CC BY
46
УДК 576.8.097.29; 616.988.76
Фадеев С.Б.12, Щуплова Е.А.1
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, г. Оренбург 2Оренбургская государственная медицинская академия E-mail: Khanina83@yandex.ru
ОБРАЗОВАНИЕ МЕТГЕМОГЛОБИНА ПРИ ЭРИТРОЦИТАРНО-БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯХ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Установлено, что при эритроцитарно-бактериальных взаимодействиях in vitro штаммы Staphylococcus epidermidis с низкой антигемоглобиновой активностью кратковременно повышали уровень метгемоглобина в эритроцитах, а штаммы с высокой активностью вызывали конфор-мационные изменения белковой части гемоглобина («порфириновый карман») и более длительное повышение уровня метгемоглобина.
Ключевые слова: эритроциты, метгемоглобин, стафилококки, антигемоглобиновая активность, спектральный анализ.
Организм человека постоянно находится в симбиотических взаимоотношениях с собственной микробиотой. Среди разнообразных вариантов этих про- и эукариотических взаимодействий особый интерес представляют бактери-ально-эритроцитарные контакты [10]. Механизмы развития последних при транзиторной или септической бактериемии представляют особый интерес как с биологических, так и с медицинских позиций. Известен бактериальный феномен антигемоглобиновой активности, позволяющий микроорганизмам персистировать, ингибируя антибактериальное действие гемоглобина [1]. Однако особенности трансформации гемоглобина при таких эритроцитарно-бактериальных взаимодействиях остаются неизученными.
Как известно, гемоглобин эритроцитов представляет собой гетерогенную систему, включающую как оксигемоглобин, так и кар-боксигемоглобин, сульфгемоглобин, метгемог-лобин, цианметгемоглобин [6]. Переход гемоглобина из одной формы в другую (трансформация гема) может быть как спонтанным, так и индуцированным [9]. В последнем случае, в условиях внешнего воздействия, возможно изменение и белковой части молекулы гемоглобина. Такая трансформация может снижать сродство тетрамерной молекулы гемоглобина к кислороду, что немаловажно для развития ряда морбид-ных состояний [7].
Цель
Изучение образования метгемоглобина и изменения белковой части молекулы гемогло-
бина при эритроцитарно-бактериальных взаимодействиях в зависимости от уровня антигемоглобиновой активности стафилококков.
Материалы и методы
В работе использовались 30 штаммов Staphylococcus epidermidis (коллекция клинических изолятов лаборатории экологии микроорганизмов), отличавшихся по уровню антигемоглобиновой (АнтиНЬА) активности [2]. 15 штаммов обладали высоким уровнем (>3 г/л) антигемоглобиновой активности (в среднем - 5,6 г/л), 15 - низким уровнем этого свойства (<3 г/л; в среднем - 1,3 г/л).
Особенности бактериально-эритроцитар-ных взаимодействий изучали на оригинальной модели, базирующейся на принципах оценки влияния органических и неорганических веществ на эритроциты и гемоглобин [5], которая заключалась в следующем. В эксперименте in vitro для приготовления опытной пробы смешивали 0,5 мл взвеси отмытых донорских эритроцитов человека (О(1) группы, Rh+) в концентрации 106 кл/мл с 2 мл супернатанта суточной бульонной культуры стафилококка. Количество опытных проб соответствовало удвоенному числу использованных штаммов S. epidermidis. В качестве контрольных использовали пробы, состоящие из 2 мл мясо-пептонного бульона и 0,5 мл взвеси эритроцитов в той же концентрации. Исследования проводили при постоянном температурном режиме 370С. Для оценки влияния микроорганизмов на структуру молекулы гемоглобина определяли оптические спектры всех проб с помощью сканирующего спектро-
фотометра «Genesys 5» (США) через 2ч, 6ч и 24ч от начала инкубации. Для оценки состояния гемовой части гемоглобина к 0,5 мл каждой исследуемой пробы добавляли 0,5 мл дистиллированной воды с целью гемолиза эритроцитов. Оптическую плотность (ОП) определяли в диапазоне 450-700 нм, характерной для гемовой части гемоглобина [11]. Для оценки изменений в белковой части гемоглобина исследуемые пробы (по 0,5 мл) разводили дистиллированной водой в 4 раза и определяли оптическую плотность исследуемого раствора в диапазоне 220-450 нм [11].
Для оценки спектральных параметров мет-гемоглобина рассчитывали разностные спектры, которые строили относительно модельного спектра, содержащего оксигемоглобин [5]. Для нивелирования отличий спектральных характеристик, обусловленных разной концентрацией гемоглобина в пробах, вычисляли разностные спектры по нормированным спектрам относительно поглощения проходящего света с длиной волны 576 нм [5].
При анализе полученных данных оценивали частотные интервалы видимой области спектра, характерные для метгемоглобина (502-505; 538-542; 560-565; 619-620; 629-632 нм) и ультрафиолетовой части спектра, характерные для белковой части (252; 268-272; 408-415нм) [5]. Расчет доли метгемоглобина от всех форм гемоглобина проводили по методике Кушаковс-кого М.С. [7].
Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2007 c вычислением средней арифметической (M); средней ошибки (m); критерия значимости (t) Стьюдента. Различия считались значимыми (достоверными) при р<0,05 [8].
Результаты и обсуждение
Проведение спектрального анализа гемо-вой части гемоглобина под действием суперна-тантов исследуемых культур в диапазоне 500700 нм через 2 часа инкубации позволило выявить слабовыраженную динамику оцениваемых показателей (рис. 1а). Минимальное отклонение разностных графиков (от 0,006±0,001 ед. ОП до 0,018±0,001 ед. ОП) указывало, что доля образовавшегося метгемоглобина не превыша-
ла 0,25% от всех форм гемоглобина. Следует также отметить, что штаммы с низкой АнтиНЬА в несколько большей степени повышали оптическую плотность проб в диапазонах 619-620; 629-632 нм, чем штаммы с высокой активностью (0,014±0,001 против 0,008±0,001 ед. ОП и 0,012±0,001 против 0,005±0,001 ед. ОП соответственно). В свою очередь влияние штаммов с высокой АнтиНЬА было несколько заметнее в диапазоне 502-505 нм.
Через 6 часов инкубации влияние стафилококков в «первом» диапазоне (502-505 нм) становилось более выраженным (рис. 1б), особенно при инкубации с супернатантами штаммов с высокой АнтиНЬА (0,073±0,003 ед. ОП), что свидетельствовало об увеличении доли мет-гемоглобина от всех форм гемоглобина (до 4%). К шестому часу эксперимента «метгемоглоби-новый зубец» в диапазоне 560-565 нм становился более выраженным независимо от того, обладал штамм высокой или низкой АнтиНЬА (0,035±0,002 ед. ОП). Следует также отметить повышение оптической плотности проб (до 0,051±0,002 - 0,06±0,003 ед. ОП) в широком диапазоне измерений 560-700 нм, свидетельствующее о присутствии низкоспинового метгемоглобина [11], формирующегося прежде всего под действием штаммов с высокой АнтиНЬА.
Дальнейший ход эксперимента характеризовался некоторыми особенностями. Повышение оптической плотности проб в диапазоне 502-505 нм на шестой час эксперимента (рис. 1б) сменилось значительным её снижением к 24 часам до отрицательных разностных значений (рис. 1в), что косвенно свидетельствовало о повышении доли оксигемоглобина, как реализации адаптивного потенциала системы гемоглобина и всего эритроцита в целом. Указанная особенность регистрировалась как в пробах, содержащих супернатанты штаммов с низким уровнем антигемоглобиновой активности (снижение на 0,014±0,001 ед. ОП относительно контрольных проб), так и под влиянием суперна-тантов стафилококков с высокой АнтиНЬА (снижение на 0,032±0,001 ед. ОП). В диапазоне 538-542 нм произошло выраженное снижение оптической плотности проб (на 0,015±0,001 ед-. ОП относительно контрольных проб), содержащих супернатанты штаммов с высокой АнтиНЬА, а в промежутке 560-565 нм - с низкой. Оставшиеся во «втором» и «третьем» диа-
пазонах «пики» разностных графиков сопоставимы с аналогичными значениями, полученными на шестом часу эксперимента.
В широкой полосе 560-700 нм наблюдалось выраженное снижение оптической плотности проб (по сравнению с 6-часовыми результатами), содержащих супернатанты стафилококков с низкой АнтиНЬА (до -0,030±0,002 ед. ОП), что можно трактовать
как результат адаптивных процессов эритро-цитарно-гемоглобиновой системы. Однако при взаимодействии эритроцитов с микроорганизмами, обладающими высоким уровнем АнтиНЬА, оптическая плотность проб не снижалась (0,060±0,003 ед. ОП выше контрольных значений), свидетельствуя о сохранении определенной доли (4%) низкоспинового метгемоглобина [11].
Рисунок 1. Разностные графики оптических спектров гемоглобина (гемовая часть) через 2 часа (а), 6 часов (б) и 24 часа (в) после инкубации эритроцитов с супернатантами штаммов 5. ерЫетшЫк. Вертикальными стрелками указаны значимые диапазоны (по порядку слева направо): 502-505; 538-542; 560-565; 619-620; 629-632 нм.
Таким образом, влияние супернатантов стафилококков, прежде всего с высокой антиге-моглобиновой активностью, на эритроциты приводило к повышению в них уровня метге-моглобина.
Спектральный анализ белковой части гемоглобина под действием супернатантов исследуемых культур в диапазоне 220-450 нм через 2 часа инкубации позволил выявить некоторое
снижение разности оптической плотности проб в диапазонах 252, 268-272 нм на 0,063±0,001 и 0,14±0,002 ед. ОП от контрольных значений (рис. 2а). Однако изменения оптической плотности в диапазоне 408-415нм не регистрировались (разностные показатели в пределах 0,01±0,001 - 0,015±0,001 ед. ОП), что указывало на стабильность «порфиринового кармана» молекулы гемоглобина.
ед,
ОП
0,4
0,2
11 1 ч V
ч ^ N
иппиш.: . ......1 ........ ■ : 1 1........... "ТП| щ РГПГтп ГП1111ПТГГТ111II 1ТПМ"111 |ТТ
280 330 38&"Ч / 430
-0,2
6)
длина волны, нм
Рисунок 2. Разностные графики оптических спектров гемоглобина (белковая часть) через 2 часа (а), 6 часов (б) и 24 часа (в) после инкубации эритроцитов с супернатантами штаммов 5. ерЫегшЫгз. Вертикальными стрелками указаны значимые диапазоны (по порядку слева направо):
252; 268-272; 408-415нм нм.
Через 6 часов (рис. 2б) инкубации проб с су-пернатантами штаммов с низкой АнтиНЬА происходило повышение оптической плотности указанных проб в диапазонах 252, 268-272 нм (на 0,175±0,003 и 0,120±0,02 ед. ОП соответственно), в других областях исследуемого спектра динамика отсутствовала. Напротив, при соинкуба-ции эритроцитов с супернатантами стафилококков с высокой АнтиНЬА происходило одно, но очень существенное изменение - снижение оптической плотности проб в «зоне порфириново-го кармана» (на 0,151±0,002 ед. ОП в сравнении с контрольными значениями). Последнее указывало на то, что конформация белковой части гемоглобина не обеспечивала в должной мере «защиту» гема от экзогенного воздействия.
Влияние супернатантов микроорганизмов на эритроциты в течение суток проявилось в дальнейшем повышении оптической плотности проб в диапазонах 252, 268-272 нм (рис. 2в), в большей степени - под действием стафилококков с низкой АнтиНЬА (на 0,491±0,003 ед. ОП), в меньшей - с высокой (на 0,249±0,001 ед. ОП). И только при соинкубации проб с супернатантами штаммов с высокой АнтиНЬА отмечалось снижение оптической плотности в проекции «порфиринового кармана» (на 0,069±0,002 ед. ОП).
Таким образом, при воздействии супернатантов стафилококков с высокой АнтиНЬА происходили конформационные изменения белковой части гемоглобина в области «порфирино-вого кармана», что может повышать возможность экзогенного влияния на гемовую часть гемоглобина, в том числе с переходом оксиге-моглобина в метгемоглобин.
Заключение
Взаимодействие микроорганизмов с макроорганизмом, представленное в настоящей работе на модели эритроцит-микроорганизм, является сложным и многофакторным процессом. Изучение влияния продуктов жизнедеятельности штаммов S. epidermidis, обладающих анти-гемоглобиновой активностью различного уровня, на структуру гемоглобина на основе оценки
динамики спектральных характеристик взвеси эритроцитов, подвергшихся гемолизу, позволило установить следующие особенности. При взаимодействии эритроцитов с супернатанта-ми S. epidermidis с низкой антигемоглобиновой активностью регистрировались умеренные изменения в белковой части гемоглобина, не затрагивающие «порфириновый карман», и повышение доли метгемоглобина от всех форм гемоглобина до 4%. Однако через 24 часа происходило снижение доли метгемоглобина до уровня, близкого к норме, что косвенно свидетельствовало о повышении доли оксигемоглобина, как реализации адаптивного потенциала системы гемоглобина и всего эритроцита в целом.
Взаимодействие эритроцитов с суперна-тантами S. epidermidis с высокой антигемогло-биновой активностью характеризовалось повышением уровня метгемоглобина, в том числе низкоспинового, сопровождавшегося трансформацией белковой части гемоглобина в области «порфиринового кармана». Возможно, что повреждение белковой части гемоглобина в области «порфиринового кармана» веществами, продуцируемыми S. epidermidis, облегчает воздействие на гем и, отчасти, обусловливает переход оксигемоглобина в метгемоглобин. Это дает возможность бактериям захватывать железо непосредственно из гема и использовать его для собственного бактериального метаболизма [3,4]. Причем, повышенный уровень низкоспинового метгемоглобина сохранялся, по крайней мере, в течение суток. Такая трансформация может снижать сродство тетрамерной молекулы гемоглобина к кислороду [7]. Роль этого феномена в развитии патологических состояний (анемии, гипоксии и др.) требует проведения дальнейших исследований.
В целом полученные результаты раскрывают первые этапы взаимодействия микроорганизмов с эритроцитами человека - нарушение конформационной структуры белковой части гемоглобина, «открытие порфиринового кармана», переход оксигемоглобина в метгемог-лобин.
6.10.2014
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект №
13-04-97048 р_поволжье_а)
Список литературы:
1. Бухарин О.В. Особенности взаимодействия бактерий с эритроцитами и их роль в развитии инфекционной анемии/О.В. Бухарин, А.А. Стадников, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина // Журн. Микробиол, 2006.- №4- С. 25-28.
2. Бухарин О.В. Определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина// RU № 2262705 C2.
3. Гаврилова Н.А. Влияние природы источников железа на рост различных штаммов Corynebacterium diphtheriae / Н.А. Гаврилова, И.М. Грубер, Т.Н. Филатова // Журн. Микробиол, 2000.- №1.- С. 27-30.
4. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот / Е.В. Ермилова.- СПб: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2007.- 299 с.
5. Икрянникова С.В. Влияние экологических факторов на антиоксидантный статус и спектральные характеристики гемоглобина жителей промышленного города: дис....канд.биол.наук / С.В. Икрянникова. - Оренбург, 2006.- 119 с.
6. Клиническая биохимия/ Под ред. В.А. Ткачука - 2-е изд., испр. и доп.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004.-512с.
7. Кушаковский М.С. Клинические формы повреждения гемоглобина / М.С. Кушаковский.- Л., 1968.- 263 с.
8. Ланг Т.А. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов / Т. А. Ланг, М. Сесик, пер. с англ. под ред. В.П. Леонова.- М.: Практическая медицина, 2011.- 480 с.: ил.
9. Путинцева О.В. Оценка степени фотоповреждения хромофоров гемового и глобинового компонентов УФ-облученных молекул и электрофоретических фракций карбоксигемоглобина человека/ О.В. Путинцева, В.Г. Артюхов, Е.А. Калаева // Радиационная биология. Радиоэкология.- 2000.- Т.40, №4.- С.439-445.
10. Симбиоз и его роль в инфекции/ О.В. Бухарин [и др.]. - Екатеринбург: УрО РАН, 2011.- 300 с.
11. Perutz M.F. Influence of globin structure on the state of the heme III changes in heme spectra accompanying allosteric transitions in methemoglobin and their implications for heme-heme interaction /M.F. Perutz., E.J. Heedner, J.E. Zadner et al//J. Biochemistry.-1974.- Vol. 13.- P.2187-2200.
Сведения об авторах:
Фадеев Сергей Борисович, заведующий лабораторией экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной хирургии, урологии Оренбургской государственной медицинской академии
460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, e-mail: sergfsb@mail.ru
Щуплова Елена Алексеевна, старший научный сотрудник лаборатории экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук
460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11, e-mail: Khanina83@yandex.ru
