Научная статья на тему 'Антигемоглобиновая активность энтерококков'

Антигемоглобиновая активность энтерококков Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
304
97
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ЭНТЕРОКОККИ / ПАТОГЕННОСТЬ / ГЕМОГЛОБИН / АНТИГЕМОГЛОБИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ / ENTEROCOCCI / PATHOGENICITY / HEMOGLOBIN / ANTI-HEMOGLOBIN ACTIVITY

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Щуплова Елена Алексеевна, Герцен Нина Васильевна, Фадеев Сергей Борисович, Валышев Александр Владимирович

У энтерококков фекальной микрофлоры человека обнаружено новое свойство антигемог-лобиновая активность (АнтиНbА). Выявлено, что наиболее высокий уровень АнтиНbА характерен для бактерий вида Enterococcus faecalis. Показана взаимосвязь антигемоглобиновой активности с другими факторами патогенности у энтерококков.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Щуплова Елена Алексеевна, Герцен Нина Васильевна, Фадеев Сергей Борисович, Валышев Александр Владимирович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

ANTI-HEMOGLOBIN ACTIVITY OF ENTEROCOCCI

In enterococci of human fecal microflora was discovered a new property anti-hemoglobin activity (AntiHbA). The highest level of AntiHbA was revealed in the strains of Enterococcus faecalis. Data on interrelation of anti-hemoglobin activity with other factors of pathogenicity of enterococci are presented.

Текст научной работы на тему «Антигемоглобиновая активность энтерококков»

УДК 579.86:579.22:579.26

Щуплова Е.А., Герцен Н.В., Фадеев С.Б., Валышев А.В.

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург E-mail: Khanina83@yandex.ru

АНТИГЕМОГЛОБИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ ЭНТЕРОКОККОВ

У энтерококков фекальной микрофлоры человека обнаружено новое свойство - антигемог-лобиновая активность (АнтиНЬА). Выявлено, что наиболее высокий уровень АнтиНЬА характерен для бактерий вида Е^егососсив 1аесаИв. Показана взаимосвязь антигемоглобиновой активности с другими факторами патогенности у энтерококков.

Ключевые слова: энтерококки, патогенность, гемоглобин, антигемоглобиновая активность.

Микроорганизмы рода Enterococcus входят в состав нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта млекопитающих, птиц и беспозвоночных и играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности биотопов. Являясь условно-патогенными бактериями, они довольно часто вызывают инфекционные процессы. Хотя ведущие факторы вирулентности и персистенции энтерококков хорошо изучены [3], [4], отдельные свойства бактерий данного рода пока еще не достаточно охарактеризованы. К числу таких признаков относится антигемоглобиновая активность (АнтиНЬА), описанная у ряда микроорганизмов: Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa [7], [8]. Реализация этого свойства способствует формированию иммунодефицита в организме хозяина [6], играет роль в развитии анемии при инфекционных процессах [2].

В связи с этим, целью данной работы явилось изучение распространенности и выраженности антигемоглобиновой активности энтерококков кишечной микрофлоры человека.

Материалы и методы

В работе были использованы 224 штамма энтерококков, изолированные из фекалий лиц при обследовании на дисбиоз кишечника. Для идентификации энтерококков учитывали морфологические, тинкториальные и культураль-ные свойства; биохимический профиль определяли с помощью тест-системы EN-COCCUStest (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Гемолитическую активность определяли на триптиказо-соевом агаре (TSA; Becton Dickinson, США) с 5% крови человека. Продукцию протеолитических ферментов оценивали на TSA с 3% желатина (Becton Dickinson, США) и 1,5% обезжиренного молока (Skim Milk Powder; Becton Dickinson, США). Антигемоглобиновую активность эн-

терококков изучали фотометрическим методом [1] в следующей модификации. Исследуемые культуры энтерококков выращивали на Шедлер-агаре (Hi Media, Индия) при 370С в течение 24 ч. Из выросшей агаровой культуры готовили взвесь микроорганизмов в физиологическом растворе (10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича); 0,1 мл взвеси добавляли к 2,9 мл Шедлер-бульона, инкубировали при 370С в течение 24-48 ч. Бесклеточные супернатанты получали путем центрифугирования при 10000 об/мин в течение 20 мин (10 0С). Надосадочную жидкость (0,2 мл) смешивали с 0,02 мл раствора гемоглобина (кристаллический бычий гемоглобин (BBL), концентрация 120 г/л). Параллельно готовили контрольную пробу - 0,2 мл Шедлер-бульона смешивали с 0,02 мл раствора гемоглобина вышеуказанной концентрации. Затем опытные и контрольную пробы инкубировали при 370С в течение 3 ч, после этого опытные и контрольную пробы (0,02 мл) добавляли к 0,5 мл трансформирующего раствора из набора реактивов для определения гемоглобина крови ге-миглобинцианидным методом «Гемоглобин Агат» (ООО «Агат-Мед», Россия). Калибровочную пробу гемоглобина (0,02 мл) добавляли к 5 мл трансформирующего раствора. Все пробы тщательно перемешивали, снова инкубировали при 250С в течение 20 мин, после чего измеряли величину оптической плотности опытных проб против холостой пробы (трансформирующего раствора) при длине волны 540 (500-560) нм с использованием спектрофотометра xMark (Bio-Rad, США). Далее в опыте и контроле определяли остаточную концентрацию гемоглобина по формулам:

С0=Е0/Е6.120, СГЕ/Е6.120,

где С0- концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л;

Естественные науки

Ск— концентрация гемоглобина в контрольной пробе, г/л;

Е0— оптическая плотность опытной пробы;

Ек— оптическая плотность контрольной пробы;

Екб- оптическая плотность калибровочной пробы;

120- концентрация гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.

Антигемоглобиновую активность исследуемых культур микроорганизмов определяли по разнице концентраций гемоглобина в опытных и контрольной пробах по формуле: АнтиНЬА = Ск-Со где АнтиНЬА - антигемоглобиновая активность, выраженная в граммах инактивированно-го гемоглобина на литр супернатанта (г/л).

Для оценки антигемоглобиновой активности (АнтиНЬА) энтерококков предложена следующая интерпретация результатов: низкий уровень АнтиНЬА - менее 30 г/л, средний уровень - 30-40 г/л, высокий уровень - >40 г/л.

Полученные после повторов в трех сериях результаты были подвергнуты статистической обработке [5].

Результаты и обсуждение

В результате проведенных исследований было установлено, что все штаммы энтерококков обладали антигемоглобиновой активностью (рис. 1). При оценке выраженности этого свойства было выявлено, что значительная часть (44,2±3,3%) изученных штаммов обладали низким уровнем АнтиНЬА. У 33,8±3,1% исследованных культур регистрировались средние значения АнтиНЬА. Высокий уровень АнтиНЬА был обнаружен у 22+2,7% изолятов энтерококков.

При характеристике антиге-моглобиновой активности бактерий в зависимости от их видовой принадлежности было выявлено, что среднее значение АнтиНЬА для ЕпШососсш /аесаИэ составило 32,2±4,1 г/л. Средние значения АнтиНЬА у представителей других видов были ниже: 30,5±6,7 г/л (Е. /аесшш), 31,6±10,6г/л (Е.аишш). Минимальные средние значения признака были зарегистрированы у бактерий вида Е. ¿штат - 26,2±9,8г/л. В целом

значения АнтиНЬА энтерококков «укладывались» в промежуток от 1,2 г/л (Е. ¿штат) до 58,2 г/л (Е./аесаЫ).

Анализ взаимосвязи антигемоглобиновой активности с другими ведущими факторами патогенности энтерококков был проведен у бактерий вида Е./аесаНз, обладающих наибольшей клинической значимостью и представляющих значительный интерес в эпидемиологическом аспекте. Штаммы Е. /аесаНз, не обладающие ни гемолитической, ни желатиназной активностью, характеризовались наиболее низкой АнтиНЬА - 19,7±1,2 г/л (рис. 2). Значительно больший (р<0,05) уровень АнтиНЬА наблюдался у гемолитически активных штаммов Е./аесаНз - 33,2±0,8 г/л. Наиболее высокие значения АнтиНЬА по сравнению с вышеуказанными (р<0,05) были характерны для штаммов Е./аесаНз, обладающих желатиназной активностью - 44,2±2,6 г/л. Средний уровень АнтиНЬА штаммов, обладающих как желатиназной, так и гемолитической активностью, составил

Рисунок 1. Распространенность антигемоглобиновой активности у энтерококков

Примечание. 1,2,3 - р<0,05 Рисунок

2. Взаимосвязь факторов патогенности с уровнем выраженности АнтиНЬА у энтерококков

Щуплова Е.А. и др.

Антигемоглобиновая активность энтерококков

роциты, и протеолитического фермента жела-тиназы облегчают, по-видимому, этот процесс.

Выводы

1. Антигемоглобиновая активность является распространенным свойством у энтерококков.

2. Высокий уровень АнтиНЬА выявлен у культур E. faecalis.

3. Штаммы Е. faecalis со средними и высокими значениями АнтиНЬА характеризуются наличием основных факторов патогенности -цитолизина (гемолизина) и желатиназы.

6.10.2014

Работа выполнена при поддержке РФФИ и Министерства образования Оренбургской области, проект №13-04-97048, гранта Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности (соглашение №38 от 30.06.2014)

34,8±1,6 г/л, что существенно выше, чем у штаммов с отсутствием указанных свойств (р<0,05).

Анализ фактического материала показал, что антигемоглобиновая активность бактерий является распространенным признаком у энтерококков. Одним из возможных объяснений большой частоты встречаемости этого свойства является необходимость получения бактериями ионов железа из железосвязывающих и железосодержащих белков в условиях дефицитной по металлам переменной валентности среды. Продукция цитолизина, разрушающего эрит-

Список литературы:

1. Бухарин О.В. Определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина// Ии №2262705 С2.

2. Бухарин О.В. Особенности взаимодействия бактерий с эритроцитами и их роль в развитии инфекционной анемии / О.В. Бухарин, А.А. Стадников, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. -№4.- С. 25-28.

3. Бухарин О.В. Биология и экология энтерококков / О.В. Бухарин, А.В. Валышев.- Екатеринбург: УрО РАН, 2012.-227 с.

4. Валышев А. В., Герцен Н. В. Факторы патогенности энтерококков кишечной микрофлоры человека // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2012. -№4.- С. 41-44.

5. Ланг Т.А. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов / Т. А. Ланг, М. Сесик, пер. с англ. под ред. В.П. Леонова.- М.: Практическая медицина, 2011.- 480 с.: ил.

6. Стадников А.А. Бактериальная инактивация гемоглобина как один из механизмов формирования иммунодефецита / А.А. Стадников, Е.А. Ханина, Б.Я. Усвяцов // Иммунология Урала. Материалы V конференции иммунологов Урала.- 2006.-№1(5).- С. 175.

7. Усвяцов Б.Я. Роль факторов персистенции и вирулентности при микроэкологических изменениях в организме человека / Б.Я. Усвяцов, Л.М. Хуснутдинова, Л.И. Паршута, Е.А. Ханина и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии.- 2006.-№4.- С. 58-61.

8. Ханина Е.А. Антигемоглобиновая активность микроорганизмов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук / Е.А. Ханина.-Оренбург, 2006.- 23 с.

Сведения об авторах:

Щуплова Елена Алексеевна, старший научный сотрудник лаборатории экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук, e-mail: Khanina83@yandex.ru

Герцен Нина Васильевна, научный сотрудник лаборатории дисбиозов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук

Фадеев Сергей Борисович, заведующий лабораторией экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, доктор медицинских наук, e-mail: sergfsb@mail.ru

Валышев Александр Владимирович, заведующий лабораторией дисбиозов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, доцент, кандидат медицинских наук, e-mail: valyshev@esoo.ru

460000, г. Оренбург, ул. Пионерская, 11

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.