CC BY
15
УДК 619:611-018:636.97
иммунологическая и морфологическая оценка иммуномодулирующего действия Ким-м2 у животных, инфицированных микобактериями
Е.А. ГУЛЯЕВА1, аспирант
B.C. ВЛАСЕНКО2, доктор биологических наук, зав. лабораторией
В.В. СЕМЧЕНКО1, доктор медицинских наук, профессор
М.А. БАЖИН2, доктор ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник
Н.В. ГОЛЕНКОВА1, кандидат ветеринарных наук, доцент
Е.В. СУЛЬДИН1, студент
Т.С. ДУДОЛАДОВА2, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Н.Н. КОЩЕЕВ2, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
Омский государственный аграрный университет им. П.А. Столыпина, Институтская площадь, 2, Омск, 644008, Россия
2Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных, ул. Лермонтова, 93, Омск, 644001, Россия
E-mail: ivm_omgau_gistology@mail.ru
Резюме. Исследования проводили с целью изучения действия комплексного иммуномодулятора микробного происхождения КИМ-М2 на морских свинок, инфицированных вирулентным штаммом Mycobacterium bovis и атипичным Mycobacterium scrofulaceum. Для постановки опыта было отобрано 30 половозрелых морских свинок самцов, из которых сформировали 6 групп. Пять интактных особей (группа I) служили контролем. Животным II-IV групп (n=5) подкожно вводили M. scrofulaceum в дозе 30 мг, после чего особям III и IV групп соответственно через 14 сут. и 28 сут. подкожно инъецировали КИМ-М2 в дозе 500мкг/мл белка, свинкам V и VI групп (n=5) - вводили вирулентную культуру M. bovis, штамм 14, подкожно в дозе 0,0001 мг/мл, при этом животным VI группы (n=5) за 30 сут. до инъекции подкожно вводили КИМ-М2 в дозе 500 мкг белка. На первом этапе исследований в крови морских свинок всех групп определяли количественное содержание иммунокомпетентныхклеток, на втором оценивали структурно-функциональное состояние печени животных, иммунизированных КИМ-М2, после инфицирования M. bovis и M. scrofulaceum. Введение специфического иммуно-модулятора способствовало формированию более высокого уровня противотуберкулезной защиты, о чем свидетельствовало достоверное (р<0,05) увеличение числа Т-, В-лимфоцитов и лимфоцитов с киллерной активностью у особей III, IV и VI групп. Анализ структурно-функционального состояния печени морских свинок, иммунизированных КИМ-М2, после инфицирования M. bovis и M. scrofulaceum показал, что препарат способствовал снижению тинкториальных, дистрофических идеструктивных из -менений гепатоцитов, уменьшал количество и объем гранулем в печени, усиливал компенсаторно-восстановительные процессы в паренхиме печени.
Ключевые слова: микобактерии, микобактериозы, туберкулез, иммуномодулятор, неспецифические реакции, печень, морфология, биотехнология, метод.
Для цитирования: Иммунологическая и морфологическая оценка иммуномодулирующего действия КИМ-М2 у морских свинок инфицированных микобактериями / Е.А. Гуляева, В.С. Власенко, В.В. Семченко, М.А. Бажин, Н.В. Голенкова, Е.В. Сульдин, Т.С. Дудоладова, Н.Н. Кощеев //Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №4. С. 72-74.
В последние годы для иммунологической защиты человека и животных все шире используют препараты с иммуностимулирующей и иммуномодулирующей активностью [1-3].
Среди специфических иммуномодулирующих средств, применяемых в ветеринарной медицине, перспективны конъюгаты, приготовленные на основе антигенов БЦЖ и синтетических полиэлектролитов, в частности, иммуномодулятор КИМ-М2, обладающие доказанными протективными свойствами [4, 5].
В последние десятилетия отмечается рост инфици-рованности сельскохозяйственных животных атипичными микобактериями, в результате чего развивается временная повышенная чувствительность к туберкулину, которая вызывает неспецифические реакции и затрудняет диагностику туберкулёза [6].
В литературе имеются сведения об успешном применении иммунотерапии, в частности, об эффективности назначения в стадии ремиссии хронических аллергических заболеваний возрастающих доз иммуностимулирующих антигенных препаратов микробного происхождения [7]. В связи с этим проблема регуляции и восстановления защитных функций организма при заболеваниях и воздействии дестабилизирующих факторов окружающей среды на основе специфических иммуномодулирующих средств одна из наиболее актуальных в ветеринарной медицине [8].
При различных формах и стадиях туберкулеза происходит вовлечение в патологический процесс печени. Поэтому её исследование при инфицировании микобактериями туберкулеза на фоне действия различных иммуномодуляторов имеет большое теоретическое и практическое значение [9].
Цель наших исследований - экспериментальное изучение действия комплексного иммуномодулятора микробного происхождения (КИМ-М2) на морских свинках, инфицированных вирулентным штаммом M. bovis и атипичным M. scrofulaceum.
Для ее достижения решали следующие задачи: определить состояние иммунной системы морских свинок, иммунизированных КИМ-М2 после экспериментального заражения вирулентной культурой мико-бактерий и атипичными микобактериями; установить структурно-функциональное состояние печени морских свинок, иммунизированных КИМ-М2, после инфицирования M. bovis и M. scrofulaceum.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили на морских свинках в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» [10].
Для экспериментального заражения морских свинок использовали вирулентную культуру M. bovis штамм 14 (ВНИИБТЖ, г. Омск) и M. scrofulaceum.
Исследования выполнены на 30 половозрелых морских свинках самцах, содержавшихся в условиях специализированного вивария для проведения опытов с инфекционным агентом. Пять интактных морских свинок (группа I) служили контролем. Животным II группы (n=5) подкожно вводили M. scrofulaceum в дозе 30 мг, III группы (n=5) - подкожно вводили M. scrofulaceum в дозе 30 мг, через 14 сут. КИМ-М2 в дозе 500 мкг/мл белка, IV группы (n=5) - подкожно вводили M. scrofulaceum в дозе 30 мг, через 28 сут. КИМ-М2 в дозе 500 мкг/мл белка, V группы (n=5) - вводили вирулентную культуру M. bovis, штамм 14, подкожно в дозе 0,0001 мг/ мл, VI группы (n=5) - подкожно вводили КИМ-М2 в дозе 0,5
мл (500 мкг белка) и через 30 сут. вирулентную культуру M. bovis, штамм 14, в дозе 0,0001 мг/мл.
Иммуномодулятор КИМ-М2 изготовлен на основе антигенного комплекса вакцинного штамма БЦЖ, инкубированного с раствором формальдегида и конъюгированного с поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем [4].
У экспериментальных животных всех шести групп через 75 сут. в венозной крови определяли содержание нейтрофилов, Т-лимфоцитов (методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, Е-рок), лимфоцитов-киллеров (методом непрямого глобу-линового розеткообразования с эритроцитами быка, ЕА-рок), антиген-реактивных лимфоцитов (методом туберкулинового розеткообразования с эритроцитами быка) и В-лимфоцитов (методом комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка) [11].
У всех морских свинок через 75 сут. со дня начала эксперимента, после эвтаназии, забирали аутоптаты печени для гистологического исследования. Бритвенным лезвием вырезали пластинки печени через всю дольку от её ворот до тонкого периферического края толщиной 4-5 мм. Кусочки печени помещали в 10%-ный раствор нейтрального формалина на фосфатном буфере фирмы ООО «БиоВитрум» (Санкт-Петербург) с последующей трехкратной сменой фиксатора в течение суток и заливкой в парафин. На ротационном микротоме LaboCut 4055 с помощью одноразовых микротомных лезвий А35 готовили срезы толщиной 34 мкм, помещали их на стандартные предметные стекла, окрашивали гематоксилином и эозином, заключали в синтетическую среду BioMount и покрывали стандартными покровными стеклами. Полученные препараты фотографировали на микроскопе Axioskop 40 с встроенным IV-адаптером и цифровой видеокамерой Carl AxioCam IC с 3, окуляр W-PI 10x/23, объективы: A-Plan 20x/0,45; A-Plan 40x/0,65; A-Plan 100x/1,25 oil.
На гистологических препаратах проводили морфологическую оценку состояния паренхимы (эпителиальный компонент) печени с определением площади зоны повреждения [12]. Кроме того, изучали изменения тинкто-риальных свойств печеночной дольки (от центральной вены до портальной триады). С этой целью использовали программу для обработки и анализа изображений ImageJ 1.46. [13]. Измеряли значения яркости и оптической плотности полей зрения, сравнения проводили по гистограммам. Рассчитывали величины вариабельности яркости окраски ткани печени в системе RGB про секторам [14].
Системный статистический анализ осуществляли при помощи программ Sta-tistica for Windows (Версия 6.0, StatSoft, Inc.) [15]. Различия между независимыми выборками определяли с использованием двухвыбороч-ного критерия Манна-Уитни и дисперсионного анализа ANOVA Краскела-Уоллиса.
Для категориальных переменных применяли критерий-X2, точный критерий Фишера. Нулевую гипотезу отвергали, а альтернативную принимали при р<0,05.
Результаты и обсуждение. Анализ количества иммунокомпетентных клеток в периферической крови животных показал, что у морских свинок всех опытных групп, по сравнению с контрольной группой, наблюдается увеличение концентрации нейтрофилов, особенно можно выделить V (соответственно 4,48±0,30, 0,96±0,13 тыс./мкл; р<0,001) и VI группу (соответственно 3,70±1,05, 0,96±0,13 тыс./мкл; р<0,001). Также изменению подвержено содержание Т-, В-лимфоцитов и лимфоцитов-киллеров. При этом у морских свинок II и V групп их число имело тенденцию к снижению, тогда как у особей III, IV и VI групп величина этого показателя, напротив, с высокой степенью (р<0,05) достоверности увеличивалась, что отражало более высокую противотуберкулезную устойчивость, индуцированную введением иммуномодулятора.
Помимо этого отмечено снижение концентрации в крови антиген-реактивных лимфоцитов у животных всех опытных групп, по сравнению с контрольными, особенно в VI группе (0,74±0,12,1,59±0,22 тыс./мкл; р<0,001).
Печень особей контрольной группы имела типичное для здоровых животных строение с небольшими дистрофическими изменениями в виде мелких вакуолей в периферической части цитоплазмы отдельных гепато-цитов (см. рисунок, а). У животных II группы чаще всего в периферической зоне печеночных долек отмечали умеренно выраженные дистрофические и деструктивные изменения гепатоцитов (см. рисунок, б) на фоне умеренных внутридольковых сосудистых нарушений. В печени морских свинок III группы и в меньшей степени животных IV группы, в сравнении с особями II группы, выявляли от легких до умеренных диффузно-очаговые дистрофические и деструктивные изменения гепатоцитов с большей частотой в периферической зоне печеночных долек.
Рисунок. Морфологические изменения паренхимы печени морских свинок при инфицировании M. scrofulaceum, M. bovis и введении КИМ-2М. Окраска гематоксилином и эозином, х 1000. а) контроль (группа I); б) минимально выраженные дистрофические изменения (группа II); в) резко выраженные деструктивные изменения (группа V). г) умеренно выраженные деструктивные изменения (группа VI).
У свинок V группы наблюдали наиболее выраженные дистрофические и деструктивные изменения паренхимы печени, которые проявлялись распространенными зонами дистрофических и некробиотических изменений гепатоцитов и гранулемами на фоне внутридольковых сосудистых расстройств, включая и гемостазиологические (см. рисунок, в).
В печени особей VI группы, в сравнении с V группой, выраженность деструктивных процессов снижалась (см. рисунок, г). При этом число гепатоцитов в состоянии вакуольной дистрофии существенно преобладало над количеством гепатоцитов в состоянии некроза, резко уменьшалось число и размер гранулем, а также выраженность сосудистых расстройств. В этой группе была выше интенсивность репаративных процессов и структурных проявлений элиминации микобактерий. Кроме того, увеличивалось количество двуядерных гепатоцитов и их объем, что свидетельствовало об усилении санации поврежденной паренхимы печени и внутриклеточной репаративной регенерации гепатоцитов.
Таким образом, сравнительный анализ морфологического состояния печени животных I (интактные), V (без введения иммуномодулятора) и VI группы (с предвари-
тельным введением иммуномодулятора) показал наличие существенных морфологических и тинкториальных различий структурно-функциональных компонентов печени при инфицировании микобактериями. Предварительное (до инфицирования микобактериями) введение комплексного иммуномодулятора микробного происхождения приводило к снижению степени выраженности деструктивных изменений в печени экспериментальных животных, увеличению компенсаторно-восстановительных процессов, что свидетельствует о выраженном гепатопротекторном действии препарата и служит основанием для рекомендации клинической апробации КИМ-М2 в ветеринарной практике.
выводы. Комплексный иммуномодулятор микробного происхождения (КИМ-М2) снижает тинкториальные, дистрофические и деструктивные изменения гепатоцитов, уменьшает количество и объем гранулем в печени, усиливает компенсаторно-восстановительные процессы в паренхиме печени, вызывает увеличение численности лимфоцитов-киллеров, Т- и В-лимфоцитов в периферической крови животных, повышает устойчивость морских свинок к инфицированию атипичными (M. scrofulaceum) и патогенными микобактериями (М. bovis).
Литература.
1. ШтинЛ.Е. Изучение патоморфологии туберкулезного процесса и культурально-биохимических свойств микобактерий // Методология мероприятий по профилактике и ликвидации болезней сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. Новосибирск: Изд-во РПО СО РАСХН, 1995. С. 307-309.
2. Федоров Ю. Н. Иммунокоррекция: применение и механизм действия иммуномодулирующих препаратов // Ветеринария. 2005. № 2. С. 3-6.
3. Петрянкин Ф.П. Влияние иммуностимуляторов на неспецифическую резистентность и иммуногенез животных на фоне иммунизации // Ветеринарный врач. 2008. № 3. С. 22-25.
4. Пат. 2478399 РФ. Способ получения специфического иммуномодулятора/Бажин М.А., Новиков А.Н., Власенко В.С., Не-воротова Г.П., Петров С.Ю., Шулико Е.М., Назарова В.А. - № 2011124695; заявл. 16.06.11; опубл. 10.04.13, Бюл. № 10. 12 с.
5. Власенко В.С., шулико Е.М., Бажин М.А. Способ получения специфического иммуномодулятора // Интеллектуальная собственность/ Промышленная собственность. 2010. № 5. С. 67.
6. Найманов А.Х. Дифференциация аллергических реакций на туберкулин//Ветеринария. 2002. № 3. С. 10-12.
7. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность (выявление и лечение). М: Медицинская книга, Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2003. 443 с.
8. Вакцинопрофилактика в комплексе противотуберкулезных мероприятий/М.А. Бажин, Ю.И. Смолянинов, В.Г. Ощепков, Н.Н. Кощеев, А.Н. Новиков, В.С. Власенко, А.С. Куварин//Ветеринарная патология. 2004. № 1-2. С. 139-142.
9. Шкурупий В.А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терания. М.: Изд-во РАМН, 2007. 536 с.
10. Правила работы с использованием экспериментальных животных. Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977№ 755.
11. Дискретно-динамический анализ в оценке иммунитета: методические рекомендации /М.А. Бажин, В.С. Власенко, А.Н. Новиков, Ю.И. Пацула. Омск: СО РАСХН. ВНИИБТЖ, 2005. - 24 с.
12. Автандилов Г.Г. Введение в количественную патологическую морфологию. М.: Медицина, 1980. 216 с.
13. Методологические аспекты изучения гистогенеза уживотныхи человека/В.В. Семченко, С.С. Степанов, Л.П. Тельцов, Г.А. Хонин, Н.Н. Боголепов, А.Ю. Лескова//Морфологические ведомости. 2013. № 4. С. 69-75.
14. Ferreira T.A., Rasband W. // The Image J (User Guide Version 1.43). 2010. 178 p.
15. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиа Сфера, 2006. 305 с.
immunological and morphological estimation of immunomodulating action of kim-m2 in guinea pigs infected with mycobacteria
E.A. Gulyaeva1, V.S. Vlasenko2, V.V. Semchenko1, M.A. Bazhin2, N.V. Golenkova1, E.V. Suldin1, T.S. Dudoladova2, N.N. Koscheev2
'Omsk State Agrarian University P.A. Stolypin's name, Institutskaya square, 2, Omsk, 644008, Russia 2All-Russian Research Institute of brucellosis and tuberculosis of animals, Lermontov st., 93, Omsk, 644001, Russia Summary. The investigations were conducted to study the effects of complex microbial immunomodulator KIM-M2 on guinea pigs infected with a virulent strain of Mycobacterium bovis and atypical Mycobacterium scrofulaceum. For the experiment we selected 30 adult male guinea pigs and formed 6 groups from them. Five intact guinea pigs (group I) served as the control. We injected subcutaneously M. scrofulaceum at the dose of 30 mg to the animals of group 11 - IV (n = 5), after that we injected KIM-M2 subcutaneously at the dose of 500 microgram/ml of protein to the animals from III and IV groups in 14 and 28 days, correspondingly. Guinea pigs from V and VI groups (n = 5) were injected with virulent culture of M. bovis strain 14 subcutaneously at the dose of 0.0001 mg/ml, in addition, animals from VI group (n = 5) were administered with KIM-M2 subcutaneously at the dose of 0.5 ml (500 micrograms of protein) 30 days before it. At the first stage of the investigation we quantified the content of immune cells in the blood of guinea pigs from all groups; on the second step we estimated the structural and functional state of the liver of guinea pigs immunized with KIM-M2 after infection with M. bovis and M. scrofulaceum. The introduction of specific immunomodulator contributed to the formation of higher level of antituberculous protection, which was evidenced by the significant increase (p < 0.05) in the number of T-, B-lymphocytes and lymphocytes with killer activity in individuals from III, IV and VI groups. The analysis of the structural and functional state of the liver of guinea pigs immunized KIM-M2 after infection with M. bovis and M. scrofulaceum, carried out at the next stage of the investigation, showed that the drug contributed to the reduction of the tinctorial, dystrophic and destructive changes of hepatocytes, reduced the number and volume of granulomas in liver, enhanced the compensatory-regenerative processes in the parenchyma of liver. Keywords: mycobacteria, mycobacterioses, tuberculosis, immunomodulator, nonspecific reactions, liver, morphology, biotechnology, method. Author Details: E.A. Gulyaeva, Post-graduate Student (e-mail: ivm_omgau_gistology@mail.ru); V.S. Vlasenko, Dr. Sc. (Biol.), Head of Laboratory; V.V. Semchenko, Dr. Sc. (Med.), Prof.; M.A. Bazhin, Dr. Sc. (Vet.), Leading Researcher; N.V. Golenkova, Cand. Sc. (Vet.), Assoc. Prof.; E.V. Suldin, Student; T.S. Dudoladova, Cand. Sc. (Biol.), Senior Researcher; N.N. Koscheev, Cand. Sc. (Vet.), Senior Researcher. For citation: Gulyaeva E.A., Vlasenko V.S., Semchenko V.V., Bazhin M.A., Golenkova N.V., Suldin E.V., Dudoladova T.S., Koscheev N.N. Immunological and morphological estimation of immunomodulating action of KIM-M2 in guinea pigs infected with mycobacteria. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2015. T.29. №4. pp. 72-74 (In Russ)
