CC BY
71
Том 147, кн. 2
Естественные науки
2005
УДК 579.22:579.852.11:577.218
МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ СИНТЕЗА БАКТЕРИАЛЬНЫХ СУБТИЛАЗ
А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова Аннотация
С использованием базы данных ГенБанка и пакета программ BLAST проведен анализ промоторной области гена aprBi, кодирующего внеклеточную субтилизинопо-добную протеиназу Bacillus intermedins. Регуляторная область гена имеет 91-ную структурную гомологию с соответствующей последовательностью гена субтилизиноподоб-ной протеиназы Bacillis pumilus. Проведен сравнительный анализ области регуляции гена aprBi с генами сериновых протеиназ других представителей рода Bacillus. Идентифицированы потенциальные сайты для взаимодействия с регуляторными белками DegU и SpoOA и изучена закономерность их расположения. Показано, что системы сигнальной трансдукции SpoOA фосфопередачи и DegS-DegU участвуют в позитивной регуляции активности гена aprBi.
Введение
Изменчивость и адаптация - это важнейшие характеристики бактерий рода Bacillus, обладающих способностью выживать и пролифирировать в разнообразных условиях окружающей среды. В природе бактерии постоянно подвергаются воздействию негативных факторов, таких, как тепловой, холодовой или осмотический шок, недостаток питательных веществ и микроэлементов. У микроорганизмов выработались определенные механизмы адаптации к подобным воздействиям. В основе формирования бактериями специфических адаптивных ответов лежит механизм сигнальной трансдукции [1, 2]. Так, при истощении питательных веществ в среде активируется ряд двухкомпонентных систем трансдукции сигнала: регуляторная пара DegS-DegU регулирует синтез ферментов деградации и, вместе с системой ComP-ComA, достижение состояния компетентности [3-5]. PhoP-PhoR пара отвечает на недостаток неорганического фосфата образованием и секрецией ферментов фосфорного обмена [6]. Переход в покоящееся состояние - споры - находится под контролем SpoO-системы фосфопередачи с киназы на SpoOA белок [7]. Результатом активации этих адаптивных механизмов являются синтез в среду пула внеклеточных гидролаз, антибиотиков и, наконец, споруляция.
Бактерии Bacillus intermedius секретируют в среду несколько протеиназ, среди которых доминирует сериновая субтилизиноподобная протеиназа, кодируемая геном aprBi [8]. Продукция фермента происходит в стационарной фазе роста бацилл и достигает максимального уровня на 48 ч роста. Белок выделен и очищен из культуральной жидкости на 24 и 48 ч культивирования, изучены основные свойства обеих белковых фракций, N-концевые последовательности
которых идентичны [9, 10]. Фермент появляется в среде в начале стационарной фазы роста. Максимальный уровень продуктивности фермента обнаружен в поздней стационарной фазе и соответствует стадии созревания эндоспор и их освобождения в среду [11]. Однако до сих пор механизмы регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы B. intermedins остаются неизвестными.
Целью работы являлся анализ регуляторной области гена aprBi с идентификацией в ней сайтов регуляции и установлением механизмов контроля биосинтеза белка на уровне транскрипции.
1. Материалы и методы исследования
Анализ последовательности гена субтилизиноподобной протеиназы B. intermedins проводили с использованием алгоритма BLAST и пакета программ, представленных на сервере NCBI [http://www.ncbi.nlm.nih.gov] [12]. Поиск открытой рамки считывания и инициирующих кодонов проводили с помощью программы ORF Finder [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf]. Потенциальный старт-кодон трансляции определяли с использованием алгоритма SignalP [http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP], который дает возможность определить вероятность функционирования олигопептида в качестве сигнальной последовательности белка [13].
Бактериальные штаммы и плазмиды. Ген субтилизиноподобной протеиназы из B. intermedins клонирован на плазмиде pCS9, сконструированной на основе шатл-вектора pCB22, несущей 6,0-kb фрагмент хромосомы B. intermedins, содержащий ген aprBi и ген устойчивости к эритромицину [14]. В качестве реципиента плазмидной ДНК был использован штамм Bacillus snbtilis AJ73, из хромосомы которого делетированы гены внеклеточных протеиназ, любезно предоставленный для работы проф. Ю. Йомантасом, ГНИИ Генетика. Штамм Bacillus snbtilis 8G5 DegS-DegU (like 8G5; AdegSAdegU; Kmr), дефектный по генам degS и degU двухкомпонентной регуляторной системы трансдукции сигнала DegS-DegU, штамм B. snbtilis 8G5 degU32(Hy) (like 8G5; degU32(Hy); Kmr) с мутацией по гену degU, ведущей к Hy-фенотипу и штамм B. snbtilis 8G5 (trpC2; tyr; his; nic; nra; rib; met; ade; lacks the sipP genes) с полноценными регу-ляторными белками предоставлены доктором Jan Maarten van Dijl, University of Groningen, Holland. Бактериальные штаммы, дефектные по spo-генам, получены из коллекции Basillus Genetic Stock Center (BGSC): B. snbtilis 168 (trpC2), B. snbtilis 9V(spo0A9 trpC2), B. snbtilis JH651 (pheAl spo0H81 trpC2).
Трансформацию клеток B. snbtilis плазмидной ДНК проводили по Гловеру [15]. При использовании deg-мутантов проводили трансформацию протопластов по методу Chang, Cohen [16].
Культивирование клеток B. snbtilis проводили в колбах объемом 100 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1/7 на качалке с интенсивностью качания 200 об./мин. при 30°С. Для культивирования клеток B. snbtilis использовали среду LB [15]. Посевным материалом служила 18-часовая культура (1% объем/объем). Прирост биомассы измеряли нефелометрически.
Определение протеолитической активности проводили по методу, описанному ранее [17]. В качестве субстрата использовали синтетический хромо-генный субстрат Z-Ala-Ala-Leu-pNA. За единицу активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 нМ субстрата за 1 мин. Продуктивность культуры в отношении синтеза протеиназы (удельная активность) определяли как отношение величины протеолитической активности в культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах (у .е.).
Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ SPSS 12.0. Рассчитывали среднеквадратичное отклонение (<г), результаты считали достоверными при и< 10% . При расчете достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая P < 0.5 за достоверный уровень значимости.
2. Результаты и обсуждение
2.1. Анализ нуклеотидной последовательности. Плазмида pCS9 была сконструирована путем лигирования геномной библиотеки штамма B. intermedins 3-19, полученной рестрикцией по Sau I всей хромосомы бактерии, и шатлл-вектора pCB22, рестрицированного по сайту BamH I [14]. Было проведено картирование полученной вставки, рестрикционная карта участка хромосомы B. intermedius 3-19 представлена на рис. 1.
6057 bp
Рис. 1. Рестрикционная карта участка хромосомы B. intermedins 3-19
В 6,06-kb вставке участка хромосомы B. intermedins с помощью программы ORF Finder были идентифицированы две открытые рамки считывания, одна из которых кодирует сериновую протеиназу. Гомологии к второй ОРС, обозначенной как ORF-1, в Банке Генов найдено не было. В анализируемом участке ДНК отсутствует четко выраженная последовательность Shine-Delgarno (сайт связывания с рибосомой - RBS). Проведенный программный анализ последовательности позволил выявить три потенциальных сайта инициации синтеза белка (рис. 2).
Для установления сайта инициации трансляции был использован алгоритм SignalP [13], основанный на статистическом анализе последовательности, следуемой после предполагаемого инициирующего кодона. Эта последовательность должна с максимальной вероятностью функционировать как сигнальный пептид. Результаты анализа представлены в табл. 1.
AAAGGAGG
TAAGAAAAAAG GGA TGTGG A TTG TGCGTG AAAAAGAAAAATGTG ATG ACAAGTT
Рис. 2. Сайт инициации трансляции. Предполагаемые старт-кодоны, идентифицированные с помощью программы ORF Finder, выделены курсивом и взяты в рамочку. Предполагаемая последовательность Shine-Delgarno взята в рамочку. Консенсусная последовательность сайта связывания рибосомы (RBS) указана сверху [18]; жирными указаны совпадающие нуклеотиды
Табл. 1
Вероятности функционирования сигнальных пептидов при синтезе полипептида с различных инициирующих кодонов
Потенциальные старт-кодоны Предсказанная вероятность сигнального пептида, синтезируемого с потенциального старт-кодона
TTG 0.998
GTG 0.964
ATG 0.007
Результаты анализа показали, что с максимальной вероятностью функционально активному сигнальному пептиду будут соответствовать последовательности, синтез которых начинается с TTG или GTG кодонов. Однако в первом случае не выявляется подходящая область для последовательности Shine-Delgarno (AAAGGAGG), которая должна располагаться на расстоянии 7-9 нук-леотидов от старт кодона [18]. На основании этих результатов было сделано предположение, что инициирующим является кодон GTG.
gaatggaaggtccttgattacaacgtggtcagccatttactccatcctcccctttt
accaaaaaataata
taaagaacctgttattgtaacaggttntttttnaatgccaaa
ttttttta
tatcgaaattcgaaatagatgctagacgtttctacctattttaaggct
tttcgggtatcgaatatttgtccgaaaatggatcataagaaaaaaagcacacttcc
tttttaatagataaccgctgaaacagcagaacaaacatattttcccaacgtttcca agtgacttaattccccaattttcgctaggactttcacaaaaattcgggtctactct
taatcaaacgaatcattctta
tatt
tgcctacttcccttaaactgaatatacagaa
Ьада сЬасдаа ЪдаЪЪа^с^даааЪаадаааааадддаЪдЪддаЪЪдЪдсбгёдаа
ааадаааааЪдЪдаЪд
Рис. 3. Промоторная область гена субтилизиноподобной протеиназы В. ШвттвсИш. Сайты связывания с регуляторными белками 8ро0А (взяты в рамку) и DegU (весь сайт связывания подчеркнут, канонические последовательности выделены курсивом). Инициирующий кодон выделен курсивом и подчеркнут
В промоторной области гена арВ нами идентифицированы потенциальные участки для специфического взаимодействия с регуляторными белками DegU (АОАА N11-13 ТТСАО) и 8ро0А (ГОКСОАА) с гомологией 70-80% (рис. 3). Эти участки расположены в виде прямых тандемных повторов на про-
тяжении 460 п.о. Выявленной нами характерной особенностью регуляторной области поздних генов субтилизиноподобных протеиназ является тот факт, что Spo0A-боксы располагаются близко или частично перекрываются с последовательностями для связывания с белком DegU.
Был проведен анализ промоторов генов субтилизиноподобных протеиназ различных видов бацилл thuringiensis, B. pumilus, B. sp., B. licheneformis) на наличие в них Spo0A и DegU боксов (рис. 4).
a) SpoOA боксы b)
субтилиэиноподобная протвиназа B.intermedius
_I_I_I_I_I.......ctg
субтилиэиноподобная протвиназа B.pumllus
-1—1-'—АТС
субтилиэиноподобная протвиназа B.thurlnglensls
-U-J-АТС
термостабильная протвиназа B.sp.
—LI-1-LL-LI—I-1-АТС
протвиназа Carisberg B.llchenlfbrmls
-1-1-LATC
Рис. 4. Схематическое расположение сайтов связывания с регуляторными белками протеиназ различных представителей рода Bacillus
Установлено, что во всех вариантах присутствуют прямые тандемные повторы, состоящие из нескольких потенциальных Spo0A- и DegU- боксов на расстоянии до 150 нуклеотидов от точки начала трансляции. Во всех проанализированных последовательностях промоторов Spo0A- и DegU- сайты связывания перекрываются друг с другом.
По-видимому, эти две регуляторные системы не могут одновременно оказывать влияние на транскрипцию генов протеиназ. Эти системы сигнальной трансдукции участвуют в регуляции экспрессии генов бациллярных внеклеточных протеиназ на различных этапах клеточного цикла. Мы предполагаем, что они активируются, возможно, при участии различных сигма-факторов транскрипции. Так, известно, что транскрипция генов, кодирующих ферменты деградации, в частности леваназы, происходит при участии сигма L фактора [19]. Экспрессия же поздних генов, находящихся под контролем Spo- системы, происходит с участием спороспецифичных сигма Н и сигма Е факторов [19].
Присутствие в промоторе тандемных повторов из сайтов связывания с одним и тем же регуляторным белком, по всей видимости, обеспечивает большую частоту инициации транскрипции в условиях активации соответствующих систем сигнальной трансдукции.
Сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов промоторной области показал 91-процентную гомологию у генов субтилизиноподобных протеиназ B. intermedius и B. pumilus на протяжении 200 п.о. от предполагаемого сайта инициации трансляции, в отличие от гена субтилизина B. subtilis, в области регуляции которого выявлен только небольшой участок длиной 85 п.о. с 61-процентной гомологией с геном aprBi (рис. 5).
Этот участок, в частности, включает регуляторный сайт для взаимодействия со спороспецифичным сигма Е фактором транскрипции. Этот факт может
В. ришИиэ В. хпЪегтееНиэ В. зиЬЪШз
СААТ
ССССБССССАТСТСАТСТСТТТССТТБСССААТСТТСАТСТТАТТТСТТССТСС
В. ришИиэ В. л-пЪегтесНиз В.зиЬЪ1.1±з
ССААССТССТТСАТТАСААССТСБТСАСССАТТТАСТССАТССТССССТТТТТАААСААС СТСТСААТААТТТТТТСАТТСТАТСССТТТТСТСТАААСТТТАТТТТТСАСААТАСТТТТ
В. ршпИиэ В. 1п1егте<1±из В. зиЬЪ111з
СТСТТАТТБТААСАССТТИТТТТТКААТСССААААССААААААТААТАТТТТТТТАТАТС АТСАТСАТС^ТТТСААААААТАТСАССАТААТАТССАТТСТТСТСАСССААССАСАСБСА
В. ришИиэ В. о.пЪеппес1л.из В. зиЬЪИ1з
вАААТТССАААТАвАТССТАСАССТТТСТАССТАТТТТААвССТТТТССвСТАТССААТА ¿еТСАТТТБААСБААТТТТТТССАСАОСААТТТССССССАСТСАССАССАТТТААССТАА
В. ритИиэ В. л.пЪегтес1:1из В. зиЬЪШэ
ТТТСТСССААААТвСАТСАТААСАААААААССАСАСТТССТТТТТААТАСАТААССССТС ААААССАТСАСАТТТСАССАТААТОААСАТТТАСТСАТСТСТАТТТТССТТСТТТТСТСТ
В. ритИиэ В. л_пЪегте<1±из В. БиЫШз
ТТТССААСССАСТТААТТССССТАТТТТТТ АААСАССАСААСАААСАТАТТТТСССААСвТТТССААСТСАСТТААТТССССААТТТТ— АТСААААТ АСТ Т АТ Т Т С САСГ С Т С Т АС ССАААТАСС САСАвАТ йАТ АТ АС С Т АААТАС—
В. ришИиэ В. л.пЪегтес1л.из В. гиЬ^ИБ
СССТАССАСТТССАСАААААТТССССТСТТАСТСТТАТТТСССТАТСТСТАТТАААСТСА ¿¿СТАСбАСТТТСАСАААААТТСБбСТСТ-АСТ
АСАТ ААААТ С АТ С Т САААААААТ ¿¿¿Т С Т - АС ТААААТАТ Т АТ Т С С АТ С Т АТ Т АС ААТАА
В. ришИиэ В. л.1^егтес1л.из В.зиЬЪ111з
АААТАС АСААТААТ С АААС йСАТ САТТ С Т ААТ АСАС Т АС СвАТ йАТ ТАТ Т С Т йАААТ ААй АТАТ АС АСААТААТ С АААС ¿ААТ САТТ С Т Т АТ А(дАС Т АС ¿ААТ ¿АТ ТАТ Т С Т ¿АААТ ААС5 АТТСАСА(дААТАСТС^ТАСТСТТТТААСТААСТСТАСТСТСААТТТТТТТААААССАСАС
В. ришНив В. 1пЪегте<1д.из В.зиЬЪ111з
ААААА-СССАТСТССААГСТСССТСАААААСАААААТСТСАТСАСААСТСТТТТАТТССС ААААААССдСАТСТССАТТСТСССГСАААААСАААААТ
ССТАААЙАСГСАСААССААААААТТСТССАТСАССТТСТТСТТТСССТТААССТТААТСТ
Рис. 5. Выравнивание гена субтилизиноподобной протеиназы В. Швгтв&ш относительно таковых В. ритПш и В. зиЫШз. Инициирующие кодоны выделены курсивом
свидетельствовать о сохранении экспрессии генов субтилаз в период споруля-ции. Наряду с этим, в промоторной области гена субтилизина В. тЫШъ идентифицированы последовательности с высокой гомологией для сайтов связывания с сигма А фактором транскрипции, которые не были обнаружены в промоторной области гена аргВг. Различия в строении регуляторной области поздних генов, кодирующих гомологичные по структуре и выполняемым функциям белки, могут свидетельствовать о разнообразии механизмов регуляции их экспрессии в зависимости от сигналов внешней среды.
2.2. Роль двухкомпонентной системы DegS-DegU в регуляции биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы В. ШвгтвМт. Система DegS/DegU отвечает за регуляцию синтеза ферментов деградации и активируется в период постэкспоненциального роста бактерий [20]. Наличие в промоторе гена потен-
циальных сайтов связывания с белком DegU позволило нам предположить участие этой системы в регуляции экспрессии гена aprBi. Известно, что эта регу-ляторная система активируется в ответ на условия солевого стресса, а именно при повышенной концентрации в среде цитрата натрия и калия. Уровень синтеза белков, экспрессия генов которых контролируется DegS/DegU-системой, повышается в стрессовых условиях в несколько раз [20]. По нашим данным в среде, содержащей 0.25 М цитрата натрия, биосинтез субтилизиноподобной про-теиназы B. intermedius рекомбинантным штаммом B. subtilis с плазмидой pCS9 возрастает в 25 раз на 40-й час роста (рис. 6).
Рис. 6. Влияние высоких концентраций солей в среде культивирования на биосинтез субтилизиноподобной протеиназы Б. Шегтеё/ш рекомбинантным штаммом Б. ^ЬЫ^ Л173 pCS9. Контролем служила среда ЬВ без внесения цитрата натрия (100%)
Полученные результаты позволяют предположить, что регуляторная система DegS/DegU участвует в регуляции экспрессии гена aprБi.
В мутантах Б. subtilis 8G5ДDegSДDegU с делецией по регуляторным белкам DegS и DegU, трансформированных плазмидой pCS9 с геном аргБ/, наблюдается снижение продуктивности протеолитической активности на 30% (рис. 7).
Экспрессию клонированного гена изучали также в мутантном штамме Б. subtilis 8G5 DegU32 (Ну), который характеризуется повышенной продукцией фосфорилированной формы регуляторного белка DegU. Это приводит к гиперпродукции тех белков, в регуляции активности генов которых участвует система DegS/DegU [3]. После трансформации этого штамма плазмидой pCS9 с геном аргБ/ его продуктивность в отношении протеиназы резко возрастает по сравнению с контролем (рис. 8).
Полученные данные свидетельствуют в пользу позитивной регуляции экспрессии гена субтилизиноподобной протеиназы Б. intermedius со стороны двух-компонентной системы трансдукции сигнала DegS/DegU.
2.3. Роль 8ро0-системы фосфопереноса в регуляции биосинтеза субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius. Плазмидой pCS9, несущей полный ген аргБ/, были трансформированы штаммы Б. subtilis, мутантные по белкам Spo0, участвующим в инициации спорообразования. Ключевыми белками-регуляторами в этом процессе являются белки Spo0A и Spo0H, представляющие
« 0,14 -,
0,12 -
г 0,1
£ 0,08 -О
Ш 0,06 •
5 0,04 0,02 0
П Контроль ■ ДОедЭ АОеди
* I* 1
■ъ
□ Контроль
А
11
12
24
36
I
48 Час
Рис. 7. Экспрессия гена субтилизинопо-добной протеиназы В. ШегшеЛш ре-комбинантным штаммом В. зиЫШз 8G5ДDegSДDegU с делецией по регуля-торным белкам DegS и DegU
Рис. 8. Влияние мутации DegU32 (Ну) на экспрессию гена субтилизиноподоб-ной протеиназы В. ¡Мвгшв&ш рекомби-нантным штаммом В. йиЪИ^
собой ДНК-связывающий регулятор транскрипции и спороспецифичный сигма-фактор транскрипции соответственно. Результаты экспериментов показали, что экспрессия гена аргВг практически полностью подавляется в штаммах, му-тантных по Spo0A-белку: в штаммах с инактивированным 8ро0А белком, ген которого поврежден точечными мутациями ^ро0А9 [21]), уровень активности субтилизина составляет менее 8% от контроля (рис. 9).
Рис. 9. Экспрессия гена субтилизиноподобной протеиназы В. Шегше&ш в штаммах В. 8иЪШ18, мутантных по компонентам Spo-системы фосфопередачи. В качестве контроля был взяты штамм В. шЬёШ 168
Протеолитическая активность в штаммах, дефектных по гену 8ро0И, также резко снижалась (рис. 9). Однако данные о подавлении продукции субтилизина в штаммах, мутантных по сигма Н фактору транскрипции, неоднозначны. Они свидетельствуют о влиянии такой мутации на экспрессию гена артВ\, и в то же время отсутствие протеолитической активности у этих штаммов может быть следствием
низкого уровня экспрессии SpoOA-белка, транскрипция которого зависит от сигма Н фактора. Таким образом, наши результаты подтверждают наличие позитивной регуляции экспрессии гена aprBi со стороны SpoOA-регулятора транскрипции.
Заключение
Таким образом, полученные данные позволяют говорить о множественной регуляции экспрессии поздних генов бацилл на примере субтилизиноподобных протеиназ. Проведенные исследования показали, что для установления регуля-торных механизмов, участвующих в контроле активности генов, целесообразно проводить теоретические исследования промоторной области гена для идентификации возможных регуляторных элементов. Анализ нуклеотидной последовательности позволяет выявить и экспериментально установить системы регуляции, участвующие в контроле экспрессии исследуемых генов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 05-0448182), Санкт-Петербургского университета (проект № А04-2.12-783), Фонда НИОКР Республики Татарстан (проект № 03-3.10-295/2004(Ф)).
Summary
A.R. Kayumov, M.R. Sharipova. The mechanisms of regulation of bacterial subtilases synthesis.
The analysis of regulatory sequence of aprBi gene coding extracellular subtilisin-like protease from Bacillus intermedins using GenBank database and BLAST algorithm was performed. Nucleotide sequence of regulatory region of the gene shares 91% of identity with that of Bacillus pumilus subtilisin gene. The study of promoters of subtilisin-like proteases from other Bacillus species was performed. Analysis of promoter region of the gene for B. interme-dius subtilisin-like protease revealed the presence of a tentative target sequence for binding with DegU and Spo0A proteins. It was shown that expression of B.intermedius subtilisin-like protease gene is under the positive control of the DegS-DegU and SpoOA phosphorelay signal transduction systems.
Литература
1. Stock J.B., Ninfa A.J., Stock A.M. Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria // Microbiol. Rev. - 1989. - V. 53. - P.450-490.
2. Parkinson J.S., Kofoid E.C. Communication modules in bacterial signaling proteins // Annu. Rev. Genet. - 1992. - V. 26. - P. 71-112.
3. Msadek T., Kunst F., Henner D., Klier A., Rapoport G., Dedonder R. Signal transduction pathway controlling synthesis of a class of degradative enzymes in Bacillus subtilis: expression of the regulatory genes and analysis of mutations in degS and degU // J. Bac-teriol. - 1990. - V. 172. - P. 824-834.
4. Msadek T., Kunst F., Rapoport G. Two-component regulatory systems / In: A.L. Bloch, J.A. Losick. R. Bacillus subtilis and other Grampositive bacteria // Biochemistry, Physiology and Molecular Genetics. - Sonenshein, Washington, DC: American society for Microbiology Press. -1993. - P. 729-745.
5. Kunst F., Msadek T., Bignon J., Rapoport G. The DegS/DegU and ComP/ComA two-component systems are part of a network controlling degradative enzyme synthesis and competence in Bacillus subtilis // Res. Microbiol. - 1994. - V. 145, No 5-6. - P. 393-402.
6. Hulett F.M. The signal-transduction network for Pho regulation in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. - 1996. - V. 19, No 5. - P. 933-939.
7. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expression and control of morphogenesis // Microbiological Rev. - 1993. - V. 57, No 1. - P. 1-33.
8. Sharipova M.R., Balaban N.P., Kayumov A.R., Kirillova Y.M., Gabdrakhmanova L.A., Mardanova A.M., Leshchinskaya I.B., Rudenskaya G.N. Akimkina T., Safina D., Demi-dyukI. V., Kostrov S. V. // J. of Appl. Microbiol. - 2005. - In press.
9. Balaban N.P., Sharipova M.R., Itskovich E.L., Leshchinskaya I.B., Rudenskaya G.N. Secreted serine protease from the spore-forming bacterium Bacillus intermedius 3-19 // Biochemistry (Moscow). - 1994. - V. 59, No 9. - P. 1033-1038.
10. Балабан Н.П., Марданова А.М., Шарипова М.Р., Габдрахманова Л.А., Соколова Е.А., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Очистка и характеристика сериновой про-теиназы 2 Bacillus intermedius 3-19 // Биохимия. - 2004. -Т. 69. - С. 519-526.
11. Akimkina T.V., Nosovskaya E.A., Kostrov S.V. Cloning and gene expression of Bacillus cereus neutral proteinase in Bacillus subtilis cells // Molek. Biol. (Mol. Biol. Moscow). -1992. - V. 26. - P. 418-423.
12. Altschul S.F., Madden T.L., Schaumluffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lip-man D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucl. Acids Res. - 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.
13. Bendtsen J.D., Nielsen H., von Heijne G., Brunak S. Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0. // Mol. Biol. - 2004. - V. 340. - P. 783-795.
14. Костров С.В., Демидюк И.В. Неопубликованные данные.
15. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (Eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. - N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
16. Chang S., Cohen S.N. High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA // Mol. Gen. Genet. - 1979. - V. 168. - P. 111-115.
17. Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Shakirov E.V., Sharipova M.R., Leshchinskaya I.B., Ksenofontov A.L., Rudenskaya G.N. Enzymatic properties of thiol-de-pendent serine proteinase of Bacillus intermedius // Biochemistry (Moscow). - 1997. -V. 62. - P. 60-65.
18. Rocha E.P., Danchin A., Viari A. Translation in Bacillus subtilis: roles and trends of initiation and termination, insights from a genome analysis // Nucleic Acids Res. - 1999. -V. 1; 27(17). - P. 3567-3576.
19. Wosten M.M. Eubacterial sigma-factors // FEMS Microbiology Rev. - 1998. - V. 22. -P. 127-150.
20. Kunst F.G., Rapoport G. Salt stress is an enviromental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis // J. of Bacteriol. - 1995. - V. 177, No 9. - P. 2403-2407.
21. Ionesco H., Michel J., Cami B., Schaeffer P. Genetics of sporulation in Bacillus subtilis Marburg // J. Appl. Bacteriol. - 1970. - V. 33. - P. 13-24.
Поступила в редакцию 25.06.05
Каюмов Айрат Рашитович - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.
E-mail: airat_kayumov@rambler.ru
Шарипова Маргарита Рашидовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета. E-mail: Margarita.Sharipova@ksu.ru
