CC BY
36
УДК 619:616.982.2:543.39
М.А. Бажин, В.С. Власенко, Г.П. Неворотова
ПОЛУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕН-ПОЛИМЕРНЫХ КОМПЛЕКСОВ И ОЦЕНКА ИХ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ
Предложена технология приготовления белково-целлюлозных комплексов, представляющих новый тип бесклеточных (молекулярных) вакцин, которые могут быть применены в системе специфической профилактики хронических инфекционных болезней животных. Неактивированная целлюлоза с белковыми молекулами, имеющими карбоксильные группы, способна образовывать сложные эфиры. Катализатором этого процесса служит треххлористый хром (СгС13). Однако приготовление суспензии целлюлозы из хлопковой ваты в качестве матрицы предусматривает применение сильнодействующих химических соединений, также у препарата недостаточная способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность. Разработана технология приготовления комплексного иммуномодуля-тора микробного происхождения (КИМ-М) из составляющих: комплекс антигенов разрушенной ультразвуком культуры БЦЖ, инкубированный в растворе формалина и конъюгированный с поливинилпирро-лидоном (ПВП). Препарату присущи протективные свойства, способность восстанавливать у животных нарушенную иммунологическую реактивность. Было показано, что синтетические неприродные полиионы и поликатионы стимулируют иммунный ответ в результате усиления процессов клеточных миграций и Т-, В -кооперации, замещения хелперной функции Т-клеток, активации В -клеток и инактивации Т-супрессоров, при этом стимулирующий эффект ПВП с молекулярной массой 12600 наиболее выражен в дозе 10-20 мг/кг массы животного. Ранее также было установлено, что полиионы и поликатионы, в том числе ПВП, наряду с иммуностимулирующими свойствами обладают определенной токсичностью при введении ш у1уо и негативно влияют на отдельные этапы иммуногенеза. Для молодых животных доза 10-20 мг/кг массы бывает токсичной, что сопровождается функциональным напряжением иммунной системы. Учитывая этот факт, в технологию получения иммуномодулятора внесено дополнение, прежняя матрица КИМ-М дополнена ПЭГ в соотношении по массе ПВП к ПЭГ 4 : 1. Новая форма препарата наиболее эффективно восстанавливает нарушенную иммунологическую реактивность, устраняет вторичные иммунодефициты и обладает выраженными протективными свойствами, безвредна для животных.
Ключевые слова: морские свинки, иммуномодулятор, БЦЖ, туберкулез.
Введение
Туберкулез крупного рогатого скота во многих странах и в Российской Федерации остается одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии, наносит значительный экономический ущерб неблагополучным хозяйствам, владельцам животных и представляет большую опасность в заражении людей [1-3]. В 1998 г. в России была принята Федеральная программа по борьбе с туберкулезом. Это было связано с серьезной угрозой распространения туберкулеза человека и животных, вызванной ухудшением экономического положения страны в последние годы. Одно из направлений, которое многие эксперты определяют как наиболее перспективный путь к победе над туберкулезом, - это создание эффективных средств специфической профилактики и лечение. Развитие средств иммунологической защиты людей и животных идет по нескольким направлениям: продолжаются поиски в области традиционного вакцинного дела; создание искусственных вакцинных макромолекул, не имеющих аналогов в природе; регуляция иммунологической реактивности с помощью неспецифической стимуляции; другие работы по созданию препаратов иммуностимулирующей, иммуномо-дулирующей активности и адъювантных свойств синтетических и естественных средств [4-7].
© Бажин М.А., Власенко В.С., Неворотова Г.П., 2016
Обстановку по туберкулезу осложняет проявление так называемой неспецифической (парааллергической) реактивности КРС к туберкулезу, обусловливающей неясность эпизоотической ситуации, необоснованный убой продуктивных животных, потерю продукции и приплода, ограничение племенной работы, а также дополнительные затраты на дифференциальную диагностику. Неспецифические реакции на ППД - туберкулин для млекопитающих у животных могут проявляться до 6 месяцев. В таких хозяйствах оценка эпизоотической ситуации становится затруднительна, а методом только систематических и диагностических исследований, как правило, не удается достигнуть прекращения реакций в стаде. Кроме этого, наличие парааллергических реакций требует выполнения большого объема противоэпизоотических мероприятий.
В целом туберкулез КРС во многих странах и в РФ остается одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии, при этом до настоящего времени против туберкулеза и микробактериозов нет достаточно эффективных средств специфической профилактики и лечения.
В ГНЦ РФ (Институт иммунологии Федерального медикобиологического агентства) [8] теоретически и экспериментально разработан новый принцип создания иммуногенов и вакцин путем химического соединения заданных антигенов с иммуностимулирующими полиэлектролитами. Современная биотехнология позволяет выделить практически любой антигенный комплекс возбудителя и путем химического соединения антигена с полиионами получать высокоэффективные средства защиты.
Во ВНИИБТЖ за последние 15 лет была проведена научно-исследовательская работа по разработке технологий изготовления антигенполимерных комплексов с заданными свойствами: протективность, способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность, устранять вторичные иммунодефициты. На наш взгляд, более перспективным направлением создания бесклеточных, химических, экологически чистых иммунизирующих препаратов против хронических инфекций (бруцеллез, туберкулез, лейкоз, некробактериоз и др.) является коньюгация антигенного комплекса, выделенного из вакцинных или вирулентных штаммов микроорганизмов, с матрицей, создающей в организме животных депо специфического иммуногена. Представляется, что такой комплекс в системе иммунитета имитирует живую вакцину, способствует накоплению значительного количества клеток иммунологической памяти, которые в последующем обеспечивают защиту животного от инфекции.
Цель исследований - провести сравнительный анализ эффективности противотуберкулезных антигенполимерных комплексов, полученных с применением различных технологий.
Объекты и методы
Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулезом в соответствии с тематическим планом НИР.
Объектом исследования были морские свинки, культура вакцинного штамма БЦЖ, полиионы (суспензия целлюлозы, ПВП, ПЭГ), патологический материал от инфицированных морских свинок. Исследования проведены в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755). Лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно нормам. Комплекс антигенов для конъюгации с полиэлектролитами выделяли из культуры вакцинного штамма БЦЖ, которую выращивали на жидкой синтетической среде Сотона, затем подвергали ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22 кГц, 60-70 Вт/см2 в течение 30 мин). Полученную взвесь центрифугировали и в надосадочной жидкости
определяли содержание белка по методу, описанному Е.В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорд [9], и биуретовой пробы на фотометре - 5010 V5+.
В разработке биотехнологии изготовления иммобилизированных антигенов ми-кобактерий использовали метод получения целлюлозной матрицы по Е.В. Лехтцинд и А.Е. Гурвич [10], что послужило основой разработки технологии получения противотуберкулезных белково-целлюлозных комплексов (ТБЦ). Анализ протективных свойств получаемых комплексов на морских свинках провели по методу С.И. Гельберг, Е.А. Финкель [11] и напряженности иммунитета по индексу защиты, предложенной А.И. Тогуновой с соавт. [12]. Аллергические исследования проводили ППД-тубер-кулином для млекопитающих производства Курской биофабрики.
Цифровой материал экспериментальных исследований обработан математической статистикой с использованием t-критерия по Стьюденту и программы Microsoft Exсel.
Ход и результаты исследований
Оценка технологии изготовления белково-целлюлозных комплексов из микобакте-рий на основе их реактогенных, иммуногенных и протективных свойств. Доступность и сравнительная простота химического моделирования целлюлозы позволяет оценить ее как матрицу для иммобилизации антигенов микобактерий. Перспективная область применения целлюлозных матриц открылась после того, как была показана возможность получения большого количества антител, иммунизируя животных белками, присоединенными ковалентно к этим матрицам [13]. Анализируя природу этого феномена, авторы рассматривают вводимый комплекс как источник постепенного осуществляющего ферментами или макрофагами антигена с последующим развитием сложного комплекса иммунологических реакций.
В качестве матрицы использовали суспензию целлюлозы, приготовленную из хлопковой ваты. Антигенный комплекс получали из культуры вакцинного штамма БЦЖ, выросшего на жидкой синтетической среде Сотона. Суспензию бактериальных клеток подвергли ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22-35 кГц, 60-70 Вт/см2 в течение 8-10 мин), полученную взвесь центрифугировали 30 мин при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость собирали и использовали в качестве антигенов цитоплазматической фракции.
Осадок ресуспензировали в физиологическом растворе и вновь подвергли дезинтеграции в течение 30 мин. Полученную взвесь центрифугировали 30 минут при 1500 оборотов в минуту (этот параметр является оптимальным для получения фракции клеточных оболочек) и надосадочную жидкость использовали в качестве антигенов фракции клеточных оболочек.
Количество белка определяли на фотоколориметре с использованием красителя бромфенолового синего при 590 нм. Определение количества белка и приготовление суспензии целлюлозы из хлопковой ваты провели по методу Е.В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорд [9].
Фракцию клеточных оболочек смешали с суспензией целлюлозы в соотношении 100 мг белка на 1 г целлюлозы при одновременном добавлении 25 цМ треххлористого хрома (CrCl3). После тщательного перемешивания смесь поставили на магнитную мешалку при температуре 4°C на 3 суток. Реакционную смесь осаждали и 4-5 раз отмывали физиологическим раствором, центрифугируя 15 мин при 2000 об/мин. Осадок конъ-югата развели физиологическим раствором в минимальном объеме. Присоединившийся белок определили по окрашиванию бронфеноловым синим.
В полученный препарат добавляли антигены цитоплазматической фракции и до концентрации в конъюгате 1,0-2,0 мг/мл белка с целью стандартизации дозы пре-
парата по белку. В результате получили противотуберкулезную, бесклеточную вакцину на целлюлозной матрице (ТБЦ).
С целью изучения протективных свойств ТБЦ вакцины и ее составляющих были подобраны 59 морских свинок весом по 300-400 г, предварительно исследованных ППД-туберкулином для млекопитающих и не реагирующих на него. Из экспериментальных животных сформировали 8 групп: 7 морских свинок привили суспензией целлюлозы (СЦ) подкожно в дозе 1,5 мл (1-я группа); 7 привили антигенным комплексом цитоплазматической фракции (АГЦ) в дозе 0,50 мг/0,5 мл белка (2-я группа); 7 привили антигенным комплексом клеточных оболочек (АГКО) в дозе 0,5 мг/0,5 мл белка (3-я группа); 7 привили антигенным комплексом цитоплазматической фракции, конъ-югированным на целлюлозе (К-АГЦ) в дозе 0,5 мг/0,5 мл белка (4 -я группа); 7 привили антигенным комплексом клеточных оболочек, конъюгированным на целлюлозе (К-АГКО) в дозе 0,5 мг/0,5 мл белка (5 -я группа); 10 привили антигенполимерным комплексом (ТБЦ) в дозе 0,5 мг/0,5 мл белка (6 -я группа); 10 привили вакциной БЦЖ подкожно в дозе 0,5 мг (7-я группа) и 4 морские свинки интактные были контрольными.
Для изучения протективных свойств препаратов всем морским свинкам через 2 мес. после вакцинации подкожно в область левого паха ввели вирулентную культуру M. bovis шт. 14 в дозе 0,001 мг. Убой животных провели через 2 месяца после инфицирования.
Результаты испытания (табл. 1) показали, что всем по отдельности составляющим ТБЦ вакцины, кроме СЦ, присущи протективные свойства, индекс защиты которых составляет от 69,8 до 96,6%, индекс защиты ТБЦ вакцины 85,5% и вакцины БЦЖ 96%.
Таблица 1
Протективные свойства антиген-полимерных комплексов
Группа Кол-во животных Препарат, доза на животное Заразилось Процент иммунных Показатель интенсивности поражений, баллы Индекс защиты, %
1 7 СЦ, 1,5 мл 7 0 7,0 14,3
2 7 АГЦ, 0,5 мг 5 28,6 2,57 69,8
3 7 АГКО, 0,5 мг 4 42,9 2,14 74,8
4 7 К-АГЦ, 0,5 мг 3 57,1 0,86 89,0
5 7 К-АГКО, 0,5 мг 1 85,7 0,29 96,6
6 10 ТБЦ вакцина, 0,5 мг 4 60,0 1,10 85,5
7 10 БЦЖ вакцина, 0,5 мг 2 80,0 0,30 96,0
8 4 - 4 - 8,50 0
С целью получения противотуберкулезного препарата, способного восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность, устранять вторичные иммунодефи-циты, усиливать протективные свойства вакцины БЦЖ, была разработана технология получения специфического иммуномодулятора (КИМ -М), включающая в себя: получение антигенного комплекса из вакцинного штамма БЦЖ; инкубацию антигенного комплекса в растворе формальдегида и конъюгацию с поливинилпирролидоном (ПВП); испытание иммуномодулирующих свойств препарата на морских свинках.
Посев вакцинного штамма БЦЖ провели на жидкую синтетическую среду Сото-на. Выросшую бактериальную массу трижды отмыли стерильным физиологическим раствором центрифугированием 20 мин при 3000 об/мин. Отмытую бактериаль-
ную массу ресуспензировали в стерильном физиологическом растворе из расчета 1 : 5 (1,0 г бактериальной массы и 5 мл физиологического раствора).
Суспензию бактериальных клеток подвергли ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22-35 кГц, 60-70 Вт/см2 в течение 30 мин), полученную взвесь центрифугировали 30 мин при 15000 об/мин. В надосадочной жидкости определили количество белка на фотоэлектроколориметре с использованием красителя бромфенолого синего.
В объем антигенного комплекса (99,3 мл) добавили 0,7 мл 37%-ного медицинского формальдегида. Реакционную смесь инкубировали в термостате при температуре 37оС в течение 7-9 сут. Внесение формальдегида снижает аллергическое действие препарата [14].
Затем к реакционной смеси добавили ПВП, концентрацию которого довели на 1 мг/мл белка 600 мг ПВП (1 : 600). В 10 мг/мл белка после инкубирования постепенно частями добавляли ПВП, размешивая на магнитной мешалке при комнатной температуре до получения эффекта, вновь измеряли содержание белка, добавляя в одном случае надосадочную жидкость разрушенной БЦЖ с известным содержанием белка; во втором - стерильный физиологический раствор. Стимулирующий эффект ПВП с молекулярной массой 12600 наиболее выражен в дозе 10-20 мг/кг массы [15].
С целью разработки способа индуцирования иммунологической толерантности у морских свинок ППД -туберкулином и восстановления иммунологической реактивности с помощью известных иммуномодулирующих средств провели исследование на 25 морских свинках массой по 350-400 г.
20 морским свинкам ввели аллерген ППД--туберкулин для млекопитающих подкожно в дозе 1,5 мл, разделив животных на 5 групп, по 4 в каждой. Морских свинок 1-й группы иммунизировали вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора через 3 суток после толерогенной обработки; 2-й через 7 суток; 3-й через 14 суток; 4-й через 21 сутки; 5-й через 28 суток. Животных 6-й группы (5 морских свинок) иммунизировали вакциной БЦЖ без предварительной толерогенной обработки. Всех морских свинок исследовали ППД -туберкулином через 30 суток после вакцинации.
В результате было установлено, что у морских свинок восстановление утраченной иммунологической реактивности начинается с 21 суток после толерогенной обработки. В течение первых двух недель после толерогенной обработки морские свинки не отвечают на вакцину БЦЖ кожной аллергической реакцией на ППД -туберкулин для млекопитающих. Следовательно, в эти сроки можно испытывать препараты на способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность.
Испытание антиген-полимерных комплексов с помощью описанной методики показало, что наиболее высокая способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность у морских свинок установлена у препарата, изготовленного из антигенного комплекса БЦЖ, инкубированного с формалином и конъюгированного с ПВП, степень пораженности органов при его применении - 1,75 ± 0,75 баллов; индекс защиты 80%. Таким образом антигенполимерные комплексы (КИМ -М) способны восстанавливать иммунологическую реактивность у толерантных морских свинок.
В дальнейшем с целью изучения стимулирующего эффекта КИМ -М повышения защитных свойств вакцины БЦЖ проведено исследование на морских свинках, из которых сформировали 5 групп. Животных первых трех групп привили КИМ-М, затем ревакцинировали вакциной БЦЖ через 15 суток (1-я группа); через 45 суток (2 -я группа); через 75 суток (3 -я группа). Морских свинок 4 -й группы привили КИМ-М и через
45 суток ревакцинировали КИМ-М; животные 5-й группы были контрольными. Животных всех групп через 30 суток после иммунизации исследовали ППД-туберкулином и инфицировали вирулентной культурой M. bovis шт. 14 в дозе 0,001 мг в 1 мл физиологического раствора подкожно. Затем через 30 суток после заражения вновь исследовали ППД-туберкулином и после убоя у морских свинок определили интенсивность пораженности органов и индекс защиты (табл. 2).
Таблица 2
Результаты оценки стимулирующего эффекта КИМ-М на протективные свойства БЦЖ
Группа животных Кожная аллергическая реакция через 30 дней после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Интенсивность поражения органов, баллы, M ± m Индекс защиты, %
n реагировало M ± m n реагировало M ± m
1-я 5 4 8,0 ± 2,16 5 5 11,0 ± 1,67 1,8 ± 0,73 76
2-я 5 5 12,0 ± 0,95 4 4 12,0 ± 1,68 2,25 ± 0,75 70
3-я 4 3 8,5 ± 3,28 4 4 13,0 ± 0,70 3,25 ± 0,25 56
4-я 5 - - 4 3 11,7 ± 4,25 6,0 ± 1,08 19
5-я 5 - - 5 5 13,0 ± 0,95 7,4 ± 0,51 0
У морских свинок, первоначально привитых КИМ-М и затем БЦЖ, индекс защиты выше, чем у морских свинок после ревакцинации КИМ-М, причем интенсивность эффекта ревакцинации находится в прямой зависимости от интервала между прививками: индекс защиты у животных, ревакцинированных через 15 суток, составил 76%, через 45 суток - 70% и через 75 суток - 56%.
Ранее было установлено, что полианионы и поликатионы, в том числе ПВП, наряду с иммуностимулирующими свойствами обладают определенной токсичностью при введении in vivo и негативно влияют на отдельные этапы иммуногенеза [16]. Введение в матрицу водорастворимого неионогенного полимера - полиэтиленгликоля - усиливает способность взаимодействия с билипидным слоем клеточных мембран. Использование ПЭГ в качестве носителя антигенных детерминанат перспективно из -за его нетоксичности, и то, что функциональные группы ПЭГ находятся на концах полимерной цепи, позволяет фиксировать определенные положения антигенных детерминант.
Изготовили 4 типа комплексного иммуномодулятора: КИМ -М; КИМ-М2; КИМ-М3; КИМ-М4 с использованием разных матриц. С этой целью к ПВП добавляли разное количество водорастворимого неиногенного полимера - ПЭГ: 4 части ПВП + 1 часть ПЭГ (КИМ-М2); 3,5 части ПВП + 1,5 части ПЭГ (КИМ -М3); 2,5 части ПВП + 2,5 части ПЭГ (КИМ-М4)
Провели оценку препаратов на их способность восстанавливать у морских свинок иммунологическую реактивность. Через 3 -е суток после индукции толерантности пяти морским свинкам ввели КИМ -М (1-я группа); пяти морским свинкам ввели КИМ -М2 (2-я группа); пяти морским свинкам ввели КИМ-М3 (3-я группа); пяти морским свинкам ввели КИМ-М4 (4-я группа). Препараты морским свинкам ввели подкожно в дозе 0,5 мг белка в 0,5 мл физиологического раствора. Через 12 суток после толерогенной обработки морские свинки были привиты вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг; другие 5 морских свинок были привиты БЦЖ без толерогенной обработки (5 -я группа) и 4 интактные морские свинки служили в качестве контрольных (6 -я группа). Через 30 суток после иммунизации вакциной БЦЖ все морские свинки были инфицированы вирулентной культурой M. bovis шт. 14 подкожно в дозе 0,0001 мг и через 30 суток
подвергнуты эвтаназии для оценки поражения органов и определения индекса защиты. Результаты испытания вновь синтезируемых препаратов на их способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность показаны в табл. 3.
Таблица 3
Результаты оценки способности антиген-полимерных комплексов восстанавливать иммунологическую реактивность у морских свинок
Группа животных, препарат Кожная аллергическая реакция через 30 дней после вакцинации, мм Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Интенсивность поражения органов, баллы, M ± m Индекс защиты, %
n реагировало M ± m n реагировало M ± m
КИМ-М 5 5 6,75 ± 1,03 5 5 13,75 ± 0,48 2,75 ± 0,75 80
КИМ-М2 5 3 4,60 ± 2,11 5 2 2,20 ± 1,35 0,60 ± 0,60 92
КИМ-М3 5 5 8,40 ± 0,92 5 5 6,20 ± 0,58 3,60 ± 0,40 53
КИМ-М4 5 4 6,80 ± 1,93 4 4 7,00 ± 1,08 3,50 ± 0,50 55
БЦЖ 5 4 10,2 ± 2,94 5 5 7,80 ± 0,97 2,40 ± 0,60 69
Контроль 4 - - 4 4 12,75 ± 0,94 7,75 ± 0,25 0
В результате установили, что наивысшая способность восстанавливать утраченную иммунологическую реактивность у морских свинок присуща антиген -полимерному комплексу КИМ-М2: интенсивность пораженности органов - 0,6 ± 0,6 баллов, индекс защиты 92%, тогда как у КИМ-М соответственно: 1,75 ± 0,75; 80%. Наиболее низкая способность выявлена у антиген -полимерных комплексов КИМ -М3 и КИМ-М4; соответственно 3,6 ± 0,40; 53% и 3,5 ± 0,50; 55%. У морских свинок, привитых вакциной БЦЖ, интенсивность пораженности органов 2,40 ± 0,60 балла, индекс защиты 69%.
Провели сравнительное изучение протективных свойств синтезируемых препаратов (ТБЦ-2, КИМ-М, КИМ-М2) и вакцины БЦЖ. В опыт отобрали 40 морских свинок, из которых: 10 морских свинок привили ТБЦ-2 (1-я группа); 10 привили КИМ-М (2-я группа); 10 привили КИМ-М2 (3-я группа). Морские свинки этих групп привиты подкожно в дозе 0,5 мг/мл белка каждого из препаратов. Другие 5 морских свинок были привиты вакциной БЦЖ внутрикожно в дозе 0,1 мг (4 -я группа) и 5 морских свинок служили в качестве контрольных (5 -я группа). Через 30 суток после прививки всех животных инфицировали вирулентной культурой M. bovis шт. 14 подкожно в дозе 0,0001 мг и через 30 суток подвергли эвтаназии для оценки индекса защиты. Результаты анализа показаны в табл. 4.
Таблица 4
Сравнительная оценка протективных свойств антиген-полимерных комплексов
на морских свинках
Группа животных, препарат Кожная аллергическая реакция через 30 дней после заражения, мм Интенсивность поражения органов, баллы, M ± m Индекс защиты, %
n реагировало M ± m
ТБЦ-2 10 10 5,0 ± 3,06 4,20 ± 0,20 50
КИМ-М 10 10 10,60 ± 0,50 2,50 ± 0,16 53
КИМ-М2 10 10 13,80 ± 0,90 1,60 ± 0,40 70
БЦЖ 5 5 7,80 ± 0,97 2,40 ± 0,60 69
Контроль 5 5 15,20 ± 1,18 8,50 ± 0,24 0
Наиболее активно защищает от экспериментального заражения туберкулезом антиген-полимерный комплекс КИМ-М2 и вакцина БЦЖ соответственно: интенсивность поражения - 1,60 ± 0,40 и индекс защиты 70%; интенсивность поражения 2,40 ± 0,60 и индекс защиты 69%.
Следовательно, технология приготовления комплексного специфического имму-номодулятора микробного происхождения (КИМ-М2) из составляющих: антигенный комплекс разрушенной культуры БЦЖ, инкубированный в растворе формалина и конъюгированный с полиэлектролитами (4 части ПВП и 1 часть ПЭГ) позволяет получить препарат, наиболее эффективно восстанавливающий нарушенную иммунологическую реактивность, устраняющий вторичные иммунодефициты, усиливающий про-тективные свойства вакцины БЦЖ и обладающий выраженными протективными свойствами, безвредный для животных.
Заключение
Использование суспензии целлюлозы из хлопковой ваты в качестве матрицы для иммобилиации белковых бактериальных антигенов позволяет предложить технологию приготовления белково-целлюлозных комплексов, представляющих новый тип бесклеточных (молекулярных) вакцин, которые могут быть использованы в системе специфической профилактики хронических инфекционных болезней животных [17]. Неактивированная целлюлоза с белковыми молекулами, имеющими карбоксильные группы, способна образовывать сложные эфиры. Катализатором этого процесса служит CrCl3, который активирует реакцию этерификации, связывая молекулы воды. Результаты эксперимента показали, что оптимальной концентрацией вводимого в раствор CrCl3 является 25 мк-моль/л, и оптимальное соотношение целлюлозы «антиген - 10 : 1».
Недостатком описанного способа можно назвать: приготовление суспензии целлюлозы из хлопковой ваты в качестве матрицы предусматривает применение сильно действующих химических соединений (раствор аммиака, сернокислая медь, щелочный раствор, концентрированная серная кислота и др.), что является небезопасным для работающих; затратным при изготовлении; у препарата низкая способность восстанавливать у животных утраченную иммунологическую реактивность.
Предложена технология изготовления комплексного иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М) из составляющих: комплекс антигенов разрушенной культуры БЦЖ, инкубированный в растворе формалина и конъюгированный с поливи-нилпирролидоном (ПВП). Препарат обладает протективными свойствами, способностью восстанавливать нарушенную иммунологическую реактивность, делением про-тективных свойств вакцины БЦЖ [18].
В работах Р.В. Петрова, Р.М. Хаитова [19] показано, что синтетические неприродные полиионы и поликатионы стимулируют иммунный ответ в результате усиления процессов клеточных миграций и Т- и В-кооперации, замещения хелперной функции Т-клеток, активации В-клеток - предшественников антителообразующих клеток и инактивации Т-супрессоров, при этом стимулирующий эффект ПВП с молекулярной массой 12600 наиболее выражен в дозе 10-20 мг/кг массы. Ранее также было установлено, что полианионы и поликатионы, в том числе ПВП, наряду с иммуностимулирующими свойствами обладают определенной токсичностью при введении in vivo и негативно влияют на отдельные этапы иммуногенеза [16]. Для молодых животных доза в 10-20 мг/кг массы бывает токсичной, что сопровождается функциональным напряжением иммунной системы [20].
При учете этого факта в технологии получения иммуномодулятора внесено дополнение. Прежняя матрица КИМ-М дополнена ПЭГ в соотношении по массе ПВП к ПЭГ 4 : 1. Новая форма препарата наиболее эффективно восстанавливала нарушенную иммунологическую реактивность, устраняла вторичные иммунодефициты и обладает выраженными протективными свойствами, безвредна для животных.
M.A. Bazhin, V.S. Vlasenko, G.P. Nevorotova
The preparation of specific antigen polymer complexes and the evaluation of its protective properties
There has been proposed a technology of preparation of protein-cellulose complexes, which represents a new type of cell-free (molecular) vaccines that can be used in the system of specific prevention of chronic infectious diseases of animals. The inactivated cellulose with protein molecules having a carboxyl groups can form esters. The catalyst for this process is chromium trichloride (CrCl3). However, the preparation of a suspension of cellulose from cotton wool as a matrix provides for the use of potent chemical compounds, also in this preparation has an insufficient ability to restore lost immune reactivity. There has been developed the technology of preparing of complex immunomodulator of microbial origin (KIM-M) of the components: complex antigens sonicated of BCG-culture incubated in formalin solution, and conjugated with polyvinylpyrrolidone (PVP). The preparation has protective properties, the ability to restore an impaired immune responsiveness of the animals. It has been shown that the synthetic non-natural polyions and polycations stimulate the immune response as a result the strengthening the processes of cell migrations and T, B-cooperations, the substitution of helper function of T-cells, the activation of B-cells and inactivation of T-suppressors, thus the stimulating effect of PVP with molecular weight of 12,600 is most pronounced at a dose of 10-20 mg/kg weight of the animal. Previously, it was also found that the polyions and polycations, including PVP, together with immunostimulatory properties have a certain toxicity at introduction in vivo and negatively effect on the individual steps of immunogenesis. The dose of 10-20 mg/kg of weight can be toxic for young animals, which is accompanied by functional stress of the immune system. Considering this fact, there was made the addition in the technology of producing an immunomodulator: old matrix KIM-M is complemented PEG in a weight ratio of PVP to PEG - 4 : 1. The new form of the preparation most effectively restores the impaired immunological reactivity, eliminates secondary immunodeficiencies and has a pronounced protective properties, it is harmless to animals.
Keywords: guinea pigs, immunomodulator, BCG, tuberculosis.
Список литературы
1. Донченко А.С. Повышение протективных свойств вакцины БЦЖ / А.С. Донченко // Вестн. РАСХН. - 1995. - № 5. - С. 58-61.
2. Сафин М.А. Роль провокации скрытого носительства микобактерий туберкулеза в оздоровлении неблагополучного стада / М.А. Сафин, Р.А. Хамзин, Ч.М. Сафина // Материалы Всерос. науч. конф. по проблемам хронических инфекций : сб. науч. тр. / ВНИИБТЖ. - Омск, 2001. - С. 138-140.
3. Найманов А.Х. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации / А.Х. Найманов, Н.Г. Тол-стенко, Н.М. Ткач // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантро-понозных инфекций : материалы Всерос. науч.-практ. конф. - Омск, 2009. - С. 140-142.
4. Поликлональная активация В-лимфоцитов синтетическими полиэлектролитами / Р.В. Петров [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии. - 1981. - № 4. - С. 461-463.
5. Отмена феномена антигенной конкуренции под влиянием сополимера акриловой кислоты с N-поливинилпирролидоном / Р.В. Петров [и др.] // Иммунология. - 1982. - № 3. - С. 54-56.
6. Петрянкин Ф.П. Иммунотропные препараты для лечения и профилактики болезней животных / Ф.П. Петрянкин // Ветеринарная патология. - 2009. - № 2. - С. 98-105.
References
1. Donchenko A.S. Povyshenie protektivnykh svoistv vaktciny BTsZh / A.S. Donchenko // Vestn. RASKHN. - 1995. - № 5. - S. 58-61.
2. Safin M.A. Rol provokatcii skrytogo nosi-telstva mikobakterii tuberkuleza v ozdorovlenii neblagopoluchnogo stada / M.A. Safin, R.A. Kham-zin, Ch.M. Safina // Materialy Vseros. nauch. konf. po problemam khronicheskikh infektcii : sb. nauch. tr. / VNIIBTZH. - Omsk, 2001. - S. 138-140.
3. Naimanov A.Kh. Epizooticheskaia situatciia po tuberkulezu krupnogo rogatogo skota v Rossiiskoi Federatcii / A.Kh. Naimanov, N.G. Tolstenko, N.M. Tkach // Sovremennye problemy diagnostiki i profilaktiki khronicheskikh zooantroponoznykh infektcii : materialy Vseros. nauch.-prakt. konf. -Omsk, 2009. - S. 140-142.
4. Poliklonalnaia aktivatciia B-limfotcitov sinteticheskimi polielektrolitami / R.V. Petrov [i dr.] // Biulleten eksperimentalnoi biologii. - 1981. - № 4. -S. 461-463.
5. Otmena fenomena antigennoy konkurentsii pod vliyaniyem sopolimera akrilovoy kisloty s N-po-livinilpirrolidonom / R.V. Petrov [i dr.] // Immunolo-giya. - 1982. - № 3. - S. 54-56.
6. Petryankin F.P. Immunotropnyye preparaty dlya lecheniya i profilaktiki bolezney zhivotnykh / F.P. Petryankin // Veterinarnaya patologiya. -2009. - № 2. - S. 98-105.
7. Романова Р.Ю. Иммуногенные свойства и диагностическая ценность антигенов микобак-терий БЦЖ : автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Р.Ю. Романова. - М., 1992. - 48 с.
8. Способность конъюгатов бактериального полисахарида с синтетическими полиэлектролитами давать иммунизирующий эффект / Р.В. Петров [и др.] // Иммунология. - 1983. -№ 5. - С. 40-43.
9. Лехтцинд Е.В. Приготовление иммуно-сорбентов на основе суспензии диальдегидцел-люлозы / Е.В. Лехтцинд, Д.А. Эльгорт // Иммуно-сорбенты и их использование в биотехнологии : сб. науч. тр. НИИЭМ им. Гамалеи. - М., 1987. -С. 92-95.
10. Лехтцинд Е.В. Синтез высокоемкого иммуносорбента на основе суспензии целлюлозы / Е.В. Лехтцинд, А.Е. Гурвич // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1981. - № 7. - С. 68-70.
11. Гельберг С.И. К методике экспериментального изучения иммуногенных свойств противотуберкулезных вакцин и эффективности методов их применения / С.И. Гельберг, Е.А. Финкель // Проблемы туберкулеза. - 1959. - № 2. - С. 80-84.
12. Иммуногенные свойства сухой вакцины БЦЖ / А.И. Тогунова, Е.Н. Лещинская [и др.] // Бюл. ин-та туберкулеза АМН СССР. - 1951. -№ 1. - С. 27-33.
13. Гурвич А.Е. Усиление иммуногенности белков путем их присоединения к целлюлозной матрице / А.Е. Гурвич, А.А. Корунова, Д.А. Эльгорт // Иммуномодуляторы : сб. тр. Центр. НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова. - М., 1987. - С. 67-76.
14. Пат. 1825630 СССР, МПК5 А 61 К 39/35. Способ подавления повышенной чувствительности животных при введении туберкулина или маллеина / А.А. Евглевский ; Сельскохозяйственный ин-т им. проф. И.И. Иванова. -№ 4145786/15 ; заявл. 12.08.1986 ; опубл. 07.07.1993. Изобретение № 25.
15. Петров Р.В. Иммуногенетика и искусственные антигены / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, Р.И. Атауллаханов. - М. : Медицина, 1983. - 256 с.
16. Влияние сополимеров N-винилпирроли-дона и акриловой кислоты на отдельные этапы иммуногенеза / А.М. Нажмитдинов [и др.] // Журнал микробиологии. - 1979. - № 9. - С. 14-18.
17. Пат. 2217164 РФ, МПК А61К 39/04. Способ получения вакцины против туберкулеза / М.А. Бажин, В.В. Шамов, В.Г. Ощепков, В.И. Око-лелов, Г.П. Неворотова ; Всерос. науч.-исслед. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. -№ 2001129597 ; заявл. 01.11.2001 ; опубл. 27.11.2003. Изобретение № 33.
18. Пат. 2366455 РФ, МПК А61К 39/04, 02N 1/20, C12R 1/32. Способ получения специфического иммуномодулятора / М.А. Бажин,
7. Romanova R.Yu. Immunogennyye svoystva i diagnosticheskaya tsennost antigenov mikobakteriy BTsZh : avtoref. dis. ... d-ra biol. nauk / R.Yu. Romanova. - M., 1992. - 48 s.
8. Sposobnost konyugatov bakterialnogo polisakharida s sinteticheskimi polielektrolitami davat immuniziruyushchiy effekt / R.V. Petrov [i dr.] // Immunologiya. - 1983. - № 5. -S. 40-43.
9. Lekhttsind E.V. Prigotovleniye immunosor-bentov na osnove suspenzii dialdegidtsellyulozy / E.V. Lekhttsind, D.A. Elgort // Immunosor-benty i ikh ispolzovaniye v biotekhnologii : sb. nauch. tr. NIIEM im. Gamalei. - M., 1987. -S. 92-95.
10. Lekhttsind E.V. Sintez vysokoyemkogo immunosorbenta na osnove suspenzii tsellyulozy / E.V. Lekhttsind, A.E. Gurvich // Byul. eksperim. biol. i med. - 1981. - № 7. - S. 68-70.
11. Gelberg S.I. K metodike eksperimentalno-go izucheniya immunogennykh svoystv protivotu-berkuleznykh vaktsin i effektivnosti metodov ikh primeneniya / S.I. Gelberg, E.A. Finkel // Problemy tuberkuleza. - 1959. - № 2. - S. 80-84.
12. Immunogennyye svoystva sukhoy vaktsiny BTsZh / A.I. Togunova. E.N. Leshchinskaya [i dr.] // Byul. in-ta tuberkuleza AMN SSSR. - 1951. - № 1. -S. 27-33.
13. Gurvich A.E. Usileniye immunogennosti belkov putem ikh prisoyedineniya k tsellyuloznoy matritse / A.E. Gurvich, A.A. Korunova, D.A. Elgort // Immunomodulyatory : sb. tr. Tsentr. NII vaktsin i syvorotok im. I.I. Mechnikova. - M., 1987. -S. 67-76.
14. Patent 1825630 SSSR. MPK5 A 61 K 39/35. Sposob podavleniya povyshennoy chuvstvi-telnosti zhivotnykh pri vvedenii tuberkulina ili malleina / A.A. Evglevskiy ; Celskokhozyaystvennyy in-t im. prof. I.I. Ivanova - № 4145786/15 ; zayavl. 12.08.1986 ; opubl. 07.07.1993. Izobreteniye № 25.
15. Petrov R.V. Immunogenetika i iskusstven-nyye antigeny / R.V. Petrov, R.M. Khaitov, R.I. Ata-ullakhanov. - M. : Meditsina, 1983. - 256 s.
16. Vliyaniye sopolimerov N-vinilpirrolidona i akrilovoy kisloty na otdelnyye etapy immunogeneza / A.M. Nazhmitdinov [i dr.] // Zhurnal mikrobiolo-gii. - 1979. - № 9. - S. 14-18.
17. Patent 2217164 RF. MPK A61K 39/04. Sposob polucheniya vaktsiny protiv tuberkuleza / M.A. Bazhin, V.V. Shamov, V.G. Oshchepkov, V.I. Okolelov, G.P. Nevorotova ; Vseros. nauch.-issled. in-t brutselleza i tuberkuleza zhivotnykh. -№ 2001129597 ; zayavl. 01.11.2001 ; opubl. 27.11.2003. Izobreteniye № 33.
18. Patent 2366455 RF. MPK A61K 39/04. S12N 1/20. C12R 1/32. Sposob polucheniya spetsificheskogo immunomodulyatora / M.A. Bazhin,
В.С. Власенко, А.Н. Новиков, Г.П. Неворотова, Е.М. Шулико, Т.С. Реутова ; Мин-во с.-х. и продовольствия Омской области, Всерос. науч.-ис-след. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. -№ 2007139594 ; заявл. 25.10.2007 ; опубл. 10.09.2009. Изобретение № 25.
19. Петров Р.В. Искусственные антигены и вакцины / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов. - М. : Медицина, 1988. - 288 с.
20. Патент 2478399 РФ, МПК А61К 39/04, А61К 47/48. Способ получения специфического иммуномодулятора / М.А. Бажин, А.Н. Новиков, В.С. Власенко, Г.П. Неворотова, С.Ю. Петров, Е.М. Шулико, В.А. Назарова ; Всерос. науч.-ис-след. ин-т бруцеллеза и туберкулеза животных. -№ 2011124695 ; заявл. 16.06.2011 ; опубл. 10.04.2013. Изобретение № 10.
Бажин Михаил Аристоклевич, д-р вет. наук, проф., ФГБНУ ВНИИБТЖ; Власенко Василий Сергеевич, д-р биол. наук, доц., ФГБНУ ВНИИБТЖ, vvs-76@list.ru; Неворотова Галина Петровна, мл. науч. сотр., ФГБНУ ВНИИБТЖ.
УДК 619:616:577
В.И. Герунов, Д.С. Теущаков, Я.В. Горошенко
V.S. Vlasenko, A.N. Novikov, G.P. Nevorotova, E.M. Shuliko, T.S. Reutova ; Min-vo s.-kh. i prodovolstviya Omskoy oblasti, Vseros. nauch.-issled. in-t brutselleza i tuberkuleza zhivotnykh. -№ 2007139594 ; zayavl. 25.10.2007 ; opubl. 10.09.2009. Izobreteniye № 25.
19. Petrov R.V. Iskusstvennyye antigeny i vak-tsiny / R.V. Petrov, R.M. Khaitov. - M. : Meditsina, 1988. - 288 s.
20. Patent 2478399 RF. MPK A61K 39/04. A61K 47/48. Sposob polucheniya spetsificheskogo immunomodulyatora / M.A. Bazhin, A.N. Novikov, V.S. Vlasenko, G.P. Nevorotova, S.Yu. Petrov, E.M. Shuliko, V.A. Nazarova ; Vseros. nauch.-issled. in-t brutselleza i tuberkuleza zhivotnykh. -№ 2011124695 ; zayavl. 16.06.2011 ; opubl. 10.04.2013. Izobreteniye № 10.
Bazhin Mikhail Aristoklievich, Dr. Vet. Sci., Prof., All-Russian Research Institute of Brucellosis and Tuberculosis of Animals; Vlasenko Vasily Ser-geevich, Dr. Biol. Sci., Ass. Prof., All-Russian Research Institute of Brucellosis and Tuberculosis of Animals, vvs-76@list.ru; Nevorotova Galina Pe-trovna, Junior Researcher, All-Russian Research Institute of Brucellosis and Tuberculosis of Animals.
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ СЫВОРОТКИ КРОВИ И ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ОРГАНАХ МОРСКИХ СВИНОК ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ПОТРЕБЛЕНИИ МОЛОКА С ДОБАВЛЕНИЕМ МУРАВЬИНОЙ КИСЛОТЫ
Применение органических кислот в животноводстве эффективно и экономично. Они повышают санитарное качество кормов, улучшают пищеварение животных, стабилизируют микрофлору желудочно-кишечного тракта. В настоящее время внедряется технология сквашивания молока для выпойки телят раствором муравьиной кислоты. Однако сведения о профилактической эффективности и безопасности такого молока крайне противоречивы. Цель исследования - установить биохимические показатели крови и патоморфологические изменения во внутренних органах у морских свинок при длительном выпаивании молока с добавлением муравьиной кислоты. Исследование проведено на 20 морских свинках - самцах в возрасте 6 мес. с массой тела 580-660 г, содержащихся в условиях вивария на стандартном рационе. Все животные были разделены на 2 группы (контрольную и опытную) по 10 особей в каждой. В эксперименте использовали молоко, которое сквашивали 8,5%-ным раствором муравьиной кислоты из расчета 20 мл на 1 л при комнатной температуре и многократно перемешивали в течение 6-12 ч. Животным опытной группы молоко с добавлением муравьиной кислоты выпаивали ежедневно в объеме 40-50 мл
©|Герунов В.И., Теущаков Д.С., Горошенко Я.В., 2016
