CC BY
74
УДК 575: 597.553.2
ПОЛИМОРФИЗМ мтДНК ГОРБУШИ КАМЧАТКИ И ОСТРОВА САХАЛИН
Н. Ю. Шпигальская, Вл. А. Брыков*, А. Д. Кухлевский*
Н. с., Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии
683038 Петропавловск-Камчатский, Набережная, 18
Тел., факс: (415-2) 41-27-01; (415-22) 5-25-92
E-mail: shpigalskaya. n. u@kamniro. ru
*3ав. лаб.; н. с., Институт биологии моря, РАН
690041 Владивосток, Пальчевского, 17
Тел., факс: (423-2) 31-04-19
E-mail: vladbrykov@hotmail. com
ГОРБУША, МИТОХОНДРИАЛЬНАЯ ДНК, МЕЖПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ
Проанализирована изменчивость нуклеотидной последовательности фрагмента Cytb/D-loop мтДНК в выборках горбуши Камчатки и о. Сахалин. Анализ изменчивости длины рестриктных фрагментов мтДНК позволил выявить 23 комбинированных гаплотипа. На основании полученных оценок гаплотипического и нуклеотидного разнообразия, было отмечено, что для горбуши о. Сахалин эти показатели, в целом, выше, чем для большей части камчатских популяций. В результате применения методов F-статистики для оценки уровня генетической подразделённости исследуемых популяций, были показаны статистически значимые различия между большинством сравниваемых пар выборок. В структуре UPGMA- и NJ-дендрограмм, построенных на основе генетических расстояний по Нею, не обнаружено четкой дифференциации между популяциями Западной и Восточной Камчатки, в то же время популяции о. Сахалин занимают относительно обособленное положение. При анализе групп выборок, объединенных в соответствии с географическим положением, величина внутрипопуляционной изменчивости составила 93,15%, доля, приходящаяся на меж-групповую компоненту, составила 3,81 % и заметно превысила долю межпопуляционной дисперсии внутри групп — 3,04%. Полученные результаты свидетельствуют о генетической гетерогенности горбуши на изучаемой части ареала, а уровень межрегиональной изменчивости более значителен, чем межпопуляционной.
PINK SALMON mtDNA POLYMORPHYSM IN KAMCHATKA AND SAKHALIN
N. Yu. Shpigalskaya, Vl. A. Brykov*, A. D. Kukhlevsky*
Scientist, Kamchatka Research Institute of Fisheries and Oceanography 683000 Petropavlovsk-Kamchatsky, Naberejnaya, 18 Tel., fax: (415-2) 41-27-01; (415-22) 5-25-92 E-mail: shpigalskaya@kamniro. ru
*Head of the laboratory; scientist, Institute of Marine Biology, Russian Academy of Sciences Palchevsky St., 17, Vladivostok, 690041 Russia,
Тел., факс: (423-2) 31-04-19 E-mail: vladbrykov@hotmail. com
PINK SALMON, MITOCHONDRIAL DNA, INTERPOPULATION VARIATION
Nucleotide sequence variation in the part of Cytb/D-loop mtDNA have been analyzed in pink salmon samples from Kamchatka and Sakhalin. Analysis of the variation of mtDN restrict fragments length revealed 23 compocite haplotypes. It was noted, basing on the haplotype and nucleotide diversity data, that Sakhalin pink salmon had generally higher indexes, than majority ofKamchatkan populations had. Significant statistical differences were demonstrated in majority of pairs (pairs of samples) compared, when using the F-statistics method for estimation of the structural genetic level in studied populations. There were no clear differences revealed between populations of West and East Kamchatka in the structure of UPGMA- and NJ-joint-trees, built on the base of Nei’s genetic distances; the Sakhalin populations demonstrated relatively isolated position. In the analysis of groups of samples, united according to the geographical position, the intrapopulation variation were 93,15%, the intergroup component nd it was visibly higher, than the interpopulation dispersion in the groups (3,04%). The results we
was 3,81%, anc ....... ^ r r __ _. ^ x v
have obtained can indicate of pink salmon genetic heterogeneity in the tudied part of the areal, and of the higher level of inter-regional variation, comparing it to the interpopulation level.
ДНК митохондрий животных — замкнутая коль- и некодирующая контролирующая область, уча-
цевая молекула, содержащая обычно не более ствующая в репликации и называемая D-петлей
20 000 пар нуклеотидов (Алтухов и др., 2004). При (Ferris, Berg, 1987). Контролирующая область со-
определении полной нуклеотидной последователь- стоит из центральной консервативной последова-
ности мтДНК у позвоночных обнаружены 37 струк- тельности, которая фланкируется, как правило,
турных генов (два рибосомальных гена, 22 гена полиморфными доменами, содержащими тандем-
транспортных РНК, 13 генов, кодирующих белки) ные повторы от четырех до сотен пар оснований.
Тандемные повторы мтДНК часто высокополиморфны. Подобная организация генов мтДНК была выявлена и у рыб рода Oncorhynchus (Thomas, Beckenbach, 1989).
Митохондриальная ДНК является гаплоидной и наследуется только по материнской линии. Несмотря на то, что мтДНК содержит более 30 различных генов, с позиций формальной генетики она рассматривается как один локус, а гаплотипы мтДНК — как аллели этого локуса. Соответственно, эффективный размер популяции для мтДНК равен 1/4 аналогичной оценки для ядерных генов (Nei, Tajima, 1981), что в значительной степени определяет быстрые изменения частот гаплотипов мтДНК в результате случайного дрейфа генов и эффекта «горлышка бутылки» при резком сокращении численности популяции (Алтухов и др., 2004). Кроме того, следует отметить, что скорость нуклеотидных замен в митохондриальном геноме в 5-10 раз выше, чем в ядерной ДНК (Moritz et al., 1987), в связи с чем степень дивергенции мтДНК, обусловленная более интенсивными мутационным процессом и дрейфом, выше, чем у ядерных генов. Скорость нуклеотидных замен в среднем в молекуле мтДНК разных организмов составляет 1-2% нуклеотидных замен за 1 млн лет (Brown et al., 1979; Ferris et al., 1983; Avise, 1994).
Благодаря описанным выше особенностям полиморфизм мтДНК широко и успешно используется в исследованиях по эволюции и филогении (Avise,
1994, 2000; Брыков, 2001; Гречко, 2002; и т. д.), в анализе популяционной структуры и исторической филогеографии вида (Полякова и др., 1996; Seeb et al., 1998; Брыков и др., 1999а,б; Брыков, 2001; Gharrett et al., 2001a,b; Churikov et al., 2001 ; Churikov, Gharrett, 2002; и т. д.).
Важная особенность анализа мтДНК состоит в том, что в отличие от аллелей белковых генов и сателлитной ДНК, гаплотипы мтДНК можно связать друг с другом сетью последовательных эволюционных превращений — минимальное число пошаговых мутационных изменений, необходимых для взаимопревращений гаплотипов через появление/утрату рестрикционных сайтов или любые другие изменения последовательности нуклеотидов (Алтухов и др., 2004). С учетом данных по всем использованным рестриктазам или по нуклеотидной последовательности, можно таким образом выстроить филогению (генеалогию) комплексных (или комбинированных) гаплотипов (Брыков, 2001; Чуриков, 2001). Молекулярные расстояния между гаплотипами мтДНК можно включать в оценки генетической дифференциации (Excoffier et al.,
1992). На основе филогении гаплотипов возможно получить дополнительную информацию и в отношении генетического родства и исторических связей между популяциями и видами.
Успехи анализа популяционной структуры с использованием молекулярно-генетических методов обусловлены, прежде всего, тем, что известны механизмы и закономерности наследуемости большинства молекулярных маркеров. Кроме того, эти признаки практически не подвержены влиянию факторов внешней среды. Использование данных методов основано на концепции, согласно которой, если внутривидовые группировки оказываются частично или полностью изолированными, то в них накапливаются генетические различия как следствие стохастических процессов (дрейфа) и/или отбора при наличии разнонаправленных факторов (Алтухов и др., 1997; Алтухов, 2003). Эмпирическое подтверждение существования в пределах видов генетически отличающихся, репродуктивно изолированных единиц, дает основание для утверждения, что успех краткосрочной стратегии управления ресурсами и долговременных целей сохранения видов зависит от наличия, наряду с демографическими и экологическими данными, информации о генетической структуре вида (Алтухов и др., 1997; Алтухов и др., 2004).
Исследования популяционной структуры животных и, в частности, рыб имеют важное теоретическое и практическое значение, что связано, в первую очередь, с тем, что популяции являются, как правило, единицей хозяйственной деятельности. Поэтому комплекс мероприятий и технологических подходов, направленных на рациональное использование природных ресурсов, включает необходимость знания популяционной структуры видов. Если промысловая нагрузка на единицы, входящие в состав стад, неравномерна, то возможны ситуации, когда отдельные самовоспроизводящи-еся элементы не смогут поддерживать свою численность на необходимом для выживания уровне.
Известно, что как численность, так и динамика демографических показателей в разных участках ареала видов рыб могут значительно различаться. Ярким примером может служить горбуша Oncorhynchus gorbuscha ^а1Ьаит), неперекры-вающиеся поколения которой (линии), возвращающиеся на нерест в четные и нечетные годы, могут в одной и той же реке различаться по численности на порядки величин. Такого рода закономерности, очевидно, определяются существованием в пределах вида в разной степени экологически и генетически отличающихся самостоятельных единиц — популяций и субпопуляций.
В результате анализа изменчивости аллельных частот аллозимных локусов было установлено, что в целом для горбуши характерна слабая пространственная дифференциация: региональные количественные оценки степени генетической дивергенции у горбуши в два-пять раз ниже, чем у других видов рода Oncorhynchus (Животовский и др., 1989; Алтухов и др., 1997; Алтухов и др., 2004). Оценки генетической дифференциации горбуши в азиатской части ареала на основе полиморфизма микросателлитных локусов ядерной ДНК показали, что представление о невысокой степени генетической дифференциации азиатской горбуши, сформировавшееся на основе изучения аллозимов, подтверждается и на уровне микросателлитной ДНК (Салменкова и др., 2006).
Безусловно, высокая промышленная значимость данного вида определяет необходимость не только стабильного мониторинга популяционных процессов, но и достаточно точного прогнозирования численности нерестовых популяций, что, в свою очередь, ставит задачи идентификации региональных комплексов и наиболее крупных популяционных систем в смешанных морских скоплениях в период нагула и преднерестовых миграций.
Вышеизложенное позволило определить цель исследования — выявление и оценка уровня полиморфизма мтДНК горбуши как маркера для идентификации региональной принадлежности смешанных морских скоплений.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом для настоящей работы послужили выборки из семи камчатских популяций горбуши и трех популяций о. Сахалин, собранные сотрудниками различных лабораторий ФГУП «Камчат-НИРО» и лаборатории генетики Института Биологии моря (ИБМ, г. Владивосток) в период полевых исследований 2008 г. Локализация сбора проб представлена на рис. 1.
Образцы ткани сердечной мышцы горбуши извлекали из свежевыловленных рыб и фиксировали в этаноле. Объем каждой из исследованных выборок составлял 50 экз. Исключением является выборка из р. Водопадная, объем которой был 40 экз. Таким образом, общее количество включенных в генетический анализ на основе изменчивости мтДНК особей составило 490 экз. (7 выборок из рек Камчатки и 3 — о. Сахалин).
Тотальную ДНК выделяли из ткани сердечной мышцы стандартным способом с использованием метода протеиназного гидролиза в присутствии до-децилсульфата натрия с последующим высаливани-
ем белков, удалением их вместе с клеточными обломками центрифугированием и осаждением ДНК из супернатанта изопропанолом (Sambrook et al., 1989).
Изменчивость структуры мтДНК исследовали, используя рестрикционный анализ фрагмента Cytb/D-loop (рис. 2). Фрагмент мтДНК горбуши амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (PCR Technology, 1989) с использованием праймерных последовательностей, разработанных на других видах лососей — микиже, Oncorhynchus mykiss, и кижуче, Oncorhynchus kisutch (Zardoya et al., 1995; Gharrett et al., 2001а), и позволяющих амплифицировать фрагменты мтДНК, почти идентичные по длине у всех тихоокеанских лососей.
Обозначения праймерных последовательностей, использованных нами при амплификации, приведены ниже:
Cytb/D-loop
5’ TGAA(G/A)ACCACCGTTGTTATTCAA 3’
5’ TAGGGCCTCTCGTATAACCG 3’
Длина амплифицированного фрагмента составляет около 2700 пар нуклеотидов (пн) (Gharrett et al., 2001а).
Изменчивость нуклеотидной последовательности анализировали, используя набор рестриктных ферментов: Dde I, Hin6 I, Hinf I, Msp I, Rsa I, Sfr13 I.
После реакции эндонуклеазного гидролиза пробы подвергали электрофорезу в 1,8-2,0% агарозном геле (или 1,5% SynerGel) в трис-боратном буфере. Для определения молекулярной массы образующихся фрагментов использовали маркерный набор фрагментов ДНК, кратных 100 парам оснований. Фрагменты ДНК в геле окрашивали эти-
Рис. 1. Локализация сбора проб горбуши в 2008 г.
Cytb/D-loop
V L ЮМ WANCY SD К G ñ HSL Е TP F V
OL ND3
12S 16S N01 N02 С0( COIIAÖA6 СОНІ ND4L ND4 N05 N06 Cytb D-loop12S
i----1---1----1 i-------1---1----1---1----1---1-----1--1-----1----1----1---1
О 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
Количество пао оснований Рис. 2. Расположение амплифицированного участка мтДНК горбуши относительно линейной генной карты митохондриального генома (по Zardoya et al., 1995)
диумбромидом и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете.
Результаты анализа изменчивости длины рес-триктных фрагментов мтДНК каждой особи по всем рестрикционным сайтам объединяли, получая, таким образом, комбинированные гаплотипы (в дальнейшем — гаплотипы G1-G23).
Оценку количества замен оснований на нуклеотидный сайт и их стандартные отклонения между гаплотипами рассчитывали, используя пакет программ REAP (McElroy et al., 1992). Нуклеотидную дивергенцию между всеми парами гаплотипов определяли с помощью программы D, а дивергенцию между всеми парами популяций — с помощью программы DA (McElroy et al., 1992). Нуклеотидную (h) и гап-лотипическую (р) величины разнообразия рассчитывали по Нею (Nei, Tajima, 1983; Nei, 1987) в пакетах программ REAP. Оценку величины дивергенции между выборками и их стандартные ошибки оценивали по Нею и Ли (Nei, Li, 1979). Полученная в REAP матрица количественных значений дивергенции между популяциями использовалась для кластерного анализа (программа NTSYS) и построения дендрограмм (UPGMA—“Unweighted Pair Group Method, Ariphmetic Average” и NJ — “Neighbor Joining”) (Rolf, 1990).
Для оценки значимости межпопуляционных различий частот гаплотипов использовали методы ^-статистики в пакете программ Arlequin2000 (Schneider et al., 2000).
Для определения возможности использования полученных результатов в целях идентификации региональной принадлежности смешанных морских уловов проводили анализ искусственно заданных смешанных выборок по «нулевому» сценарию в программе SPAM (Masuda et al., 1991; Pella et al., 1996).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Полиморфизм фрагмента мтДНК Cytb/D-loop в популяциях горбуши
Длина амплифицированного фрагмента Cytb/Dloop составляет 2720 пар нуклеотидов (пн), или
около 15% всего митохондриального генома горбуши (Gharrett et а1., 2001а). В результате ПДРФ-ана-лиза было выявлено 65 рестриктных сайтов, что соответствует примерно 1,5% митохондриального генома. Большая часть рестриктных сайтов оказались полиморфными — 36 (55,4% от общего количества исследованных сайтов).
Варианты расщепления фрагмента СуЛ/0-1оор мтДНК горбуши 6-ю рестриктазами приведены в табл. 1. Примеры электрофоретического разделения продуктов ПДРФ-анализа в 8упеЮе1 или в агарозном геле представлены на рис. 3-8.
Различия между выявленными вариантами гаплотипов по количеству, размеру и положению рестрикционных фрагментов мтДНК, вероятно, обусловлены мутационным замещением нуклеотидов (инсерции, делеции или инверсии) и образованием или исчезновением в указанных участках рестриктного сайта, опознаваемого соответствующей эндонуклеазой (Алтухов и др., 1997; Чуриков, 2001; Алтухов, Салменкова, 2002). Кроме того, следует отметить, что в ряде случаев нами было выявлено наличие вставки, локализованной в Б-петле, размером ^ 200 пн.
Данные по изменчивости частот выявленных вариантов гаплотипов являются основой для анализа популяционных различий и, при условии одинаковой скорости накопления мутаций в рассматриваемых локальностях, могут свидетельствовать о различном возрасте популяций, а при подтверждении достаточно значимой глубины меж-популяционной дивергенции — указывать на принадлежность к различным потокам видового расселения.
Гаплотипическая изменчивость горбуши Камчатки и о. Сахалин
Объединенные данные по всем сайтам рестрикции, полученные в результате анализа фрагмента СуЛ/0-1оор мтДНК с использованием шести эндонуклеаз, позволили выявить 23 комбинирован-
ных гаплотипа (composite haplotypes) у горбуши Камчатки и о. Сахалин (табл. 2).
Сеть гаплотипов, построенная по принципу минимального числа нуклеотидных различий между ними, приведена на рис. 9. Из рисунка видно, что гаплотипы мтДНК горбуши не формируют четко выраженных филогенетических групп. Наличие возможных альтернативных связей между гапло-типами (петлевые структуры в сети) может быть результатом гомоплазии, т. е. повторных и обратных мутаций в мтДНК (Churikov et al., 2001). Отсутствие явно выраженной картины «звездчатой» радиации, вероятно, может свидетельствовать о различном происхождении исследованных популя-
Рис. 3. Примеры электрофоретического разделения в азарозном геле рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Фрагмент ДНК — Cytb/D-loop, эндонуклеаза рестрикции Hin 6 I. А, D, V — варианты гаплотипов, М — маркер молекулярного веса, 1-32 — номера исследованных особей
ций и соответственно об отсутствии единого предкового генофонда камчатских и сахалинских популяций горбуши.
Данные по встречаемости комбинированных гаплотипов мтДНК — абсолютные частоты, приведены в табл. 3. Меньшее, чем было указано выше? суммарное число исследованных особей для каждой локальности обусловлено тем, что в некоторых случаях амплификация исследуемого фрагмента оказалась затруднена, вероятно, в связи с низким качеством выделенной тотальной ДНК. Распределения относительных частот гаплотипов в исследованных популяциях горбуши отражены на рис. 10.
М1 23456789 10
ААААСАСВАА
11 12 13 14 15 16 17 18 М 19 20 21 22 23 24 25 26
ААЕАСА АС АААВАААВ
Рис. 5. Примеры электрофоретического разделения в SynerGel (А) и азарозном геле (Б) рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Фрагмент ДНК — Cytb/D-loop, эндонуклеаза рестрикции Rsa I. А, B, С, D, E — варианты гаплотипов, М — маркер молекулярного веса, 1-26 — номера исследованных особей
29 30 31 32 33 34 35 36 М 37 38 39 40 41 42 43
АААААААА АС А А А А А
Рис. 4. Примеры электрофоретического разделения в азарозном геле рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Фрагмент ДНК — СуЛ/Б-Іоор, эндонуклеаза рестрикции Иіп/І. А, С — варианты гаплотипов, М — маркер молекулярного веса, 29-43 — номера исследованных особей
25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
В В В ВВ С ВВМ АА ВА В FBB
Рис. 6. Примеры электрофоретического разделения в азарозном геле рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Фрагмент ДНК — Су&Ю-1оор, эндонуклеаза рестрикции С/г 13 I. А, В, С, Б — варианты гаплотипов, М—маркер молекулярного веса, 25-40 — номера исследованных особей
Таблица 1. Варианты расщепления фрагмента СуЛ/О-кюр мтДНК горбуши 6-ю рестриктазами. Длины рестриктных фрагментов даны в парах нуклеотидов (пн). Жирным шрифтом выделены варианты, выявленные при наличии вставки ~ 200 пн
Я//7 6 I Ніф Леа I С/131 Мер I Осіє I
А В V А С А В С В Е А В С Р А В Б в I I V А С В V
- - ИЗО 690 690 - - 780 - - - - 1920 - - - 1308 - - - - - 630 - -
930 - - - 580 600 - 600 600 600 - - - 1850 - - - - - - 890 540 540 540 540
- 720 - 540 540 580 580 - 580 580 1650 1650 - - - - - - - 820 - - - - 475
690 690 690 520 520 - 575 - - - 480 480 480 480 690 690 690 690 690 690 - 325 - 325 325
505 505 505 380 - - - - - 510 - 380 - 380 495 495 - - 495 - 495 310 310 310 310
- 210 - 340 340 445 445 445 - 445 270 - - - - 480 - - - - - 305 305 305
205 205 205 250 250 395 395 395 395 - 210 210 210 210 - - - - 360 360 - 275 275 275 -
145 145 145 - - - - - 300 - 110 - 110 - - - - 350 - - - 205 205 205 205
140 140 140 - - 200 200 200 200 200 325 - - 325 325 - 325 170 170 170 170
105 105 105 - - 195 195 195 195 195 226 226 226 226 226 226 226 - - 130 -
190 190 190 190 190 212 212 - 212 212 212 212 125 125 125 125
- - - 145 - 205 205 205 205 - - 205 115 115 115 115
115 115 115 115 - 176 176 176 176 176 176 176 80 80 80 80
- 25 - - - 155 - - 155 - - 155 80 80 80 80
- - - 145 - - - 70 70 - 70
121 121 - 121 121 121 121 60 60 - 60
65 65 65 65 65 65 65 60 60 60 60
50 50 50 50 50 50 50
Полиморфизм мтДНК горбуши Камчатки и о. Сахалин
Наибольшее число вариантов комбинированных гаплотипов вымвлено в выборках сахалинской горбуши — р. Бахура (12 гаплотипов), р. Водопадная (10 гаплотипов), р. Фирсовка (10 гаплотипов).
Рис. 7. Примеры электрофоретического разделения в 8упегОе1 (А) и азарозном геле (Б) рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Фрагмент ДНК — Су1;Ъ/Б-1оор, эндонуклеаза рестрикции Ы$р I. А, В, Б, О, I, І, V—варианты гаплотипов, М — маркер молекулярного веса, 9-24 — номера исследованных особей
Рис. 8. Примеры электрофоретического разделения в 8упегОе1 (А) и азарозном геле (Б) рестриктных фрагментов мтДНК горбуши. Фрагмент ДНК — Су1;Ъ/Б-1оор, эндонуклеаза рестрикции Dde I. А, С, О, V — варианты гаплотипов, М — маркер молекулярного веса, 33-48 — номера исследованных особей
В выборках из рек Камчатки количество гаплотипов изменяется в пределах от 6 до 9.
В результате анализа распределения частот комбинированных гаплотипов удалось обнаружить, что только четыре из них являются общими для всех исследованных выборок. Гаплотип О4, который можно охарактеризовать как доминирующий, представлен во всех исследованных популяциях со средней частотой 0,46. Его частота варьировала от 0,27 (р. Большая) до 0,80 (р. Утка) (рис. 10). Вторым по встречаемости является гаплотип О1, его средняя частота — 0,21, диапазон варьирования от 0,02 (р. Утка) до 0,34 (р. Бахура), причем если в камчатских выборках его средняя частота была 0,14, то в сахалинских он выявлен с заметно более высокой частотой — 0,35. Частота третьего общего для всех локальностей гаплотипа О3 изменялась от 0,07 (р. Дранка) до 0,30 (р. Большая) и в среднем составила 0,14. Наименее представлен четвертый общий гаплотип О17, его средняя частота составила всего 0,05, диапазон варьирования — от 0,02 (р. Хайлюля) до 0,11 (р. Дранка).
Восемь гаплотипов обнаружены только лишь в какой-либо одной из 10 выборок, причем О15, О18, О19, О22 оказались свойственны выборкам о. Сахалин, а О8, О11, О12 и О13 — только камчатским популяциям горбуши. Вероятно, вышеперечислен-
Таблица 2. Выявленные комбинированные гаплотипы мтДНК горбуши Камчатки и о. Сахалин
Комбинированный гаплотип Су1;Ъ/Б-1оор
нч п ш ИтД Rsa I ОН3 I Ыър I Dde I
О1 А А А А А А
О 2 А А В А А А
О 3 А А А В А А
О 4 А А А В В А
О5 А А А А В А
О6 А А А С А А
О 7 А А А В Б А
О 8 А А В В А А
О 9 А А А А I А
010 А А А А Б А
О 11 А А А А І А
О 12 А А А В I А
О 13 А А А А А С
О 14 А А В А О А
О 15 А А Б В А А
О16 А А Е В В А
О 17 V А С Б V А
О 18 V А С Б V Б
О 19 V А С С V А
О 20 V С С Б V V
О 21 Б А С Б V А
О 22 Б А А Б V А
О 23 V С С Б V А
Рис. 9. Генеалогическая сеть гаплотипов горбуши, построенная по принципу минимального числа нуклеотидных замен и показывающая мутационные различия между гаплотипами. Размер окружности приблизительно отражает частоту встречаемости данного гаплотипа во всех исследованных популяциях. Число поперечных штрихов на ветвях обозначает число нуклеотидных замен. Пунктиром обозначены альтернативные связи между гаплотипами
ные восемь гаплотипов можно охарактеризовать как уникальные молекулярные маркеры, хотя в данном случае нельзя не учитывать относительно небольшие объёмы исследованных выборок, особенно при условии поставленных задач популяционных исследований. Однако следует принимать во внимание, что редкие гаплотипы, являясь дискриминирующими, могут служить основой для идентификации особей соответствующих локальностей, что определяет необходимость продолжения и расширения поисковыгх исследований в данной области.
Значения гаплотипической и нуклеотидной изменчивости в популяциях приведены в табл. 4. Из представленных данных видно, что, в целом, для горбуши о. Сахалин характерны более высокие показатели гаплотипического и нуклеотидного разнообразия, чем для большинства камчатских популяций. Исключением являются выборки из рек Апука, Дранка и Коль, в структуре мтДНК которых, также как и во всех сахалинских выборках, выявлены редкие гаплотипы, с невысокой частотой встречающиеся только в этих локальностях.
Внутри- и межпопуляционная изменчивость частот гаплотипов мтДНК
В табл. 5 представлены результаты применения методов ^-статистики для оценки уровня генетической подразделённости исследуемытх популяций. В
Рис. 10. Распределение частот гаплотипов О1-О23 в популяциях горбуши Камчатки и о. Сахалин (1-23 — соответствующие гаплотипы О1-О23)
я Комбинированный 3 гаплотип о э т рц л а РЧ рц « о о & © рц Р. Большая і! рц Р. Коль СЗ Ч РЦ и <с рц Р. Дранка Р. Хайлюля
в 1 14 16 17 8 1 1 10 9 9 8
в 2 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0
в 3 3 4 4 14 5 10 6 9 3 10
в 4 11 15 21 19 40 24 27 13 19 29
в 5 1 1 0 4 1 3 1 1 7 0
в 6 1 0 1 0 1 2 0 0 0 1
в 7 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
в 8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
в 9 0 0 0 0 0 4 0 8 0 0
в 10 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0
в 11 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0
в 12 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0
в 13 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
в 14 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
в 15 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0
в 16 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0
в 17 2 3 2 1 2 2 3 2 5 1
в 18 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
в 19 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
в 20 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0
в 21 0 3 1 0 0 0 0 0 0 0
в 22 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0
в 23 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1
Исследовано особей 37 49 50 47 50 48 48 48 46 50
Таблица 4. Гаплотипическое и нуклеотидное разнообразие в популяциях горбуши Камчатки и о. Сахалин
Популяция Г аплотипическое Нуклеотидное
разнообразие И разнообразие к
Р. Водопадная 0,7733 ± 0,04889 0,013589
Р. Фирсовка 0,7118 ± 0,04406 0,012784
Р. Бахура 0,7976 ± 0,03859 0,015657
Р. Коль 0,7848 ± 0,03488 0,014236
Р. Апука 0,8359 ± 0,02306 0,014866
Р. Большая 0,7262 ± 0,03725 0,008991
Р. Палана 0,6330 ± 0,06207 0,009844
Р. Хайлюля 0,6090 ± 0,06080 0,008235
Р. Дранка 0,7662 ± 0,04377 0,013428
Р. Утка 0,3543 ± 0,08366 0,004834
табл. 6 приведены значимости различий между всеми парами популяций. Оценка проводилась на основе изменчивости числа нуклеотидных замен.
Как видно из табл. 6, при попарном сравнении между большинством сравниваемых пар выборок горбуши о. Сахалин и Камчатки обнаружены значимые различия. Две сахалинские по-
пуляции (рр. Водопадная и Бахура) отличны от большей части исследованных выборок Камчатки. Показано, что основной вклад в гетерогенность исследуемой совокупности вносят выборки горбуши о. Сахалин, в несколько меньшей степени — из рек п-ова Камчатка. Исключением является горбуша р. Утка, которая при попарном сравнении достоверно отлична от всех исследованных выборок.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о значительной гетерогенности горбуши на изучаемой части ареала по структуре мтДНК, а оценка межпопуляционной дивергенции в большинстве случаев достигает статистически значимого уровня.
Матрица дивергенции по нуклеотидным последовательностям между популяциями горбуши приведена в табл. 7. Как видно, максимальное значение различий (около 0,2% нуклеотидных замен) прослеживается между выборкой из р. Утка и остальными.
Таблица 5. Значения при попарном сравнении выборок из популяций горбуши Камчатки и о. Сахалин (число
пермутаций 3024)
Популяции
к
и
а
о
ч
о
т
<С
ри
о
РЧ
рц
«
о
о
©
ри
Л
а
¡¡X
л
РЧ
РЦ
ч
Л
С
рц
X
рц
§
Р. Коль 0,08908
Р. Апука 0,02981 0,06488
Р. Большая 0,04813 0,00318 0,05451
Р. Фирсовка -0,00918 0,03580 0,02730 0,00378
Р. Бахура -0,01258 0,06678 0,03884 0,03989 -0,00690
Р. Палана 0,07136 -0,01352 0,07600 -0,00481 0,02134 0,05062
Р. Хайлюля 0,10959 -0,01090 0,10385 -0,00042 0,04456 0,07964
Р. Дранка 0,03204 0,01274 0,05986 0,01698 0,00603 0,01583
Р Утка 0,29744 0,06755 0,26710 0,15312 0,20406 0,23199
-0,01235
-0,00285
0,07872
0,02381
0,06968
0,12304
Таблица 6. Уровни значимости различий между выборками из популяций горбуши Камчатки и о. Сахалин на основе значений (по материалам таблицы 5). Жирным шрифтом обозначены статистически значимые различия между парами популяций (Р<0,05)
Популяции Р. Водопадная е 3 « § 1 .Р Р. Большая Р. Фирсовка а р ¡¡х а Б .Р а с .Р Р. Хайлюля Р. Дранка
Р. Коль 0,0007± 0,00050
Р. Апука 0,0579± 0,00390 0,0046± 0,00130
Р. Большая 0,0311± 0,00270 0,2982± 0,00750 0,0119± 0,00160
Р. Фирсовка 0,6083± 0,00960 0,0417± 0,00360 0,0549± 0,00450 0,2886± 0,00740
Р. Бахура 0,7385± 0,00900 0,0040± 0,00120 0,0251± 0,00260 0,0321± 0,00290 0,5679± 0,00980
Р. Палана 0,0116± 0,8413± 0,0020± 0,4826± 0,1084± 0,0205±
0,00200 0,00740 0,00080 0,00710 0,00580 0,00330
Р. Хайлюля 0,0010± 0,7233± 0,0003± 0,3709± 0,0367± 0,0017± 0,7233±
0,00060 0,00830 0,00030 0,00830 0,00310 0,00070 0,00710
Р. Дранка 0,0684± 0,1709± 0,0063± 0,1349± 0,2595± 0,1382± 0,4433± 0,1012±
0,00410 0,00740 0,00140 0,00680 0,00730 0,00660 0,00840 0,00630
Р. Утка 0,0000± 0,0047± 0,0000± 0,0000± 0,0000± 0,0000± 0,0053± 0,0093± 0,0000±
0,00000 0,00140 0,00000 0,00000 0,00000 0,00000 0,00150 0,00190 0,00000
Дендрограммы на основе матрицы нуклеотидной дивергенции представлены на рис. 11 и 12. При представлении полученных результатов в виде ИРОМЛ-дендрограммы популяции горбуши о. Сахалин оказались объединены в достаточно обособленный кластер. Камчатские популяции, в соответствие с уровнем нуклеотидной дивергенции, сформировали два кластера, каждый из которых включает выборки, имеющие относительно близкие значения данного показателя. Наиболее обособленное положение при кластеризации заняла выборка из р. Утка.
Сходная картина кластеризации, иллюстрирующая генетические различия между локальными популяциями горбуши Камчатки и о. Сахалин, наблюдается при использовании метода «присоединения к ближнему соседу» (N1) (рис. 12).
Можно отметить, что расположение популяций на дендрограммах не формирует четкую картину дифференциации популяций горбуши Западной и Восточной Камчатки на основе изменчивости структуры мтДНК, а популяции о. Сахалин занимают относительно обособленное положение.
Таблица 7. Матрица нуклеотидной дивергенции мтДНК между выборками горбуши
Популяции
Р. Коль Р. Апука Р. Большая Р. Фирсовка Р. Бахура Р. Палана Р. Хайлюля Р. Дранка Р Утка
а
о
э
m
0,00123264
0,00014684
0,00048502
0,00002771
0,00015419
0,00086712
0,00128649
0,00036326
0,00359473
PU
ЕП
<С
PU
о
рц
«
О
©
PU
л
а
w
рц
С
PU
X
PU
§
pu
0,00040067
0,00112361 0,00082079
0,00097501 0,00038901 0,00008280
0,00123768 0,00037342 0,00047492 0,00000650
0,00077713 0,00100232 0,00006438 0,00012198 0,00071139
0,00121213 0,00143584 0,00001633 0,00033917 0,00109232 0,00011991
0,00056573 0,00055977 0,00024073 0,00004122 0,00026670 0,00000390 0,00041238
0,00215592 0,00345335 0,00123162 0,00198963 0,00315178 0,00062203 0,00046567 0,00141440
Полученные данные были проанализированы также с использованием программы AMOVA (Analysis of Molecular Variance) в пакете программ Arlequin2000. В первом варианте анализировали всю совокупность выборок. Расчеты показали, что на долю внутрипопуляционной генетической дисперсии приходится 94,11%, на долю межпопуляци-онной — 5,89%.
В другом варианте расчета популяции объединяли в три группы в соответствии с географической принадлежностью — Западная Камчатка, Восточная Камчатка и о. Сахалин. При таком объединении было выявлено, что величина изменчивости, приходящаяся на межгрупповую компоненту, составляет 3,81%, превышая долю межпо-пуляционной дисперсии внутри групп, которая составила 3,04%. Доля внутрипопуляционной изменчивости (93,15%) незначительно уменьшается по сравнению с предыдущим вариантом анализа.
Исходя из того, что выявленная межгруппо-вая доля изменчивости превышает межпопуляци-онную оценку данного показателя внутри групп сахалинских и камчатских популяций, необходимо было оценить возможность региональной идентификации на основе выявленных частот комбинированных гаплотипов мтДНК. Был проведен симуляционный анализ выборок по «нулевому» сценарию, результаты которого представлены в табл. 8 и 9.
Показано, что вероятность идентификации камчатских популяций (за исключением р. Палана) достаточно высока, точность ее находится в пределах 70-86%. При рассмотрении популяций о. Сахалин, точность идентификации которых значительно ниже, можно отметить, что наибольшая часть «недостающих» процентов выпадает на генетически сходные популяции того же региона (табл. 8).
Нуклеотидная дшергекцня
Рис. 11. ИРвМА-дендрограмма, иллюстрирующая генетические различия между локальными популяциями горбуши Камчатки и о. Сахалин (обозначены курсивом)
Рис. 12. Ш-дендрограмма, иллюстрирующая генетические различия между локальными популяциями горбуши Камчатки и о. Сахалин (обозначены курсивом)
Таблица 8. Оценка состава (%) симулированных смешанных выборок горбуши («нулевой» сценарий)
Популяция 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1. Р. Водопадная 48,30 9,66 22,78 1,39 0,38 0,60 0,70 2,66 0,56 1,06
2. Р. Фирсовка 12,29 58,72 13,24 3,26 0,07 0,50 0,50 5,62 2,32 1,02
3. Р. Бахура 25,79 13,86 47,65 1,95 0,00 0,00 0,30 0,64 0,76 0,79
4. Р. Палана 0,93 2,10 4,01 57,25 0,77 0,48 2,62 5,89 2,87 1,85
5. Р. Коль 0,12 0,08 0,00 1,72 85,70 0,40 0,00 0,07 0,00 4,92
6. Р. Утка 1,64 3,78 2,03 8,15 5,60 86,22 2,20 12,09 4,28 1,09
7. Р. Большая 1,15 0,29 3,13 5,17 2,28 2,17 77,33 2,69 6,14 4,40
8. Р. Хайлюля 5,02 10,30 2,32 15,12 1,93 6,90 5,38 70,11 2,34 1,37
9. Р. Дранка 4,46 0,01 4,15 5,97 1,74 2,69 10,21 0,00 80,72 2,31
10. Р. Апука 0,00 0,00 0,00 0,01 0,92 0,02 0,00 0,20 0,00 80,29
Неизвестные 0,29 1,20 0,68 0,00 0,61 0,02 0,75 0,02 0,00 0,89
Всего 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
Таблица 9. Оценка регионального состава (%) симулированных смешанных выборок горбуши («нулевой» сценарий)
Регион 1 2
1. О. Сахалин 86,51 1,51
2. Полуостров Камчатка 12,75 98,18
Неизвестные 0,74 0,31
Всего 100,00 100,00
При оценке регионального состава симулированных выборок по нулевому сценарию выявлено, что точность идентификации в данном случае повышается до 98% для популяций Камчатки и до 86% для горбуши о. Сахалин (табл. 9).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Необходимо подчеркнуть несомненное теоретическое и практическое значение исследований внутривидовой организации такого важного в промысловом отношении вида как горбуша, относительно невысокий уровень межпопуляционной из-
менчивости которого, по сравнению с другими видами тихоокеанских лососей, получал разные объяснения (Алтухов, 2004; Варнавская, 2006). Основные из них, это:
1) миграционные потоки, связанные с более слабым инстинктом хоминга у данного вида (гипотеза о существовании системы «флуктуирующих стад») (Глубоковский, Животовский, 1986; Глубо-ковский и др., 1989). Данная гипотеза вызвала ряд достаточно обоснованных возражений (Алтухов и др., 2004) и до настоящего времени представляется спорным моментом в оценке современной популяционной структуры горбуши;
2) стабилизирующий (балансирующий) отбор, поддерживающий на относительно сходном уровне частоты в ряде аллозимных локусов на больших участках ареала (Алтухов и др., 1987; Алтухов и др., 1997);
3) небольшой «возраст» и общее происхождение популяций горбуши, нерестящихся на недавно освободившихся ото льда обширных областях, от
прапопуляций, переживших оледенение в рефугиу-мах до отступления Винконсинского ледника и процессов реколонизации (10-12 тыс. лет назад) освобождающихся территорий (Чуриков, 2001).
На основании полученных в настоящем исследовании результатов, возможность использования полиморфизма мтДНК в качестве информативного регионального маркера для анализа смешанных уловов горбуши представляется достаточно перспективной, но существует необходимость расширения района исследований и обязательного анализа популяций поколений четных и нечетных лет таких значительных регионов воспроизводства как Западная и Восточная Камчатка, о. Сахалин, Магаданское побережье Охотского моря, Курильские и Японские острова.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают искреннюю благодарность сотрудникам ФГУП «КамчатНИРО» Н.М. Ки-нас, И.В. Шатило, А.А. Ходько, И.Н. Кирееву, И.Н. Сиротенко, Д.С. Курносову, Е.Н. Збоевой за помощь в сборе генетических проб.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Алтухов Ю.П. 2003. Генетические процессы в популяциях. М.: Академкнига, 431 с.
Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А. 2002. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. Т. 38. № 9. С. 1173-1195.
Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Курбатова О.Л. и др. 2004. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / Под ред. Ю.П. Алтухова. М.: Наука, 619 с.
Алтухов Ю.П., Салменкова Е.А., Омельченко В.Т. 1997. Популяционная генетика лососевых рыб. М.: Наука, 287 с.
Брыков В.А. 2001. Эволюция генома, изменчивость и дивергенция ДНК у морских животных: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. М.: Ин-т общей генетики РАН, 48 с.
Брыков В.А., Полякова Н.Е., Скурихина Л.А. и др. 1999а. Популяционно-генетическая структура у горбуши ОпсогИупеИш gorbuscha ^а1Ьаиш) по результатам рестриктазного анализа митохондриальной ДНК: временная гетерогенность в период нерестового хода // Генетика. Т. 35. № 5. С.666-673.
Брыков В.А., Полякова Н.Е., Скурихина Л.А. и др. 1999б. Популяционно-генетическая струк-
тура у горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) по результатам рестриктазного анализа митохондриальной ДНК: динамика изменчивости в поколениях // Генетика. Т. 35. № 5. С.657-665.
Варнаеская Н.В. 2006. Генетическая дифференциация популяций тихоокеанских лососей. Петропав-ловск-Камчатский: КамчатНИРО, 488 с.
Глубокоеский М.К, Жиеотоеский Л.А. 1986. Популяционная структура горбуши: Система флуктуирующих стад // Биология моря. № 2. С. 39-44.
Глубокоеский М.К, Жиеотоеский Л.А., Викто-роеский Р.М. и др. 1989. Популяционная организация горбуши // Генетика. Т. 25. № 7. С. 1275-1284.
Гречко В.В. 2002. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики // Генетика. Т. 38. № 8. С. 1013-1033.
Жиеотоеский Л.А., Глубокоеский М.К, Викторое-ский Р.М. и др. 1989. Генетическая дифференциация горбуши // Генетика. Т. 25. № 7. С. 1261-1274.
Полякоеа Н.Е., Скурихина Л.А., Кухлееский А.Д. и др. 1996. Популяционно-генетическая структура у горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) по результатам рестриктазного анализа митохондриальной ДНК. Сравнение неперекрывающихся поколений четных и нечетных лет // Генетика. Т. 32. № 9. С. 1256-1262.
Салменкоеа Е.А., Гордеееа Н.В., Омельченко В.Т. и др. 2006. Генетическая дифференциация горбуши Oncorhynchus gorbuscha (Walbaum) в азиатской части ареала // Генетика. Т. 42. № 10. С. 1371-1387.
Чурикое Д.Ю. 2001. Генеалогия гаплотипов митохондриальной ДНК у нескольких видов тихоокеанских лососей: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. СПб.: Санкт-Петербургский Гос. ун-т, 17 с.
Avise J.C. 1994. Molecular markers, natural history and evolution. N.Y.; London: Chapman and Hall, 511 p.
Avise J.C. 2000. Phylogeography. The history and formation of species. Harvard Univ. Press. Cambridge. MA, London, England. 447 p.
Brown W.M., George M., Wilson A.C. 1979. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA // Proc. Nat. Acad. Sci. US. Vol. 76. P. 1967-1971.
Churikov D.U., Gharrett A.J. 2002. Comparative phylogeography of the two pink salmon brodlines: An analysis based on a mitochondrial DNA genealogy // Mol. Ecol. Vol. 11. P. 1077-1101.
Churikov D. U., Matsuoka M., Luan X. et al. 2001. Assessment of concordance among genealogical reconstructions from various mtDNA segments in three species of Pacific salmon (genus Oncorhynchus) // Mol. Ecol. Vol. 19. № 9. P. 2329-2339.
Excoffier L., Smouse P.E., Quattro J.M. 1992. Analyses of molecular variance inferred from metric distance among DNA gaplotypes: Application to human mitochondrial DNA restriction data // Genetics (US). V. 131. P. 479-491.
Ferris S.D., Berg W.J. 1987. The utility of mitochondrial DNA in fish genetics and management // Population genetics and fishery management / Ed. N. Ryman, F. Utter. Seattle; L.: Univ. Wash. press. P. 277-301.
Ferris S.D., Sage R.D., Prager E.M. et al. 1983. Mitochondrial DNA evolution in mice // Genetics. Vol. 105. P. 681-721.
Gharrett A.J., Gray A.K., Brykov V.A. 2001a. Phylogeographical analysis of mitochondrial DNA variation in Alaskan coho salmon, Oncorhynchus kisutch // Fish. Bull. Vol. 99. P. 528-544.
Gharrett A.J., Lane S., McGregor A.J., Taylor S.G. 2001b. Use the genetic marker to examine genetic interaction among subpopulations of pink salmon (Oncorhynchus gorbuscha) // Genetica Vol. 111. P. 259-267.
Masuda M., Nelson S., Pella J. 1991.The computer programs for computing conditional maximum likely estimates of stock composition from discrete characters // USA-Doc-NOAA NMFS Rep. Auke Bay Laboratory, Juneau, AK.
McElroy D.M., Moran P., Bermingham E., Korn-field I. 1992. REAP: An integrated environment for the manipulation and phylogenetic analysis of restriction data // J. Heredity. Vol. 83. P. 153-158.
Moritz C., Dowling T.E., Brown W.M. 1987. Evolution of animal mitochondrial DNA: Relevance for populatuon biology and sistematics // Annu. Rev. Ecol. Syst. Vol. 18. P. 269-292.
NeiM. Molecular evolutionary genetics. 1987. N.Y.: Columbia Univ. Press. 512 p.
Nei M., Li W.-H. 1979. Mathematical model for shifting genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc. Natl Acad. Sci. USA. Vol. 76. P. 5269-5273.
Nei M., Tajima F. 1983. Maximum likelihood of the number of nucleotide substitution from restriction sites data // Genetics. Vol. 105. P. 207-217.
Nei M., Tajima F. 1981. DNA polymorphism detectable by restriction endonucleases // Genetics. Vol. 105. P. 207-217.
PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. / Ed. Erlich H.A.. Stockton Press, 1989, 246 p.
Pella J., Masuda M., Nelson S. 1996. Search algo-riphms for computing stock composition of mixture from traits of individuals by maximum likelihood // US. Dep. Commer. NOAA Tech. Memo. NMFS-AFSC-61. 68 p.
Rolf F.J. 1990. NTSYS-ps: Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version. 1.60. N.Y.: Exter Publ. Ltd.
Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1626 p.
Schneider S., Roessli D., Excoffier L. 2000. Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, Univ. Geneva, Switzerland.
Seeb J.E., Habicht C., Olsen J.B. et al. 1998. Allozyme, mtDNA, and microsatellite variants describe structure of populations of pink and sockeye salmon in Alaska // North Pasific Anadr. Fish Comm. Bull. Vol. 1. P. 300-318.
Thomas W.K., Beckenbach A.T. 1989. Variation in salmonid mitochondrial DNA: evolutionary constraints and mechanisms of substitution // J. Mol. Evol. Vol. 29. P. 233-245.
Zardoya R., Garrido-Pertierra A., Bautista J.M.
1995. The complete nucleotide sequence of the mitochondrial DNA genome of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss // J. Mol. Evol. Vol. 41. P. 942-951.
