CC BY
110
Оригинальные исследования
253
ДЕЙСТВИЕ БАЦИЛЛЯРНЫХ ПРОТЕИНАЗ НА МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ разных клеточных линий
А.А. Тойменцева, Ю.В. Данилова, Н.П. Балабан, А.М. Марданова, М.Р. Шарипова Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
The action of bacillary proteases on matrix metalloproteinases of different cell lines
A.A. Toymentseva, Y.V. Danilova, N.P. Balaban, A.M. Mardanova, M.R. Sharipova Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
Исследовали действие различных внеклеточных проте-иназ Bacillus pumilus 7P на матриксные металлопротеиназы фибробластов мыши (3T3BalbSV40), мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и клеток Hela-M. Глутамилэндопептидаза инактивировала матриксные металлопротеиназы всех клеточных линий. В отличие от высокоспецифичной протеиназы субтилизиноподобная протеиназа и металлоэндопептидаза B. pumilus не изменяли активность матриксных металлопротеиназ клеток культуры ткани разных клеточных линий.
Ключевые слова: Bacillus pumilus; глутамилэндопептидаза; субтилизиноподобная протеиназа; адамализино-подобная металлоэндопептидаза; матриксные металлопротеиназы.
Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из главных причин смерти населения планеты. Ведущая роль в патогенезе ишемической болезни сердца, инсультов и поражении периферических артерий принадлежит атеросклерозу. Нестабильная стенокардия и инфаркт миокарда являются следствием одного и того же процесса — разрыва или эрозии атеросклеротической бляшки [1]. Важную роль в дестабилизации бляшки играет воспаление, показана значительная инфильтрация нестабильных бляшек макрофагами и Т-лимфоцитами [2]. Макрофаги продуцируют матриксные металлопротеиназы
[3], повышенный уровень которых обнаружен в крови при остром коронарном синдроме [4—6]. Матриксные металлопротеиназы, в частности ММП-9, воздействуют на коллагеновые волокна оболочки атеросклеротической бляшки, приводя к ее размягчению, разрыву и дестабилизации [7, 8]. Актуальным остается поиск препаратов для борьбы с воспалительнодеструктивным процессом атеросклеротического очага и, в частности, способов расщепления ММП как маркеров деструктивного процесса.
Целью работы являлось изучение действия бактериальных протеиназ B. pumilus 7P — глутамилэн-допептидазы, субтилизиноподобной протеиназы и металлоэндопептидазы на матриксные металлопротеиназы разных клеточных линий.
It was investigated the effect of secreted proteinases Bacillus pumilus 7P belonging to different classes of proteolytic proteins on matrix metalloproteinases of mouse fibroblast (3T3BalbSV40), multipotent mesenchymal stromal and cells Hela-M. Matrix metalloproteinases of all cell lines was inactivated by glutamyl-specific endopeptidase. Subtilisin-like proteinase and adams-like metalloproteinase of B. pumilus did not change the activity of matrix metalloproteinases of differentcell lines.
Key words: Bacillus pumilus; glutamyl endopeptidase; subtilisin-like proteinase; adams-like metalloproteinase; matrix metalloproteinases.
материал и методы
Получение рекомбинантных ферментов
Все работы с ДНК (выделение плазмид, очистка ПЦР-продуктов) проводили с использованием коммерческих наборов фирмы Fermentas, Латвия. Трансформацию рекомбинантных ДНК в клетки
E. coli проводили с использованием CaCl2 метода [9]. Для трансформации использовали штамм E. coli DH5a. Для клонирования генов протеиназ в качестве матрицы для амплификации использовали геномную ДНК B. pumilus 7P. При амплификации использовали пары праймеров, представленные в таблице.
Амплифицированные фрагменты ДНК, содержащие полноразмерные гены протеиназ aprBp, gseBp и mprBp (1158, 924, 825 п.о., соответственно), клонировали по сайтам рестрикции BamHI и Hindi!! в экспрессионный вектор pGP382 так, чтобы на C-конце каждого гена содержалась последовательность Strep-tag метки, а за промотором Pdega3S содержался оптимизированный сайт связывания с рибосомой (RBS). В результате были получены рекомбинантные векторы pIO3801, pIO3802 и pIO3803, содержащие гены субтилизиноподобной протеиназы, глутамил-эндопептидазы и металлоэндопептидазы соответственно. Подтверждение корректного встраивания генов протеиназ в вектор pGP382 осуществляли
пары праймеров, использованных для амплификации генов протеиназ
Ген Праймер Последовательность праймера
Ген глутамилэндопептидазы gseBp_dir_SP GATCGGATCCtaaggaggGAGGAATATGATGAAAAAGGTGAAAATG
(gseBp) gseBp_rev GAT CAAGCTTTT GCGCTTTTGCATAGTT G
Ген субтилизиноподобной протеиназы (aprBp) aprBp_dir_SP GATCGGATCCtaaggaggATTGTGCGTGAAAAAGAAAAATGTG
aprBp_rev GAT CAAGCTT GTTAGAAGCCGCTT GAGCGTT GAT
Ген металлоэндопептидазы mprBp_dir_SP GATCGGATCCTAAGGAGGGATAGGAATGAAAAAGCGTTCAGTC
(mprBp) mprBp_rev GAT CAAGCTTT CT GTACCACGCTTTGTTACGG
е-mail: Danilova146@mail.ru
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
254
Оригинальные исследования
с помощью ДНК-секвенирования. Трансформацию векторов pIO3801, pIO3802 и pIO3803 в клетки B. subtilis BRB08 проводили как описано в работе
[10]. Изучение экспрессии генов протеиназ в полученных рекомбинантных штаммах проводили по определению специфической протеолитической активности на разные часы роста. Активность глутамилэндопептидазы определяли с использованием хромогенного синтетического субстрата, п-нитроанилида бензилоксикарбонил-£-глутаминовой кислоты (Z-Glu-pNA). За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 нМ субстрата за 1 мин. [10]. Специфическую активность субтилизиноподобной протеиназы определяли по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкМ субстрата за 1 мин. [11]. Протеолитическую активность металлопротеиназы определяли по расщеплению азоказеина. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующее в условиях эксперимента 1 мкг субстрата за 1 мин [12]. Протеолитические белки осаждали из супернатанта культуральной жидкости и проводили очистку Strep-tag меченых белков c использованием хроматографического сорбента Strep-тактин се-фарозы (модифицированный стрептовидин) (Qiagen, Германия).
Действие ферментов на ММП-9
Для исследования способности глутамилэн-допептидазы, субтилизиноподобной протеиназы и матриксной металлоэндопептидазы B. pumilus расщеплять матриксную металлопротеиназу-9 (желатиназу-В) использовали зимографию с желатином. Источником металлопротеиназы ММП-9 служили кондиционированные среды фибробластов мыши (3T3BalbSV40), мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и клеток Hela-M. Клетки были предоставлены Институтом Цитологии РАН (Санкт-Петербург). Культивирование клеток проводили по стандартной методике [13]. Hela-M выращивали на среде DMEM с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы, инактивированной 30 мин при +56°С, 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл;100 мкг/мл) (Sigma, США). Культуры клеток фибробластов и ММСК выращивали на среде МЕМ-А с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы, инактивированной 30 мин при +56°С, смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100 ЕД/мл;100 мкг/мл) (Sigma, США). Для всех экспериментов клетки высевали в концентрации 2х104 кл./лунку 24-луночного планшета и инкубировали 24 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. 15 мкл кондиционированной среды инкубировали с 15 мкл фермента 2 ч при 22°С. Реакцию останавливали добавлением раствора для проб (125 мМ Tris-HCl, рН 6.8, 0.2% SDS, 20% глицерин, 0,01% бромфеноловый синий) на 30 мин при 22°С. Пробы анализировали с помощью SDS-электрофореза, в разделяющем геле, которого присутствовало 0,3% желатина. После электрофореза гель отмывали 2,5% Тритоном Х-100 2 раза по 15 мин для удаления SDS и инкубировали в буфере, содержащем 50 мМ TrisHCl, pH 7,2—7,4, 5 мМ CaCl2, 12-18 ч
в при 37°С для проведения протеолитической реакции. После этого гель фиксировали в растворе, содержащем 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты, 30 мин и окрашивали в фиксирующем растворе, содержащем 0,06% Кумасси^250 (Sigma, США), 2 ч. От красителя, не связавшегося с желатином, гель отмывали дистиллированной водой до четкого выявления неокрашенных полос.
Результаты
Для оценки действия на матриксные металлопротеиназы, тестировали различные внеклеточные протеолитические белки B. pumilus 7P, относящиеся к разным классам протеиназ (http:// www.expasy.org/cgi-bin/enzyme-search-cl). Из них субтилизиноподобная протеиназа (КФ 3.4.21.62) характеризуется тем, что преимущественно расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных аминокислотных остатков фенилаланина, тирозина, лейцина, а также способна расщеплять связи, образованные аминокислотными остатками гидрофильных аминокислот серина, цистеина, аспарагина, глутамина [14, 15]. Другая сериновая протеиназа, глутамил-эндопептидаза (КФ 3.4.21.19), является высокоспецифичным ферментом и расщепляет пептидные связи, образованные a-карбоксильными группами глутаминовой, аспарагиновой, а также цистеиновой кислот [16]. В отличие от сериновых протеи-наз адамализиноподобная металлоэндопептидаза (КФ 3.4.24.46) бактерий B. pumilus 7P не имеет предпочтений при гидролизе и обладает еще более широкой субстратной специфичностью [17]. Фермент является цинкзависимым, он не проявляет предпочтения к определенным аминокислотам расщепляемой пептидной связи. Для получения ферментов в препаративных количествах соответствующие гены белков (AY754946.2, Y15136.1, EU678894.2) клонировали на мультикопийной плазмиде pGP382 [18]. Этот вектор содержит сильный конститутивный промотор гена degQ36 (PdegQ36), который не требует дополнительной индукции. За 3'-концом промотора PdegQ36 расположен полилинкер из 11 сайтов рестрикции, за которыми следует Strep-tag пептидная последовательность (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys). Такой вектор позволяет получать высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, содержащих на C-конце последовательность Strep-tag, позволяющую проводить эффективную очистку путем аффинной хроматографии. Гены протеиназ B. pumilus 7P - бактерий, геном которых секвенирован [19], клонировали вместе с оптимальным для бацилл участком связывания с рибосомой (RBS) — taaggagg. Такая последовательность обеспечивала оптимальное протекание процесса инициации трансляции в клетках B. subtilis [20]. В результате клонирования получили рекомбинантные плазмиды pIO3801, pIO3802 и pIO3803, содержащие гены aprBp, gseBp и mprBp, соответственно. Полученные плазмиды трансформировали в беспротеазный штамм B. subtilis BRB08, дефектный по генам восьми внеклеточных протеиназ (AnprB, AaprE, Aepr, Abpr, AnprE, Ampr, Avpr, AwprA) (Cobra Biologics, Великобритания). Использование такого штамма-реципиента позволило исключить протеолитический фон ферментов реципиентного штамма.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
255
Белки осаждали из 50 мл культуральной жидкости. Хроматография на Strep-тактин сефарозе концентратов белков (600—700 мкл) позволила провести эффективную очистку протеиназ, в результате которой были получены гомогенные ферменты: субтилизиноподобная протеиназа, глутамилэндо-пептидаза и металлоэндопептидаза B. pumilus 7P (рис. 1).
Молекулярные массы очищенных белков составили 27, 23 и 19 кДа, что соответствовало молекулярным массам субтилизиноподобной протеиназы, глутамилэндопептидазы и металлоэндопептидазы, выделенных и описанных ранее [21—23]. Таким образом, нами проведена эффективная очистка
Рис. 1. Электрофорез рекомбинантных протеиназ B. pumilus 7P в денатурирующих условиях:
1 — металлоэндопептидаза (19 кДа);
2 — глутамилэндопептидаза (23 кДа);
3 — субтилизиноподобная протеиназа (27 кДа).
М — Маркеры: РНКаза (Биназа) (12,3 кДа), лизоцим (14,4 кДа), РНКаза А (15,7 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидаза (40 кДа), БСА (ОБ кДа)
протеиназ B. pumilus 7P из рекомбинантных штаммов с помощью аффинной хроматографии.
Исследовали действие бактериальных протеи-наз B. pumilus 7P на матриксные металлопротеиназы ММП-9 разных клеточных культур. Для оценки активности матриксных металлопротеиназ после обработки их бациллярными ферментами использовали метод зимографии. Желатин — это один из стандартных субстратов протеиназ, используемых в зимографии для выявления активности желатин разрушающих ферментов. В зоне, где желатин гидролизовался ферментом, проявлялись области расщепления в виде прозрачных полос на темном окрашенном фоне. Изучали действие полученных нами бактериальных белков по отношению к ММП-9 фибробластов мыши (3T3BalbSV40), мезенхимных стволовых клеток (МСК) и клеток Hela-M. Данные представлены на рис. 2.
При действии на кондиционные среды всех клеточных линий на зимограмме отсутствовали зоны гидролиза желатина матриксными металлопротеиназами ММП-9 после обработки их глутамилэндо-пептидазой (рис. 2). Этот факт свидетельствовал о том, что бактериальная глутамилэндопептидаза расщепляла ММП-9, вследствие чего они теряли способность к гидролизу желатина, причем это происходило в отношении матриксных металлопротеиназ всех исследуемых клеточных культур, включая онкотрансформированные.
Из данных зимограммы следует, что при действии других бактериальных белков, субтилизиноподобной протеиназы и адамализиноподобной металлоэндопептидазы, на матриксные металлопротеиназы ММП-9 исследуемых культур, наоборот, обнаруживались зоны гидролиза желатина. Эти данные показывают, что ММП-9 клеточных культур остаются активными после инкубации их с бациллярными ферментами. Из данных на рисунке 2 следует, что зоны гидролиза желатина также располагаются на уровне 19 кДа и соответствуют молекулярной массе металлоэндопептидазы B. pumilus 7P. Мы предполагаем, что исследуемая протеиназа обладает желатиназной активностью, аналогичной матрикс-ным металлопртеиназам.
Рис. 2.
Зимограмма ферментов с кондиционными средами фибробластов мыши (3T3BalbSV40), ММСК и опухолевых клеток шейки матки (HelaMphoa):
К — Контроль, кондиционная среда без добавления ферментов;
Г — глутамилэндопептидаза; С — субтилизиноподобная протеиназа;
М — металлоэндопептидаза
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
256
Оригинальные исследования
Обсуждение
При остром коронарном синдроме происходит увеличение активности ММР-9 в сыворотке крови больных инфарктом миокарда [24]. Исследования последних лет демонстрируют широкий интерес к изучению активности ММП-9 в сыворотке и плазме крови при сердечно-сосудистой патологии [25, 26]. Однако значительное количество работ, посвященных изучению роли ММП в патогенезе атеросклероза, в основном носят экспериментальный характер. Клинических исследований, связанных с определением активности ММП в системном кровотоке у пациентов с ишемической болезнью сердца и острым коронарным синдромом, немного.
Согласно современным представлениям ММП-9 оказывает существенное влияние на процессы деструкции внеклеточного матрикса, повреждение эндотелия, «дестабилизацию» атеросклеротической бляшки и активацию тромбоцитарного звена. Механизм разрушения атеросклеротической бляшки характеризуется локальным воспалением с высокой активностью ММП, воздействующих на коллагеновые волокна «покрышки», тем самым способствуя ее ослаблению, дестабилизации и, как следствие, разрыву [27]. По мнению ряда авторов, именно ММП-9 играет ключевую роль в дестабилизации бляшки и в развитии острого коронарного синдрома [28].
Основная часть активной молекулы ММВ-9 состоит из двух участков — N и С-концевых доменов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Турна А.А., Тогузов Р.Т. Матриксные металлопротеиназы и сердечнососудистые заболевания. Артериальная гипертензия 2009; 5: 532-8.
2. Libby P., Ridker P., Maseri A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation 2002; 105: 1135-47.
3. Hayden M.R., Tyagi S.C. Arteriogenesis: angiogenesis within unstable atherosclerotic plaques — interactions with extracellular matrix. Curr. Interv. Cardiol. Rep. 2000; 2: 218-27.
4. Katsuda S., Kaji T. Atherosclerosis and extracellular matrix. Atheroscler. Thromb. 2003; 10: 267-74.
5. Newby A.C. Dual role of matrix metalloproteinases tmatrixins) in intimal thickening and atherosclerotic plaque rupture. Physiol. Rev. 2005; 85: 31.
6. Гайфуллина Р.Ф., Катина М.Н., Ризванова Ф.Ф. и др. Роль генетического полиморфизма в патогенезе цереброваскулярных заболеваний. Казанский медицинский журнал 2012; 93(4): 663-7.
7. Galis Z.S., Sukhova G.K., Lark M.W. Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques. Clin. Invest. 1994; 94 (6): 2493-503.
8. Loftus I.M., Naylor A.R., Goodall S. et al. Increased MMP-9 activity in unstable carotid plaques: A potential role in acute plaque disruption. Stroke 2000; 31(1): 40-7.
9. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular doning: а laboratory manual, 3 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
10. Anagnostopolous C., Spizizen J. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J. of Bacteriol. 1961; 81: 741-6.
11. Люблинская Л.А., Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н. П-нитроанилиды пироглутамилпептидов хромогенные субстраты сериновых протеиназ. Биоорг. химия. 1987; 13 (6): 748-53.
12. Demidyuk I.V., Romanova D.V., Nosovskaya E.A. et. al. Modification of substrate-binding site of glutamyl endopeptidase from Bacillus intermedius. Prot. Eng., Des. Selec. 2004; 17 (5): 411-6.
13. Adams. R. Methods of cell culture for biochemists. New York: Wiley; 1983.
14. Михайлова Е.О., Марданова А.М., Балабан Н.П. и др. Выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis AJ73 на разных фазах роста бацилл. Биохимия. 2007; 72(2): 228-35.
N- Концевой каталитический домен содержит консервативную аминокислотную последовательность HEXXHXXGXXH, ответственную за каталитическую активность фермента. Этот мотив активного центра фермента содержит остаток глутаминовой кислоты, участвующий в катализе [29—31]. Так как высокоспецифичная глутамилэндопептидаза гидролизует связи, образованные глутаминовой и аспарагиновой кислотами, то очевидно, что расщепление желатиназы-В этим ферментом происходило в активном центре по остатку глутаминовой кислоты [32].
Таким образом, из исследованных нами бациллярных внеклеточных протеиназ глутамилэндопеп-тидазу B. pumilus 7P можно рассматривать как фактор снижения уровня матриксных протеиназ ММП-9 и как потенциальный препарат для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Благодарности
Авторы статьи выражают глубокую благодарность д.б.н. Хайтлиной С.Ю., к.б.н. О.А. Цаплиной за помощь в проведении экспериментов с кондиционными средами культур клеток, проф. T. Mascher за предоставление плазмиды pGP382. Работа выполнена за счет средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.
15. Itskovich E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M. et. al. Enzymatic properties of thiol-dependent serine proteinase of Bacillus intermedius 3-19. Biochemistry 1997; 62 (1): 49-53.
16. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L. et. al. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius , strain 3-19. FEBS Lett. 1997; 404 ( 2): 241-4.
17. Рудакова Н.Л., Балабан Н.П., Данилова Ю.В. и др. Характеристика цинкзависимой эндопептидазы Bacillus intermedius. Биохимия 2010; 75(10): 1462-70.
18. Herzberg C., Weidinger L., Dorrbecker B. et. al. SPINE: a method for the rapid detection and analysis of protein-protein interactionsin vivo. Proteomics 2007; 7: 4032-5.
19. Shagimardanova E.I., Toymentseva A.A., Balaban N.P. Draft genome sequence of Bacillus pumilus 7P, isolated from the Soil of the Tatarstan Republic, Russia. Genome Announcements 2014; 2 (3): e00599-14.
20. Vellanoweth R.L., Rabinowitz J.C. The influence of ribosomebinding-site elements on translational efficiency in Bacillus subtilis and Escherichia coli in vivo. Mol. Microbiol. 1992; 6 (9): 1105-14.
21. Mikhailova E.O., Mardanova A.M., Balaban N.P. et. al. Purification of a subtilisin-like serine proteinase from recombinant Bacillus subtilis during different phases of growth. Biochemistry 2009; 74(3): 308-15.
22. Шамсутдинов Т.Р., Балабан Н.П., Марданова А.М. и др. Выделение и характеристика глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на разных фазах роста. Биоорганическая химия 2008; 34 (3): 322-6.
23. Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P. et. al. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius. FEBS Lett. 2010; 584(21): 4419-25.
24. Турна А.А. Диагностическое значение активности матрикс-ной металлопротеиназы 9 (желатиназы В) при остром коронарном синдроме. Артериальная гипертензия 2010; 6: 41-5.
25. Fukuda D., Shimada K., Tanaka A. et al. Comparison of levels of serum matrix metalloproteinase-9 in patients with acute myocardial infarction versus unstable angina pectoris versus stable angina pectoris. Am. J. Cardiol. 2006; 97(2): 175-80.
26. Garvin P., Nilsson L., Carstensen J. Circulating matrix metalloproteinase-9 is associated with cardiovascular risk factors in a middle-aged normal population. Oxford J. Med. 2008; 101: 785-91.
27. Loftus I.M., Naylor A.R., Goodall S. et al. Increased matrix metalloproteinase-9 activity in unstable carotid plaques: a potential role in acute plaque disruption. Stroke 2003; 31: 40-7.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Оригинальные исследования
257
28. Ardans J., Economou A., Martinson J. et al. Oxidised low density and high density lipoproteins regulate the production of matrix metalloproteinases 1 and 9 by activated monocytes. J. Leukoc. Biol. 2002; 71: 1012-8.
29. Соловьева Н.И. Основные металлопротеиназы соедини-тельно-тканного матрикса. Биоорганическая химия 1994; 20 (2): 143-52.
30. Балабан Н.П., Рудакова Н.Л., Шарипова М.Р. Структурные особенности и функциональная значимость метцинкиновых
металлоэндопептидаз. Биоорганическая химия 2013; 39 (5): 552-7.
31. Балабан Н.П., Рудакова Н.Л., Сабирова А.Р. и др. Первая адамализиноподобная микробная металлоэндопептидаза. Биоорганическая химия 2012; 38 (4): 439-48.
32. Балабан Н.П., Данилова Ю.В., Шамсутдинов Т.Р. и др. Свойства глутамилэндопептидазы Bacillus pumilus на разных фазах роста рекомбинантного штамма. Биоорганическая химия 2013; 39(1): 46-54.
Поступила: 12.08.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
