции в суммарной частоте выявленных аллелей)
стически значима (нижняя граница бутстреп-ин-тервала варьировала в пределах 0,003-0,020), но величина полученных оценок заметно ниже вышеприведенного значения Qst (2,5%), когда в анализ была включена вся совокупность выборок. Так, в кластере оз. Азабачье (р. Пономарка и р. Бушуй-ка) дифференциация составила 0,8%, внутри кластера, образованного популяциями р. Камчатка — 0,8%, в кластере Олюторско-Наваринского района (р. Апука, лагуна Анана, лагуна Северная) — 1,6%, внутри кластера, образованного популяциями р. Хайлюля, р. Ивашка, р. Навыринваям — 1%.
Таким образом, можно отметить, что уровень межрегиональной дифференциации нерки значительно превышает уровень межпопуляционной дифференциации внутри выделенных региональных групп популяций, что является подтверждением высокой дискриминирующей способности использованных маркеров популяционно-генетической изменчивости.
Чавыча. Длина амплифицированных в результате ПЦР участков мтДНК в сумме составляет почти 7000 пар нуклеотидов, или около 40% всего митохондриального генома чавычи (Wilhelm et al., 2003). В результате ПДРФ-анализа было выявлено 53 рестриктных сайта («1,5% митохондриального генома), из которых только 6 оказались полиморфными (Шпигальская и др., 2008; Шпигальская, 2010). Примеры электрофоретического разделения продуктов эндонуклеазного гидролиза в агарозном геле представлены на рис. 22.
Объединённые данные, полученные в результате анализа трёх фрагментов мтДНК по всем сайтам рестрикции и использованным эндонуклеазам, позволили выявить 11 комбинированных гап-лотипов у 579 исследованных особей чавычи Камчатки. Распределения частот комбинированных
вых генетических расстояний, вычисленных по частотам аллелей микросателлитных локусов горбуши (красным цветом обозначены выборки о-ва Сахалин)
гаплотипов в 13 популяциях чавычи представлены на рис. 23.
В результате анализа количества нуклеотидных замен во всех гаплотипических вариантах при попарном сравнении популяций выявлено максимальное число нуклеотидных замен — девять — в выборке из р. Большая, минимальное — одна нуклеотидная замена, между двумя гаплотипами — у чавычи рек Кихчик и Авача.
Частоты и варианты гаплотипов в исследованных выборках заметно различались. Среди особей из р. Большая удалось выявить наибольшее количество гаплотипов — шесть, в остальных популяциях азиатской части ареала их количество варьировало от двух (рр. Авача, Жупанова, Палана, Коль, Кихчик) до пяти (р. Пымта).
Анализ частот гаплотипов с использованием псевдовероятностного теста на гомогенность позволил оценить уровень неоднородности чавычи исследованных популяций. Вероятность гомогенности сравниваемых выборок оказалась равна нулю (Шпигальская и др., 2008).
В результате применения методов Б-статис-тики для оценки уровня генетической дифференциации азиатских популяций чавычи было выявлено, что между большинством сравниваемых пар значимые различия отсутствуют. На азиатской части ареала пять выборок (рр. Палана, Пымта, Коль, Воровская, Авача) при попарном сравнении значимо отличаются более чем от половины включенных в анализ локальностей. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что, несмотря на достоверный уровень гетерогенности чавычи на изучаемой части ареала по структуре мтДНК, межпопуляционная дивергенция в целом невелика даже с учётом того, что в отдельных случаях величина выраженности отличий между популяциями достигает значимого уровня.
Расчет матрицы дивергенции по нуклеотидным последовательностям между популяциями чавычи Камчатки показал, что максимальное значение различий (около 0,02% нуклеотидных замен) имеет место между выборкой из р. Палана и остальными. ИРОМА-дендрограмма на основе матрицы представлена на рис. 24. Кластеризация выборок на дендрограмме не формирует четкой картины дифференциации популяций чавычи Западной и Восточной Камчатки.
Оценки генетической дифференциации популяций чавычи показали, что на долю внутрипопуляционной генетической дисперсии приходится 95,98%, на долю межпопуляционной — 4,02%. В другом варианте
расчета популяции объединяли в две группы в соответствии с географической принадлежностью — Западная Камчатка и Восточная Камчатка. При таком объединении выявляется близкая к нулю величина изменчивости, приходящаяся на межгруп-повую компоненту. Доля межпопуляционной дисперсии внутри групп составляет 3,95%, а доля внут-
рипопуляционной изменчивости (96,01%) незначительно увеличивается по сравнению с предыдущим вариантом анализа (Шпигальская и др., 2008).
Вероятной причиной неглубокой дивергенции камчатских популяций чавычи по структуре мтДНК может являться их исторически недавнее происхождение в сочетании с относительно более низкой, чем
156 156 156 156 Ш 1?6 14S15>‘fR
148 14$ 148 148 148 148 148 148 148 148 148 148 148 148 148 148
114 ¿У 114 п0 114 114114
114 114 114 114
hq- ] ¿а
ПО 114 110 ПО 110 110
114 п<э п2
ПО ПО 110 110 110 110 110 110 110 110 110110
140¿3,
1361?
j4^ 144 144 і 144 140 140
144
140
156
¿44 Н4 144 ¿44 „Г44І44В?І40 144
144 144 144 144 144
W ' ' 140
144 140 144 140 140 «О
Окі 1 а (верхний), ОкИЪ (нижний)
188 180 ■ 18£ 184180 і
160 164
204 212 204 188, ,188 200 ш’ ' t180 ш, 204 180
192 176 Мч
» -4 176 *• -« 172
168 *160 168 160 ММ 156 1Й 164 152 164
OtsG68
м M
116Ц6 ’‘"üáiiá116 Tff 116116 116 116 116 ііб 116 116 116 116 <íS¿4tó116116 0116 116 П6 116116
ЩЛ 88
OtsG85 Otsl 0 7
13.16' -П6 I«4 168 168 160 ..
Ж ™ ‘160* 164 164 т 84
•SS
136 ,„„.136 136 ¿«¿
132 П2 13?. t t -* U 132
Sff Ніякій " bj s?1*
116
136. „ L - i36 • 136 ¿40 76 76 76 76 84 76 ¿¡§¿2* . Á
32. I La .132 . - 76 76 V 76 76 76 76 ™ n 76 76 76 Тб
Onel 04 Okió
0nel09
Рис. 12. Примеры электрофоретического разделения в ак-риламидном геле аллельных вариантов микросателлит-ных локусов Окїіа, ОкїІЬ, OtsG85, 0пе104, OtsG68, 0ґ8І07, 0кi6, 0ne109нерки. М — маркер молекулярного веса (pBR322/Hpаll)
у других тихоокеанских лососей, скоростью смены генераций, обратная зависимость между которой и уровнем изменчивости мтДНК других видов лососей была показана ранее (Брыков, 2001). Недавнее происхождение большинства популяций чавычи в реках Камчатки подтверждается также «звездча-
той» структурой генеалогической сети гаплотипов мтДНК (Шпигальская и др., 2008). Можно предположить, что относительно небольшая глубина межпопуляционной дивергенции свидетельствует о независимой эволюции камчатских популяций в течение исторически небольшого временного перио-
оз. Курильское 08.07.2010 оз. Курильское 06.08.2010
оз. Курильское 25.08.2010 р. Пономарка
р. Бушуґіка
р. Киревна
р. Камчатка
оз. Двухъюрточное
р. Еловка
р. Ивашка
р. Хайлюля р. Навырпнваям
Л
р. Апука
лагуна Анана
лагуна Северная ■ 124 В128 □ 140 1144 ИІ43 ■ 152 0156 ИІ60 ВІ64
оз. Курильское 08.07.2010 оз. Курильское 06.08.2010
І» 0,
оз. Курильское 25.08.2010 р. Пономарка
р. Бушуйка
V
р. Камчатка
оз. Двухъюрточное
■V
р. Еловка
5
р. Хайлюля
р. Ивашка
р. Навыринваям
р. Апука
лагуна Анана
лагуна Северная 3104 ■ 108 0112 «116 ■ 120 ■ 124
да, что подтверждается также низкой (менее 5%) долей генетической изменчивости, приходящейся на межпопуляционную компоненту. Высказано предположение, что максимальное время дивергенции для камчатских популяций чавычи, величина различий между которыми составляет около 0,02% нуклеотидных замен, соответствует оценке во временном интервале, не превышающем 10-20 тыс. лет (Шпигальская и др., 2008; Шпигальская, 2010). Вероят-
но, отступление позднеплейстоценового ледника обусловило начало процессов расселения, реколонизации и формирования современной картины под-разделенности вида на структурные компоненты. Представленные ранее палеогеографические данные показывают, что описанные особенности межпо-пуляционной генетической дифференциации согласуются с историей позднеплейстоценовых оледенений, которые имели место на Камчатке и побережье Охот-
лагуна Северная BS4 ass DIOS ■ 112 В116 □ 120 □ 124 B12S П152
Рис. 15. Распределение частот аллелей микросателлитно-го локуса OtsG85 в исследованных выборках нерки (в легенде указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов)
лагуна Северная □ 128 В132 В136 □ 140 В144 □ 143 П152 В156
Рис. 16. Распределение частот аллелей микросателлитно-го локуса 0пе104 в исследованных выборках нерки (в легенде указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов)
ского моря (Баранова, Бискэ, 1964; Мелекесцев и др., 1974; Глушкова, 1984; Беспалый, Глушкова, 1987).
Морские промысловые рыбы Минтаи. Суммарная длина трёх амплифици-рованных участков мтДНК — Cytb/D-loop, ND3/ ND4L/ND4, ND5/ND6, составляет около 7400 п. н., или немногим менее половины общей длины всей мтДНК минтая (Mulligan et al., 1992). На началь-
ном этапе исследования были проведены апробация и последующий отбор информативных рестрикционных эндонуклеаз, выявляющих полиморфные сайты в исследуемых фрагментах мтДНК. Всего апробировано 12 рестриктаз — Я^ъа^ ИаеШ, ИтД, С/г13.1, Итб.1, Ата871, VspI, Ызр1, StyI, Ика1, Тац1, Муа1, из которых восемь были отобраны для дальнейшего использования в ПДРФ-анали-зе (первые в вышеприведенном списке).
■\
оз. Курильское 08.07.2010 оз. Курильское 06.08.2010
оз. Курильское 25.08.2010 р. Пономарка
р. Киревна
У
оз. Двухъюрточное
р. Бушуйка !
р. Камчатка
3
р. Еловка
ш
р. Ивашка
*
р. Апука
р. Хайл юля р. Навыринваям
чЗ
лагуна Анана
оз. Курильское 08.07.2010 оз. Курильское 06.08.2010
оз. Курильское 25.08.2010 р. Пономарка
V
лагуна Северная 074 176 □ 78 В82 0 34 в86 I 83 В92 В100
Рис. 17. Распределение частот аллелей микросателлитно-го локуса 0tsGб8 в исследованных выборках нерки (в легенде указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов)
лагуна Северная □ 108-120 ■ 124-128 Ш132-136 «140-142 В144-148 ш 152-156 В160-164 В168-172 В176-180
Рис. 18. Распределение частот аллелей микросателлитно-го локуса 0ts107 в исследованных выборках нерки (в легенде указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов)
Примеры электрофоретического разделения в агарозном геле рестриктныгх фрагментов мтДНК минтая приведены на рис. 25. Всего в результате ПДРФ-анализа выявлено 49 комбинированных гап-лотипов у 202 проанализированных особей. Распределения частот гаплотипов (01-049) в исследованных выборках представлены на рис. 26. Пять гап-лотипических вариантов оказались общими для всех исследованных выборок. Большая часть гаплотипов — 33 — оказались редкими и выявлены
только в какой-либо одной из выборок. Наибольшее количество гаплотипов — 21 — обнаружено в выборке № 1, в остальных количество гаплоти-пических вариантов варьировало от 15 до 18.
Анализ с использованием теста на гетерогенность всей совокупности выборок по всем гапло-типическим вариантам подтвердил их однородность (Х2=212, Р=0,154). Расчет коэффициентов Рэ! при попарном сравнении выборок на основе изменчивости частот комбинированных гаплотипов по-
Рис. 19. Распределение частот аллелей микросателлитно-го локуса Окгб в исследованных выборках нерки (в легенде указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов)
Рис. 20. Распределение частот аллелей микросателлитно-го локуса 0пе109 в исследованных выборках нерки (в легенде указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов)
казал, что статистически значимые различия имеют место только в четырех из десяти случаев. Выборка № 2 достоверно отличается от всех, кроме № 1. Выявлено, что выборки № 3 и № 1 неоднородны на статистически значимом уровне. Выборки № 3, 4, 5 оказались гомогенны по данной системе генетических маркеров.
Кластеризация выборок в соответствии с генетическими расстояниями по N01, 1972, вычисленными на основе частот гаплотипов, отражает уровень генетических различий между исследованными выборками (рис. 27). Наиболее генетически своеобразной оказалась выборка № 2, что соответствует результатам попарных сравнений.
Таким образом, предварительные данные по гап-лотипической изменчивости мтДНК минтая северовосточной части Охотского моря позволяют отметить невысокий уровень различий между выборками, но для более обоснованных выводов о популяционной однородности на данной части видового ареала необходимо увеличить количество и объем выборок в анализе.
Рис. 21. Ш-дендрограмма, иллюстрирующая генетические различия между локальными популяциями нерки Камчатки (генетические расстояния по N01, 1978)
АВАМАААААА ВА
В В А А А В
й
А А А А А
А А В А
Ш? I
АА А А А В М:ААА А АА
Тад\
ВВВВВ ВМВАВАВВ — —~ — ~ — ~
I BsíN\
Рис. 22. Примеры электрофоретического разделения в агарозном геле рестриктных фрагментов мтДНК чавычи. Анализируемые участки — А8/А6/С0ШЖ03 (эндонуклеазы рестрикции: БяґМ,МЬої, Ладі), К03М04Ь/К04 (Dde\, ТадІ), СОІ/СОІІ/А8 (БаиЯбІ); А, В — варианты расщепления, М — маркер молекулярного веса (+100 п. н.)
Для выявления уровня изменчивости минтая по другому классу генетических маркеров — микро-сателлитной ядерной ДНК — были апробированы локусы Ошо34, Ото35, РОто32, Омов, Ото-012, Ото19, Ото3. Первые четыре из указанного списка отобраны для дальнейших исследований. Два из четырёх локусов (Омов и 0то34) характеризуются тетра-нуклеотидными повторами, локу-сы РОто32, Ото35 имеют три-нуклеотидные повторы. На рис. 28 представлены примеры электрофоретического разделения аллельных вариантов.
Число обнаруженных аллелей оказалось равно шести для локусов Р0то32 и 0то35, четырнадцати — для 0то34 (табл. 4). Наибольшее число аллелей — 34 — выявлено по локусу Отов. Число аллельных вариантов отдельных локусов в исследуемых выборках варьировало от 3 до 26. Всего обнаружено 60 аллелей по четырем микросател-литным локусам минтая. Распределения частот аллелей в исследованных выборках представлены на рис. 29.
Оценки межпопуляционной дифференциации по каждому из исследованных локусов заметно различались. Максимальный вклад в дифференциацию минтая всей совокупности выборок внес локус Р0то32. При шести выявленных аллелях значение дм оказалось равным 1,08%. Отрицательный вклад в оценку внес локус 0то35 (-0,63%). Вероятным объяснением полученного отрицатель-
ного значения 6яГ по данному локусу может являться то, что его аллели у особей из разных выборок более сходны между собой, чем аллели у особей из каждой отдельно взятой выборки (Вейр, 1995). В среднем, величина межпопуляционной дифференциации по всем локусам составила 0,47% и оказалась статистически недостоверной, но при исключении из анализа локуса 0то35 данный показатель становится статистически значимым — 0,63% (95%-й бутстреп-интервал положительный, нижняя граница 0,180).
Из трех исследованных выборок минтая достоверные различия при попарном сравнении обнаружены только для выборок № 1 и № 3, что не противоречит приведенным выше результатам, полученным при анализе гаплотипической изменчивости.
Таким образом, можно отметить, что достаточно перспективными для дальнейших популяционных исследований минтая представляются три микросателлитных локуса — Р0то32, Отов и Ото34, использование которых, при условии увеличения материала в анализе, может наиболее объективно отразить особенности внутривидовой подразделенности данного вида.
Тихоокеанская треска. Для выявления популяционно-генетической изменчивости были апробированы 12 микросателлитных локусов, 9 из них отобраны для дальнейших исследований (Отов, Ото19, РОто32, Ото34, Ото35, Ота101, Ота102, Ота107, ОтаЮв); 3 локуса мсДНК — Ото3, Ото-О12, ОтаЮв — оказались непригодными для анализа трески вследствие следующих причин: не происходил отжиг праймеров (в нуклеотидной последовательности отсутствовали специфичные участки), размер ПТ ^Р-продукта, не позволял интерпретировать полученные результаты или локусы оказывались низкополиморфными. В основном, изученные локусы характеризуются тетра-
Рис. 23. Распределение частот комбинированных гапло-типов 01-011 в популяциях чавыгаи Камчатки (по: Шпи-гальская, 2010)
Рис. 24. иРОМЛ-дендрограмма, иллюстрирующая генетические различия между локальными популяциями чавычи Камчатки (по: Шпигальская и др., 2008)
нуклеотидными повторами, исключением являются Gmo35 и PGmo32, которые имеют три-нуклео-тидные повторы.
На рис. 30 представлены примеры электрофоретического разделения аллельных вариантов. Число обнаруженных аллелей в исследованных ло-кусах колебалось от 5 до 45, причем наибольшее
число аллелей обнаружено по локусу Gmo8, а наименьшее — по Gmo35 (табл. 4). Всего в пяти выборках выявлено 180 аллельных вариантов. Среднее число аллелей на локус составило 21,8. Наиболее полиморфными являются локусы Gmo34, Gmo8, Gmo19, Gma102, имеющие 26, 45, 29 и 16 аллельных вариантов, соответственно.
А А А А В А А А М А А А А А А А
м И И( М м
0
и в
м
м
м
м
м
Яэа! (СуЛ/О-Ьор) НтбЛ (НВЗЛМВ41УЫВ4)
А А А А Л В М В Л А А А Л А
^-4 *■ 4 к 4 к-4 1—4
В В В А |с А М. А в А В А АА
Н* 1П И 11 1-4 1-4 1—<
! и м ы Ц и ав1 »и: Н«ВЙ
ш ¡3 Ш ш
НаеIII (СуЛ/В-1оор) У.ьр! (Н1)5/Ы1)6)
ВАА АААААМАСА АА АА А В С А В 'В'А М К' В В |Й А
С ** _ *-
ы
*- и Ц Ц и4 и . ы ■ —
_ — м м М ******
м И Н 5 *— —
_ ССИИНИП^ИОИНИИИ
^ У Г< » « ■ - • | < н( ■ — ШШ
м
Hin.fi. (ШЗ/Ш4Ш1>4) А4яр\ (Ж)5/Ш6)
аЦЦЦ^Зааам^сЦЦЦ^а ВАААААААМАААС А
см 3.1 (ЫВЗ/Ш41УМВ4)
А А В 1 и ы и « А т А ■ М В
I I I ш I I 1 1 I Ш *т
Ата871 (Т^В5/МВб)
Я.ш1 (Ш5/ЫБ6)
Рис. 25. Примеры электрофоретического разделения в агарозном геле рестриктных фрагментов мтДНК минтая. Анализируемые участки — СуЛ/Б-1оор: эндонуклеазы рестрикции Rsal,ИаеШ; КВ3/МБ4Ь/МБ4: И/иД, С/Т13.1, Итб.\; N05^06: Лта871, Кур1,Mspl,RsaI. А, В, С, Б, Е— варианты расщепления, М — маркер молекулярного веса (+100 п. н.)
Рис. 26. Распределения частот (ось ординат) комбинированных гаплотипов G1-G49 (ось абсцисс) в исследованных выборках минтая (1-5 — № выборки)
Распределения аллельных частот девяти микросателлитов в исследованных выборках представлены на рис. 31-33. Можно отметить, что в пяти исследованных выборках частоты аллелей заметно различаются. Так, в отличие от других, в выборке № 2 по локусу Gmo34 преобладающим является аллель с длиной 176 п. н. (частота встречаемости 0,32), в выборке № 1 по локусу Gmo19 преобладает аллель 136 п. н. (0,29), по локусу Gma101 — аллель 177 п. н. (0,28).
Во всех выборках наблюдается наличие доминирующего аллеля по локусу Gmo35 — 122 п. н.
ьыоорка I Выборка 3 Выборка 5
Выборка 4 Выборка2
0^66 oTiT 0^7 ojl 0Г00
Coefficient
Рис. 27. UPGMA-дендрограмма генетических расстояний (Nei, 1972), вычисленных по частотам комбинированных гаплотипов в исследованных выборках минтая
. т
ни
>. 1«
Gmo8 Gmo34
«» — ** ~
пУТ?"" "ОТО1?!? 11U 107 107 107 ПО 110
PGmo32 Gmo35
Рис. 28. Примеры электрофоретического разделения в акриламидном геле аллельных вариантов микросателлит-ных локусов Gmo8, PGmo32, Gmo34, Gmo35 минтая. М — маркер молекулярного веса (pBR322/HpaII)
(0,69-1,00) и по РОшо32 — 116 п. н. (0,74-0,80). Для локусов Ошов, 0шо102 и 0шо108 четко выраженный основной аллель не выявлен ни в одной из выборок.
Оценки дифференциации (в.М) выборок по мик-росателлитным локусам представлены в табл. 6. Максимальный вклад в дифференциацию трески внес Ошо35, при пяти выявленных аллелях значение оказалось равным 15,39%. Отрицательный вклад в оценку внесли локусы 0ша107, Ошо34 и РОшо32, по которым изменчивость внутри выборок, вероятно, выше, чем между всеми исследованными выборками. В среднем, величина дифференциации ($5/) по всем локусам является статистически значимой — 0,78% (95%-й бутстреп-интер-
вал положительный, нижняя граница 0,03). При исключении из анализа локусов 0ша107, Ошо34 и РОшо32 данный показатель оказался равным
1,21% (95%-й бутстреп-интервал положительный, нижняя граница 0,18), т. е. статистически достоверным на более высоком уровне значимости. Из дальнейшего анализа локусы, по которым значения $5/ имели отрицательную величину, были исключены.
Сравнение выборок по аллельным частотам шести микросателлитных локусов выявило наличие достоверных различий во всех случаях попарных сравнений, за исключение пары выборок № 2 и № 3, величина оценки различий между которыми не достигла уровня статистической значимости.
Таблица 6. Дифференциация популяций тихоокеанской трески (в %) по микросателлитным локусам
Ошо35 Ошо34 Ошо8 РОшо32 Ошо19 0ша101 0ша102 0ша107 0ша108 Среднее 95%-й бутстреп-интервал
нижний верхний
15,39 -0,07 0,43 -0,25 0,45 0,03 0,04 -0,09 2,86 0,78
0,03
2,13
Ото8
1Й й
. • .
•А. О«
122 122 1: 119122 "Г1 „9 122 “ гат^тячяш
т да
¿63
т 192
172 172
■ ^
136 136 136 136 1з6
Сто35
Сто19
л.
! :
пб 116 не не пб
110 110 по--
РСто32
г < н
I 1 '
4;? 1з2 ^~ •— рц* _:
220 ~“4 220 216 220
7 ,240
240
— 220
Ста 102
А
.148^^ « 152^ «ш,щ — *Ш.Щ ^
Г1|_, 140*-- <1й
ШТ?Г И ^ П2 и2и2 13?_.^.
^20&в№яК*”*|йЙ6»4»Й6^3?' Ь_6Й.-06 206
5" 206 ^ 206 ТЗГ 206 206 206 206 -10 206 20б‘ V 206
Сто34
I Щ
(Н
¿у*
ан,
^1&. • ^14. к- . .йий» — йй^Г*! яр
г4„ 266 веЯ
М. ^ *я*'2г4 Г -
218 --------------’ *20? ^ "
Ста 108 - А
е I I- 'в:
|И И«
Цм - ■
&
^ ш.жт ::: шь-и»
й^*®а"йв 5*4“’ -В±и*
169 ' 169 _ 169 169 169 169
И -
174 ПГ
Сто8
Ста! 01
Ста 107
Кластеризация выборок, в соответствии с вычисленными генетическими дистанциями, отражает степень их сходства (рис. 34). Выборки № 2 и 3, в соответствии с результатами попарных сравнений, образуют единый кластер. Наиболее отличной от других является выборка № 4.
Рис. 30. Примеры электрофоретического разделения в ак-риламидном геле аллельных вариантов микросателлитных локусов Ошо35, РОшо32, Ошо34, Ошо8, Ошо19, 0ша102, 0ша108, 0ша101, 0ша107 трески. М — маркер молекулярного веса (рБЯ322/Ира11 или рБЯ322/ НаеШ)
Таким образом, представленные данные по изменчивости генетических маркеров трески позволили проанализировать пригодность апробированных микросателлитных локусов для дальнейших популяционных исследований. Шесть локусов, вероятно, могут быть использованы для популяци-
Рис. 31. Распределения частот аллелей микросателлитных локусов РОмо32 и Ошо35 (указаны размеры аллелей в парах нуклеотидов) в исследованных выборках тихоокеанской трески (синим цветом обозначена выборка № 1, красным — № 2, зеленым — № 3, фиолетовым — № 4, голубым — № 5)
онного анализа, но вследствие их высокого полиморфизма получение достаточно объективных оценок возможно только при условии значительного увеличения объемов выборок. Предварительные результаты свидетельствуют о генетической
неоднородности трески. Выявление каких-либо закономерностей внутривидовой подразделенности требует продолжения исследований в этом направлении с подключением в анализ большего объема материала и новых генетических маркеров.
Рис. 34. иРОМЛ-дендрограмма генетических расстояний (№1, 1972), вычисленных по частотам аллелей микроса-теллитных локусов в исследованных выборках тихоокеанской трески
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В условиях решения задач, поставленных перед рыбопромысловой наукой, представленные в настоящей работе генетические характеристики тихоокеанских лососей востребованы, в первую очередь, при идентификации смешанных уловов. Информацию о региональном составе морских нагульных скоплений необходимо учитывать при прогнозировании численности промысловых подходов. Данные по самому массовому виду лососей — горбуше — уже используются в вышеуказанных целях. Кроме того, генетические характеристики, полученные на основе нескольких классов популяционных маркеров, необходимы при оценке взаимовлияния диких и заводских стад, при решении спорных вопросов о происхождении уловов, а также при сертификации морского и речного промыслов.
В результате генетических исследований морских промысловых рыб — минтая и тихоокеанской трески, начальный этап которых представлен в настоящей работе, будут получены данные о степени однородности их нерестовых скоплений, необходимые для оценки уровня репродуктивной изоляции и популяционной подразделенности единиц прогнозирования данных видов.
Подводя итог вышеизложенному, следует подчеркнуть, что анализ изменчивости нуклеотидной последовательности ДНК может дать дополнительное количество высокоинформативных маркеров, что особенно актуально при исследовании видов со сложной генетической структурой и высокой миграционной активностью. Внедрение современных молекулярных методов в популяционные исследования позволит дополнить и расширить уже сформированную картину генетической подразделенности и процессов эволюции видов.
БЛАЕОДАРНОСТИ
Авторы выражают глубокую признательность всем сотрудникам КамчатНИРО, а также рыбохозяйственных научных организаций Ассоциации НТО «ТИНРО», принимавшим участие в сборе генетических материалов в сложных условиях труднодоступных районов Дальнего Востока.
Авторы искренне благодарят коллег из генетических лабораторий Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН и ФЕУП «ВНИРО» за неоценимую помощь в освоении молекулярно-генетических методов, консультации и предоставленную возможность обработки материалов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Баранова Ю.П., Бискэ С.Ф. 1964. Северо-восток СССР (История развития рельефа Сибири и Дальнего Востока). М.: Наука, 289 с.
Беспалый В.Г., Глушкова О.Ю. 1987. Северо-восток // Четвертичные оледенения на территории СССР. М.: Наука. С. 62-69.
Брыков В.А. 2001. Эволюция генома, изменчивость и дивергенция ДНК у морских животных: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. М.: Ин-т общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 48 с.
Варнавская Н.В. 2006. Еенетическая дифференциация популяций тихоокеанских лососей. Петропав-ловск-Камчатский: КамчатНИРО, 488 с.
Вейр Б.С. 1995. Анализ генетических данных: пер. с англ. М.: Мир, 400 с.
Глушкова О.Ю. 1984. Морфология и палеогеография позднеплейстоценовых оледенений северо-востока СССР / Плейстоценовые оледенения Востока Азии. Магадан: ДВНЦ АН СССР. С. 28-43.
Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. 1984. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 479 с.
Мелекесцев И.В., Брайцева О.А., Эрлих Э.Н. и др. 1974. Камчатка, Курильские и Командорские острова (История развития рельефа Сибири и Дальнего Востока). М.: Наука, 438 с.
Рубцова Г. А. 2008. Микросателлитная изменчивость кеты: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.: Ин-т общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, 24 с.
Шпигальская Н.Ю. 2010. Еенетическая дифференциация азиатских популяций тихоокеанского лосося — чавычи, Oncorhynchus tschawytscha (Wal-
baum): Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Владивосток: Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, 24 с.
Шпигальская Н.Ю., Брыков Вл.А., Гарретт А.Дж., Кухлевский А.Д., Шапорев Р.А., Варнавская Н.В. 2008. Межпопуляционная изменчивость митохондриальной ДНК чавычи, Oncorhynchus tschawytscha (Walbaum), Камчатки // Еенетика. Т. 44. № 7. С. 972-982.
Шпигальская Н.Ю., Брыков Вл.А., Кухлевский А.Д., Сараванский О.Н., Климов А.В., Четвертак А.А., Шевляков Е.А. 2011. Региональная идентификация смешанных морских скоплений молоди горбуши (Oncorhynchus gorbuscha Walbaum) на основе изменчивости фрагмента Cytb/D-loop митохондриальной ДНК // Известия ТИНРО. Владивосток. Т. 165. С. 89-103.
Buchholtz W.G., Miller S.J., Spearman W.J. 2001. Isolation and characterization of chum salmon microsatellite loci and use across species // Animal Genetics. V. 32. № 3. P. 162-165.
Canino M.F., Spies I.B., Hauser L. 2005. Development and characterization of novel di- and tetranucle-otide microsatellite markers in Pacific cod (Gadus macrocephalus) // Mol. Ecol. Notes. V. 5. P. 908-910.
Cavalli-Sforsa L.L., Edwards A.W.E. 1967. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures // Am. J. Hum. Genet. V. 19. P. 233-257.
Gharrett A.J., Gray A.K., Brykov V.A. 2001. Phylogeographical analysis of mitochondrial DNA variation in Alaskan coho salmon, Oncorhynchus kisutch // Fish. Bull. V. 99. P. 528-544.
Kruskal J.B. 1964. Nonmetric multidimensional scaling: a numerical method // Psychometrika. V. 29. P. 28-42.
Lewis P.O., Zaykin D. 2001. Genetic data analysis: computer program for the analysis of allelic data. Http:/ lewis.eeb.uconn.lewishome/software.html.
Miller K.M., Le K.D., Beacham T.D. 2000. Development of tri- and tetranucleotide repeat microsatellite loci in Atlantic cod (Gadus morhua) // Mol. Ecol. Notes. V. 9. № 2. P. 238-239.
Mulligan T.J., Chapman R.W., Brown B.L. 1992. Mitichondrial DNA analysis of walleye pollock Theragra chalcogramma from the eastern Bering Sea and Shelikov Strait, Gulf of Alaska // Can. J. Fish Aquat. Sci. V. 49. P. 319-326.
Nei M. 1972. Genetic distance between populations // American Naturalist. V. 106 (949). P. 283-292.
Nelson R.J., Beacham T.D. 1999. Isolation cross species amplification of microsatellite loci useful for study of Pacific salmon // Animal Genetics. V. 30. P. 228-229.
Olsen J.B., Seeb L.W. 1998. Genetic interpretation of broad-scale microsatellite polymorphysm in odd-year pink salmon / Trans. Amer. Fish. Soc. V. 127. P. 535-550.
Olsen J.B., Wilson S.L., Kretschmer E.J. et al. 2000. Characterization of 14 tetranucleotide microsatellite loci derived from sockeye salmon / Mol. Ecol. V. 9. P. 2185-2187.
PCR Technology. 1989. Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H.A. Erlich). Stockton Press, 246 p.
Rolf F.J. 1990. NTSYS-ps: Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version. 1.60. N.Y.: Exter publishing, Ltd.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1626 p.
Schneider S., Roessli D., Excoffier L. 2000. Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, Univ. Geneva, Switzerland.
Smith C.T., Koop B.F, Nelson R.J. 1998. Isolation and characterization of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) microsatellites and their use in other salmonids // Mol. Ecol. V. 7. P. 1613-1621.
Wilhelm V., Villegas J., Miquel A., Engel E., Bernales S., ValenzuelaP.D.T., Burzio L.O. 2003. The complete sequence of the mitochondrial genome of the chinook salmon, Oncorhynchus tschawytscha // Biological Research. V. 36. P. 223-231.
Williamson K.S., Cordes J.F., May B. 2002. Characterization of microsatellite loci in chinook salmon (Oncorhyncus tshawytscha) and crossspecies amplification in other salmonids // Mol. Ecol. Notes. V. 2. P. 17-19.
Zardoya R., Garrido-Pertierra A., Bautista J.M. 1995. The complete nucleotide sequence of the mitochondrial DNA genome of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // J. Mol. Evol. V. 41. P. 942-951.
