CC BY
69
УДК 576.8.097.29; 616.988.76
Щуплова Е.А.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г Оренбург, Россия
E-mail: Khanina83@yandex.ru
РОЛЬ МИКРОБОВ-АССОЦИАНТОВ В ПРОЦЕССАХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БАКТЕРИЙ С ЭРИТРОЦИТАМИ
В последнее время все чаще встречаются работы, описывающие нахождение бактерий внутри эритроцитов. У разных микроорганизмов выработались различные типы стратегий взаимодействия с мембраной клетки-хозяина и различные механизмы проникновения внутрь клетки. Нахождение микроорганизмов в крови человека и животных, а также внутри эритроцитов приводит к развитию бактериемии и сепсису с высокой летальностью. В качестве гемокультуры при бактериемии в основном выделяют грамположительные микроорганизмы - коагулазонегативные стафилококки, второе место занимают энтеробактерии и другие условно-патогенные микроорганизмы, причем, выделенные гемокультуры представляют собой как моноинфекцию, так и ассоциацию из двух, трех и даже четырех возбудителей. Необходимо отметить, что изучение биологических свойств у микроорганизмов особенно актуально при обнаружении их в ассоциациях и тем более при взаимодействии бактерий с клетками организма человека, в частности с эритроцитами.
Использование современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии позволило изучить особенности взаимодействия эритроцитов с клетками Staphylococcus epidermidis, предварительно обработанных экзометаболитами микробов-ассоциантов. Результаты исследования показали, что экзометаболиты патогенного штамма S.aureus, а также супернатанты Candida albicans и Klebsiella pneumoniaе усиливали процессы адгезии к эритроцитам клеток S. epidermidis и их внутриэритроцитарную локализацию. Под действием экзометаболитов условно-патогенных микрооргнизмов таких, как S.saprophyticus, Escherichia coli и Corinebacterium spp. наблюдали снижение изучаемых процессов.
Таким образом, под влиянием экзометаболитов бактерий-ассоциантов было обнаружено разнонаправленное действие на процессы адгезии и проникновения в эритроциты клеток Staphylococcus epidermidis.
Ключевые слова: микробы-ассоцианты, экзометаболиты, эритроциты, взаимодействия.
Проникновение одноклеточных организмов внутрь клеток других - явление, достаточно широко распространенное у бактерий, простейших и грибов. Около 20 бактериальных таксонов содержат виды, которые являются внутриклеточными паразитами и вызывают такие серьезные заболевания человека и животных, как туберкулез, бруцеллез, дизентерию и др. [7]. В последнее время все чаще можно встретить работы, где описывают нахождение микроорганизмов внутри эритроцитов, например, такие бактерии, как Bartonella bacilliformis [9], B. quintana [9], Streptococcus pneumoniae [11], Mycoplasma suis [10], Staphylococcus epidermidis [8]. У разных бактерий выработались различные типы стратегий взаимодействия с мембраной клетки-хозяина и различные механизмы проникновения внутрь клетки. Разные группы бактерий могут поражать различные типы клеток, в основном эпителиальные, дендритные клетки и макрофаги [7]. Розов С.М. и Дейнеко Е.В. в обзоре представили два механизма проникновения патогенов внутрь клеток, включая неспособных к фагоцитозу (эритроциты) [7]. При проникновении по механизму застежки-молнии
(zipper) происходит тесное связывание бактерий с мембраной клетки-хозяина (эритроцит) и дальнейшее ее скольжение по мембране, которое заканчивается формированием вакуоли, переносящей бактерию внутрь клетки. Триг-герный механизм инвазии запускается бактериальными эффекторами, впрыскиваемыми в цитозоль клетки-хозяина [7]. Нахождение микроорганизмов в крови человека, а также внутри эритроцитов приводит к развитию бактериемии и сепсису с высокой летальностью [10]. Чаще встречаются работы, описывающие роль коагулазонегативных стафилококков, энте-робактерий и других условно-патогенных бактерий в развитии бактериемии [3], [10], причем выделенные гемокультуры представляют собой как моноинфекцию, так и ассоциацию из двух, трех и даже четырех возбудителей [3]. Ранее [8] были получены данные о взаимодействии эритроцитов с клетками S. epidermidis и Escherichia coli, однако, влияние микробов-ассоциантов на процессы взаимодействия бактерий с эритроцитами изучено недостаточно. Целью настоящей работы явилось изучение особенностей взаимодействия эритроцитов с клетками S. epidermidis,
предварительно обработанных экзометаболита-ми микробов-ассоциантов.
Материалы и методы
В данном исследовании использовали штаммы S. epidermidis 7 и 13, отличавшиеся уровнем антигемоглобиновой активности (АнтиНЬА), взятые из рабочей коллекции лаборатории экологии микроорганизмов ИКВС УрО РАН. Штамм S. epidermidis 7 характеризовался высоким уровнем (18,3 г/л) АнтиНЬА, тогда как S. epidermidis 13 - низким уровнем (0,5 г/л) данной активности [2]. Для создания модели ассоциаций микроорганизмов были отобраны ассоцианты (штаммы S.aureus, S.saprophyticus, Escherichia coli, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae и Corynebacterium spp). Бактерии выращивали на Шедлер-агаре (HiMedia, India) при 37 0С в течение 24 ч. Далее в полученные бактериальные взвеси S.epidermidis 7 и 13 (1 млрд. КОЕ/мл) добавляли стерильные супернатанты (экзометаболиты) штаммов-ассоциантов и инкубировали 24 ч при 37 0С. Для изучения процессов взаимодействия бактерий с эритроцитами, в частности, адгезии исследуемых бактериальных клеток S. epidermidis 7 и 13 к эритроцитам и их внутриэритроцитарное проникновение добавляли взвесь эритроцитов. Для этого полученные исследуемые образцы объемом 1 мл отмывали фосфатно-солевым буфером с помощью центрифугирования и смешивали с отмытыми буферным раствором эритроцитами в концентрации 106 кл/мл объемом 0,5 мл. После чего во все пробы добавляли по 1 мл питательной среды RPMI-1640 (ООО «БиолоТ», Санкт-Петербург). В качестве контроля I использовали смесь эритроцитов (0,5 мл) со стафилококками (по 1 мл) в 1 мл среды RPMI-1640; контроль II -эритроциты (0,5 мл) в 1 мл физиологического раствора и 1 мл среды RPMI-1640; контроль III - эритроциты (0,5 мл), 1 мл супернатантов бактерий-ассоциантов и 1 мл среды RPMI-1640. Опытные и контрольные пробы инкубировали в течение 24 ч при 37 0С. Затем исследуемые образцы подготавливали [8] для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), которую проводили на базе Rhodococcus--центра Пермского государственного национального исследовательского университета. Визуализацию клеток эритроцитов осуществляли с по-
мощью микроскопа Olympus FV 1000 (Olympus Corporation, Япония) с использованием 100 х иммерсионного объектива (числовая апертура 1,4). Для возбуждения флуоресценции флюо-ресцеинизотиоцианада и синьки Эванса применяли аргоновый лазер (X = 488 нм) с 505/525-нм барьерным фильтром и гелий-неоновый лазер (X = 543 нм) с 560/660-нм барьерным фильтром, соответственно. Изображения размером 0,12 х 0,12 мм (с разрешением 512 х 512 пикселей) получали с использованием 1,4 мегапиксельной цифровой камеры со скоростью 12,5 нм/пиксель. Обработку полученных изображений осуществляли с помощью программ FV10-ASW 3.1 (Olympus Corporation, Япония). Адгезивную активность клеток S. epidermidis 7 и 13 определяли по аналогии с фагоцитарным показателем [6], а внутриэритроцитарное расположение рассчитывали по формуле фагоцитарного числа [6].
Полученные результаты статистически обработали c вычислением средней арифметической (M); стандартной ошибки (m). Для установления доказательности различий (р) использовали критерий значимости (t) Стьюдента, различия считались значимыми (достоверными) при р<0,05 [5].
Результаты и обсуждение
В результате работы было выявлено, что самый высокий процент адгезии к эритроцитам оказался у клеток S. epidermidis как с высоким, так и с низким уровнем АнтиНЬА, обработанных экзометаболитами S.aureus, что составило 40,3±2,8 и 32,5±2,4 (%). Под действием экзоме-таболитов C.albicans и K.pneumoniae наблюдали усиление в 2,5 раза адгезивной активности штамма S. epidermidis 7 к эритроцитам, чем штамм S. epidermidis 13, что составило 31,7±2,3 и 28,5±2,2 (%) против 13,5±1,6 и 11,6±1,5 (%) соответственно. Под действием экзометаболитов S.saprophyticus, E.coli (рис. 1) и Corynebacterium spp. у клеток S.epidermidis 7 и 13 наблюдали снижение показателей адгезии к эритроцитам, даже ниже контрольных значений.
Аналогичные результаты были получены при изучении внутриэритроцитарной локализации клеток S. epidermidis 7 и 13, обработанных экзометаболитами S.aureus (рис. 2) и C. albicans. Необходимо отметить, что под действием эк-
Щуплова Е.А._Роль
Рисунок 1 - КЛСМ-изображения эритроцитов с адгезированными клетками 5. ергйетшЫгз 7, обработанными экзометаболитами ассоцианта Е.еоИ". 'Примечание: Клетки, светящиеся красным цветом (синька Эванса) - эритроциты, зеленым (флюоресцеинизотиоцианад) - стафилококки
-ассоциантов в процессах взаимодействий...
Рисунок 2 - КЛСМ-изображения эритроцитов с расположенными внутри клетками 5. ерЫетшгйк 13, обработанными экзометаболитами ассоцианта Б.аитеж"
'Примечание: Клетки, светящиеся красным цветом (синька Эванса) - эритроциты, зеленым (флюоресцеинизотиоцианад) - стафилококки. Белые линии на КЛСМ-изображении соответствуют графикам флюоресцентных сигналов (слева и сверху)
зометаболитов патогенного штамма S.aureus, в эритроцитах наблюдали до четырех кокков, что ранее не было отмечено.
Клетки S. epidermidis 7 с высоким уровнем АнтиНЬА, обработанные экзометаболитами S.saprophyticus и E.coli в 1,5 раза реже проникали в эритроциты, чем обработанные суперна-тантом S.aureus. Штамм S. epidermidis 13, обработанный экзометаболитами S.saprophyticus в 3,2 раза реже наблюдали внутри эритроцитов, чем клетки, обработанные супернатантом S.aureus и в контроле. Необходимо отметить, что после обработки клеток S. epidermidis 7 и 13 экзометаболитами Corynebacterium spp. внутри эритроцитов их не обнаружили.
Заключение
Таким образом, полученные результаты в данном исследовании показали, что межмикробные взаимодействия оказывают разнонаправленное влияние на процессы адгезии и проникновения в эритроциты. После воздействия экзометаболитами условно-патогенных штаммов таких, как S.saprophyticus, E.coli и Corinebacterium spp. на клетки стафилококков выявили понижение их адгезивной активности
к эритроцитам, а также внутргоритроцитарную локализацию. Под действием экзометаболитов C.albicans и K.pneumoniae, напротив, наблюдали усиление адгезии к эритроцитам, причем только одного штамма S.epidermidis 7 - с высоким уровнем антигемоглобиновой активности. Необходимо отметить, что экзометаболиты патогенного штамма 8.аигеш значительно повышали не только адгезию клеток X epidermidis как с высоким, так и с низким уровнем АнтиНЬА, но и наблюдали более частое их внутриэри-троцитарное проникновение. Под действием экзометаболитов Corynebacterium spp. внутриэ-ритроцитарного проникновения клеток стафилококков не обнаружено. Полученные данные нашли подтверждение в работах других авторов [1], [4].
Коэволюция прокариот и эукариотических организмов привела к возникновению большого числа бактериальных факторов, способных манипулировать функциями хозяина. В конечном итоге, относительно простые микроорганизмы разработали сложные, порой изощренные стратегии проникновения в клетку организма человека, выживания в ней и пере страивания клетки под свои нужды [7].
06.10.2017
Список литературы:
1. Ассоциативный симбиоз. / О.В. Бухарин [и др.] Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 264 с.
2. Бухарин, О.В. Определение антигемоглобиновой активности микроорганизмов / О.В. Бухарин, Б.Я. Усвяцов, Е.А. Ханина // Патент РФ № 2262705 - C. 2.
3. Каргальцева, Н.М. Полимикробность гемокультур - современная тенденция в этиологии инфекции кровотока / Н.М. Каргаль-цева, В.И. Кочеровец, А.М. Иванов // Инфекционные болезни и антимикробная терапия. - 2012. - Т. 56. - № 1. С. 56-61.
4. Значимость факторов патогенности условно-патогенных микроорганизмов при оценке их этиологической роли в развитии заболевания / Е.С. Кунилова [и др.] // Инфекция и иммунитет. - 2012. - Т. 2. - № 4. - С. 699-704.
5. Ланг, Т.А. Как описывать статистику в медицине. Аннотированное руководство для авторов, редакторов и рецензентов / Т.А. Ланг, М. Сесик / пер. с англ. под ред. В.П. Леонова. М. Практическая медицина, 2011. - 245 с.
6. Карпищенко, А.И. Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. проф. А.И. Карпищенко. С-Пб. Интермедика, 1999. - 656 с.
7. Розов, С.М. Бактериальные внутриклеточные патогены: стратегии нападения и защиты / С.М. Розов, Е.В. Дейнеко // Успехи современной биологии. - 2015. - Т. 135. - № 5. - С. 464-479.
8. Щуплова, Е.А. Роль биологических свойств Staphylococcus epidermidis во внутриэритроцитарной инвазии и изменении активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов при экспериментальной генерализованной инфекции / Е.А. Щуплова, А.А. Стадников, С.Б. Фадеев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159. - № 1. - С. 79-82.
9. Dechio, C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction / С. Dechio // Cell Microbiol. - 2008. - No. 10(8). - Р. 1591-1598.
10. Marnie Potgieter, J. The dormant blood microbiome in chronic, inflammatory diseases / Marnie Potgieter, J. Bester, D. B. Kell // Microbiology Reviews. - 2015. - Vol. 13. - No. 39. - Р. 567-591.
11. Streptococcus pneumoniae invades erythrocytes and utilizes them to evade human innate immunity / M. Yamaguchi [et al.] // PLoS One. - 2013. - No. 8. - Р. 77282.
Сведения об авторе:
Щуплова Елена Алексеевна, старший научный сотрудник лаборатории экологии микроорганизмов Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН,
кандидат биологических наук 460000, г Оренбург, ул. Пионерская, 11; тел. 8 (3532) 77-54-17, e-mail: Khanina83@yandex.ru
