CC BY
92
Том 149, кн. 2
Естественные науки
2007
УДК 577.151
ОПТИМИЗАЦИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ BACILLUS INTERMEDIUS 3-19, СЕКРЕТИРУЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ В ПОЗДНЕЙ СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЕ РОСТА
Е.А. Соколова, Т.Р. Шамсутдинов, Н.П. Балабан Аннотация
Из культуральной жидкости Bacillus intermedius 3-19 ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе и колонке Mono S в системе FPLC выделены сериновые про-теиназы, секретируемые в поздней стационарной фазе роста культуры. По действию на специфические хромогенные субстраты эти ферменты классифицированы как глутами-лэндопептидаза и две субтилизиноподобные протеиназы. В результате подбора условий выделения и очистки протеиназ получены препараты глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы со степенью очистки 1400 и 234 и выходом 22.5 и 16.9% соответственно. Степень очистки и выход второй субтилизиноподобной протеиназы существенно не изменились.
Грамположительные бактерии в стационарной фазе роста секретируют сериновые протеиназы, играющие определенную роль в адаптационных процессах. В поздней стационарной фазе роста бациллы секретируют сериновые протеиназы, относящиеся к семейству субтилизинов (субтилизиноподобные протеиназы) и к семейству химотрипсинов (глутамилэндопептидазы). Внеклеточные глутамилэндопептидазы в настоящее время выделены из стафилококков, актиномицетов, стрептомицетов и бацилл [1, 2] и образуют особое подсемейство ферментов, гидролизующих пептидные связи по строго определенным аминокислотным остаткам - глутаминовой и аспарагиновой кислотам. Такая строгая субстратная специфичность представляет особый интерес для молекулярной биологии, так как делает эти ферменты удобным инструментом при изучении аминокислотной последовательности белков и локализации активных центров ферментов [3]. Способность микробных субтилизиноподобных протеиназ осуществлять селективный протеолиз таких белков крови человека, как фибрин, плазминоген, протеин С, определяет перспективность использования этих ферментов в медицинской практике, а именно, для коррекции гемостаза человека, при профилактике, диагностике и лечении атеросклероза и его последствий.
Ранее нами были обнаружены сериновые протеиназы, секретируемые в фазе замедления роста и начале стационарной фазы роста Bacillus intermedius 3-19 и относящиеся к семействам химотрипсина и субтилизина - глутамилэндопеп-тидаза и субтилизиноподобная протеиназа. Они были выделены из культураль-
ной жидкости и получены в гомогенном состоянии, а также изучены их физико-химические, каталитические и энзиматические свойства [4, 5]. Мы обнаружили, что эти бактериальные ферменты синтезируются и секретируются в поздней стационарной фазе роста B. intermedius 3-19. Они были отнесены к «поздним» сериновым протеиназам, а именно, глутамилэндопептидазе 2 с максимальным накоплением активности на 40-й час роста и субтилизиноподобным протеиназам 2 с максимальным накоплением активности на 44-46-й час роста культуры. Индекс 2 введен нами для отличия «поздних» ферментов от хорошо изученных «ранних» белков.
Выделение и очистку «поздних» протеиназ из культуральной жидкости B. intermedius 3-19 проводили по ранее разработанному методу для получения «ранних» ферментов [4, 5]. Сравнительный анализ результатов очистки «ранних» и «поздних» ферментов по разработанному методу выявил большие потери белка на каждой стадии очистки для «поздних» протеиназ по сравнению с «ранними» ферментами. Встал вопрос об оптимизации условий очистки поздних белков.
Целью настоящей работы явилась оптимизация метода получения внеклеточных сериновых протеиназ B. intermedius 3-19 поздней стационарной фазы роста для получения гомогенных препаратов ферментов.
Материалы и методы
Бактериальный штамм. В работе использовали стрептомицин-устойчивый штамм B. intermedius 3-19 из коллекции кафедры микробиологии Казанского государственного университета. Бактерии выращивали на среде, описанной ранее [6]. Культивирование проводили при температуре 30°С на вибростенде при 200 об/мин в течение 46 ч. Соотношение объема среды к объему колбы составляло 1 : 5. Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 1 ч при 4500 g.
Реагенты. Для выделения ферментов использовали карбоксиметил (КМ) -целлюлозу («Sigma», США), колонку Mono S HR - 5/5 в системе FPLC («Pharmacia», Швеция).
Протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстратов синтетические хромогенные пептиды Z-Glu-pNA и Z-Ala-Ala-Leu-pNA, которые были синтезированы в лаборатории химического факультета Московского государственного университета по методу Хоумарда [7]. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин.
При определении протеолитической активности глутамилэндопептидазы реакционная смесь состояла из 1 мл раствора субстрата (0.5 мг/мл) Z-Glu-pNa в 0.1 М трис-HCI буфере рН 8.5 и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при температуре 37°С от 2 до 60 мин до появления соломенно-желтого окрашивания, затем реакцию останавливали добавлением 0.5 мл 1 М Na-ацетатного буфера, рН 4.7. Контрольную пробу, содержащую 1 мл субстрата и 0.5 мл 1 М Na-ацетатного буфера, рН 4.7, инкубировали при температуре 37°С одновременно с опытной пробой. По окончании инкубации в контрольную пробу добавляли 50 мкл фермента и измеряли на спектрофотометре СФ-26 оптическую плотность опытной пробы против контрольной при 410 нм в кювете толщиной 0.5 см.
Активность субтилизиноподобных протеиназ определяли с помощью синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa. Реакционная смесь состояла из 500 мкл субстрата (0.5 мг/мл) Z-Ala-Ala-Leu-pNa, растворенного в диметилформамиде, 2 мл 0.05 М трис-HCI буфера, рН 8.5, и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при температуре 37°С от 2 до 60 мин до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 20%-ной уксусной кислоты. В контрольную пробу, содержащую 500 мкл субстрата и 200 мкл уксусной кислоты, после инкубации при температуре 37°С одновременно с опытной пробой добавляли 50 мкл фермента, и измеряли на спектрофотометре СФ-26 оптическую плотность опытной пробы против контрольной при 410 нм в кювете толщиной 1 см.
За единицу активности в обоих случаях принимали количество фермента (Е), которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Активность рассчитывали по формуле:
ПА = (D • P • K)/(B • T),
где ПА - активность, мкМ/мин, на 1 мл ферментного раствора; D - поглощение раствора при 410 нм; P - расчет на 1 мл раствора фермента; K = 0.37 - коэффициент, учитывающий молярную экстинкцию субстрата; B - объём пробы фермента в реакционной смеси; T - время инкубации, мин.
Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует поглощению А280, равному единице, в кювете толщиной 1 см.
Удельную активность ферментов определяли как отношение величины протеолитической активности к единице белка и выражали в ед/мг белка.
Выделение ферментов проводили из 2 л культуральной жидкости с использованием ионообменной хроматографии в объеме на КМ-целлюлозе, уравновешенной 15 мМ Na-ацетатным буфером рН 6.3 + 0.5 мМ CaCl2 c последующим переносом ионообменника с сорбированным белком в колонку (2.2 х 30 см). Десорбцию ферментов проводили элюирующим буфером 200 мМ Na-ацетата рН 6.3 + 0.5 мМ CaCl2. Затем элюат разводили водой в 12 раз и проводили хроматографию в системе FPLC на колонке Mono S, уравновешенной 15 мМ Na-ацетатным буфером рН 6.3 + 0.5 мМ CaCl2. Элюировали ферменты тем же буфером, создавая линейный градиент NaCl (0.0-0.5 М).
Полученные фракции глутамилэндопептидазы 2 и субтилизинов 2 разводили в 10-12 раз водой и проводили рехроматографию на колонке Mono S, уравновешенной 15 мМ Na-ацетатным буфером рН 6.3. Использовали два варианта элюирующего буфера:
Вариант I: 15 мМ Na-ацетатный буфер рН 6.3 содержал 0.5 мМ CaCl2 с линейным градиентом NaCl (0.0-0.5 М);
Вариант II: 15 мМ Na-ацетатный буфер рН 6.3 и 5 мМ CaCl2, линейный градиент был тот же самый.
Фракции ферментов, активные по гидролизу субстратов Z-Glu-pNA и Z-Ala-Ala-Leu-pNA, обессоливали на сефадексе G-25 в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3 + 0.5 мМ CaCl2 и изучали свойства полученых белков.
Степень чистоты препаратов определяли электрофоретически в 12.5% ПААГ в присутствии 0.1% DS-Na по методу Лаэммли [8].
Влияние ионов кальция на активность ферментов. При исследовании влияния ионов кальция на активность гомогенных препаратов белка в опытные пробирки добавляли раствор CaCl2 до конечной концентрации от 1 до 20 мМ и проводили определение активности фермента по вышеописанным методикам.
Результаты и их обсуждение
При изучении свойств и характеристик протеолитических ферментов необходимо разработать эффективный метод для получения гомогенных белковых препаратов.
Для увеличения выхода ферментов в процессе очистки из культуральной жидкости мы предварительно исследовали влияние соотношения белок/сорбент на полноту десорбции фермента с КМ-целлюлозы. Эти эксперименты проводили для глутамилэндопептидазы, определяя активность, степень очистки и выход фермента. Из табл. 1 видно, что соотношение белок/сорбент, равное 470 мг белка на 1 мл КМ-целлюлозы, является наилучшим (61% десорбции), увеличение нагрузки на 1 мл КМ-целлюлозы в 1.5 раза приводит к снижению выхода фермента почти в 2 раза, а увеличение нагрузки в 2 раза снижает выход фермента в 2.5 раза.
Степень очистки фермента изменялась незначительно. В дальнейшей работе на первой стадии очистки мы придерживались полученного соотношения белок/сорбент, равного 450-550 мг белка на 1 мл КМ-целлюлозы, для трех се-риновых протеиназ поздней стационарной фазы роста B. intermedius 3-19. В табл. 2 и 3 показаны результаты двухстадийной, а в табл. 4 - результаты трехстадийной очистки сериновых протеиназ поздней стационарной фазы роста B. intermedius 3-19. Благодаря подобранному соотношению белок/сорбент (КМ-целлюлоза) нам удалось на первой стадии очистки получить фермента приблизительно в два раза больше, чем это было показано ранее [9, 10]. Вторая стадия очистки на колонке Mono S также позволила получить на 7-10% белка больше, чем это показано в предыдущих разработках [9, 10].
На рис. 1 представлен хроматографический профиль белков после очистки на колонке Mono S. Получены три белковые фракции, которые по действию на специфические субстраты идентифицированы как глутамилэндопептидаза (фракция 2) и субтилизиноподобные протеиназы (фракции 1 и 3).
Как видно из рис. 1, полученные белковые фракции являются негомогенными, поэтому проводили рехроматографию белков с использованием двух вариантов элюирующего буфера с разным содержанием ионов кальция, как описано в п. «Материалы и методы». Для этого фракции глутамилэндопептидазы 2 и субтилизиноподобной протеиназы 2 после стадии очистки на колонке Mono S делили на две равные части (для глутамилэндопептидазы - по 11 мл, для суб-тилизиноподобной протеиназы - по 15 мл), проводили рехроматографию и рассчитывали удельную активность, степень очистки и выход ферментов.
В табл. 4- 6 представлены результаты этих исследований.
Табл. 1
Влияние соотношения белок/сорбент на десорбцию глутамилэндопептидазы 2 с КМ-целлюлозы
№ Количество сорбента (мл) Концентрация белка (мг/мл) Соотношение белок/сорбент (мг/мл) Концентрация белка после очистки (мг/мл) Выход (%)
1 29 16.4 470 3.0 61
2 20 16.4 670 1.2 32
3 13 16.4 1013 0.75 23
Табл. 2
Хроматографическая очистка глутамилэндопептидазы 2 B. intermedins 3-19
Стадии V, Концен- Общее Активность Степень Вы-
очистки (мл) трация белка (мг/мл) количество белка (мг) Общая, (ед/мл-V) Удельная (ед/мг) очистки ход (%)
Культу- 2000 15.4 30800 23.6 0.00077 1 100
ральная жидкость
КМ-цел- 40 3.0 118.8 15.3 0.129 167.5 64.8
люлоза
Mono S 22 0.3 6.7 6.7 0.93 1208 26.5
Табл. 3 Хроматографическая очистка субтилизиноподобной протеиназы 2 B. intermedins 3-19
Стадии V, Концен- Общее Активность Степень Вы-
очистки (мл) трация белка (мг/мл) количество белка (мг) Общая, (ед/мл-V) Удельная (ед/мг) очистки ход (%)
Культу- 2000 15.4 30800 4720 0.153 1 100
ральная жидкость
КМ-цел- 40 3.0 118.8 2280 19.2 125.5 48.3
люлоза
Mono S 30 1.7 50.2 1185 23.6 154.2 25.1
Табл. 4
Хроматографическая очистка субтилизиноподобной протеиназы пика 1 B. intermedins 3-19
Стадии V, Концен- Общее Активность Степень Вы-
очистки (мл) трация количе- Общая, Удельная очистки ход
белка (мг/мл) ство белка (мг) (ед/мл-V) (ед/мг) (%)
Культу- 2000 15.2 30400 4720 0.153 1 100
ральная
жидкость
КМ-цел- 40 3.0 118.8 2280 19.2 125.5 48.3
люлоза
Mono S 13 0.3 3.45 0.600 0.18 1.1 0.012
Рехрома- 1.8 0.3 0.58 0.234 0.4 2.5 0.005
тография
Рис. 1. Хроматография протеиназ B. intermedius поздней стадии роста культуры на колонке Mono S: I - А280, II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 0.5 мМ CaCl2; 1, 3 - фракции субтилизиноподобных сериновых протеиназ, 2 - фракция глутамилэндопептидазы
Табл. 5
Рехроматография глутамилэндопептидазы 2 B. intermedius 3-19
Элюирующий буфер Удельная активность (ед/мг) Степень очистки Выход (%)
Вариант I 1.026 1315 18
Вариант II 1.094 1400 22.5
Табл. 6
Рехроматография субтилизиноподобной протеиназы 2 B. intermedius 3-19
Элюирующий буфер Удельная активность (ед/мг) Степень очистки Выход (%)
Вариант I 34.7 214 9.1
Вариант II 38 234 16.9
Рехроматографию субтилизина первого пика, полученного после хроматографии на БРЬС, проводили также с использованием двух вариантов элюи-рующего буфера. Однако ни степень очистки этого фермента, ни его выход существенно не изменились. Поэтому в табл. 4. представлены результаты очистки этой фракции с использованием элюирующего буфера варианта I. При использовании элюирующего буфера с 5 мМ СаС12 выход глутамилэндопептидазы увеличивается в 1.3 раза, субтилизиноподобной протеиназы - в 1.8 раза. По-
<
0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0
Рис. 2. Рехроматография субтилизиноподобной протеиназы (фракция 1, рис. 1) B. in-termedius на колонке Mono S: I - A280, (а) II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 0.5 мМ CaCl2, (б) II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 5 мМ CaCl2
0.6
0.4
0.3
0.1
а)
0.3
6 8 10 12
14 мл
Рис. 3. Рехроматография глутамилэндопептидазы 2 B. intermedius на колонке Mono S: I - A280, а) II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 0.5 мМ CaCl2, б) II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 5 мМ CaCl2
0.7
0.5
0.2
0.1
0.2
II
0
0
4
Рис. 4. Рехроматография субтилизиноподобной протеиназы 2 (фракцияЗ, рис. 1). I -A280, а) II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 0.5 мМ CaCl2, б) II - градиент NaCl (0-0.5 M) в 15 мМ Na-ацетатном буфере рН 6.3, содержащем 5 мМ CaCl2
1 2 3 4
Рис. 5. Электрофорез внеклеточных щелочных протеиназ поздней стационарной фазы роста Bacillus intermedius в ПААГ с DS-Na: 1 - субтилизин (фракция 3), 2 - глутами-лэндопептидаза, 3 - субтилизин (фракция 1), 4 - маркеры: бычий сывороточный альбумин (67 кДа), овальбумин (43 кДа), карбоксиангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20.1 кДа), лизоцим (14.4 кДа)
о4
200 п
150 -
100
50 ^
а)
10
15
20
Концентрация ионов Са2
120
о я и я н
и <
80
40
10
15
20
Концентрация ионов Са +
Рис. 6. Влияние ионов Са 2+ на активность протеиназ B intermedius 3-19 (х < с), где с -среднеквадратичное отклонение от среднего арифметического: а) глутамилэндопепти-даза, б) субтилизиноподобная протеиназа
сле каждой стадии очистки ферменты становятся не только более чистыми, но и менее стабильными. Добавление в элюирующий буфер ионов кальция (5 мМ против 0.5 мМ) приводит к стабилизации молекулы белка, что, в свою очередь, ведет к увеличению активности препарата. Удельная активность и степень очистки увеличиваются незначительно, что свидетельствует о получении гомогенных препаратов белков при использовании любого варианта элюирующего буфера.
Из рис. 2-4 видно, что рехроматография позволила получить хроматогра-фически гомогенные белки.
С помощью DS-Na-электрофореза подтверждена гомогенность полученных ферментов (рис. 5).
Ранее было показано, что ионы кальция способны стабилизировать структуру молекул сериновых протеиназ, предохранять от тепловой денатурации и протеолитической деградации. Так, при анализе третичных структур некоторых известных субтилизинов были обнаружены три Ca-связывающих сайта, причем два из них обладали высоким сродством к ионам Ca2+, а третий сайт слабо связывает ионы кальция. Подобное присутствие кальция в структуре может быть связано с особенностями функционирования ферментов. Субтилизины BPN', Карлсберг и протеиназа К проявляют каталитическую активность лишь вне клетки, где концентрация кальция существенно выше, чем внутри [11].
Исследовали влияние ионов кальция на активность ферментов поздней стационарной фазы роста B. intermedius 3-19. Внесение в реакционную смесь 520 мМ ионов кальция достоверно увеличивает активность глутамилэндопепти-
0
0
5
0
0
5
мМ ионов кальция достоверно увеличивает активность глутамилэндопептидазы и субтилизиноподобной протеиназы (рис. 6). Ранее было установлено, что активность глутамилэндопептидазы поздней логарифмической фазы роста B. intermedins 3-19 увеличивается в присутствии 5-25 мМ ионов кальция в два раза [5], субтилизиноподобной протеиназы - на 20% [4]. Похожие результаты были получены для глутамилэндопептидазы Bacillus licheniformis, когда активность фермента увеличивалась на 80% при увеличении концентрации ионов кальция от 4 до 30 мкМ. Активность протеиназы Bacillus mesentericus 64 увеличивалась на 15-20% под действием ионов Mg2+ и Ca2+ вследствие стабилизации молекулы белка [11].
Таким образом, в результате проведенных исследований подобраны условия очистки внеклеточных сериновых протеиназ B. intermedins, позволяющие получить ферменты с более высоким выходом на каждой стадии очистки. Целесообразно добавлять в элюирующий буфер ионы кальция в конечной концентрации 5 мМ при хроматографии в системе FPLC, так как при этом увеличивается активность глутамилэндопептидазы в 1.3 раза, субтилизиноподобной протеиназы - в 1.8 раза.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект№ 05-04-48182а).
Summary
E.A. Sokolova, T.R. Shamsutdinov, N.P. Balaban. The optimization of the Bacillus intermedins 3-19 extracellular proteinases isolation.
Serine proteinases from Bacillus intermedius 3-19, secreted at the late stationary phase of growth, were isolated by ion-exchange chromatography on the Km-cellulose followed by FPLC on Mono S column. The enzymes were identified as glutamyl endopeptidase and two subtilisin-like serine proteinases using synthetic chromogenous substrates. The isolation was resulted in glutamyl endopeptidase and subtilisin-like serine proteinase fractions with the purity degree of 1400 and 234 and yield of 22.5% and 16.9%, respectively, as a result of the study of enzyme isolation conditions. There were not significant differences in values of purity degree and yield of the second subtilisin-like serine proteinase.
Литература
1. Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М. и др. Glu, Asp - специфичная про-теиназа актиномицетов // Биохимия. - 1987. - Т. 52. - С. 414-422.
2. Хайдарова Н.В., Руденская Г.Н., Ревина Л.П. и др. Glu, Asp-специфичная протеина-за из Streptomyces thermovulgaris // Биохимия. - 1989. - Т. 54. - С. 46-52
3. Габдрахманова Л.А., Балабан Н.П., Шарпова М.Р. и др. Оптимизация среды культивирования для продукции глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 3-19 // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 3. - С. 323-329.
4. Ицкович Е.Л., Балабан Н.П., Марданова А.М. и др. Энзиматические свойства тиол-зависимой сериновой протеиназы Bacillus intermedius 3-19 // Биохимия. - 1997. -Т. 62, № 1. - С. 49-53.
5. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovich E.L., et al. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3-19 // FEBS Lett. - 1997. - V. 404. - P. 241-244.
6. Балабан Н.П., Шарпова М.Р., Габдрахманова Л.А. и др. Синтез и секреция протеи-наз Bacillus intermedius на поздних стадиях спорообразования // Микробиология. -2003. - Т. 72, № 3. - С. 328-343.
7. Houmard J., Drapeau G.R. Staphilococcal protease: a proteolytic enzyme specific for glutamyl bonds // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1972. - V. 69, No 12. - P. 3506-3509.
8. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T 4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.
9. Балабан Н.П., Марданова А.М., Шарпова М.Р. и др. Выделение и характеристика сериновой протеиназы 2 Bacillus intermedius 3-19 // Биохимия. - 2004. - Т. 69. -С. 519-526.
10. Балабан Н.П., Марданова А.М., Шарпова М.Р. и др. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы 2 Bacillus intermedius // Биохимия. - 2003. - Т. 68, № 11. -С. 1514-1521.
11. Тепляков А.В., Куранова И.П., Арутюнян Э.Г. и др. Кристаллическая структура термитазы и стабильность субтилизинов // Биоорг. химия. - 1990. - Т. 16, № 4. -С. 437-447.
Поступила в редакцию 12.07.06
Соколова Евгения Александровна - аспирантка кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
Шамсутдинов Талгат Рахимзянович - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
Нэлли Павловна Балабан - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
