CC BY
170
УДК 543.9 + 543.38
МОДИФИКАЦИЯ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА УФ-ОБЛУЧЕНИЕМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРОВ
Л.Д. Асулян, А.С. Гавриков, В.А. Арляпов, В.А. Алферов
Проведена модификация поливинилового спирта (ПВС) сшивкой полимерных цепей ультрафиолетовым облучением (УФ-облучением), приводящая к образованию сетчатой структуры. Изучено влияние концентрации раствора ПВС и продолжительности облучения на характеристики полимера. Получен стабильный рецепторный элемент иммобилизацией дрожжевых клеток Debaryamyces hansenii в модифицированный полимер и его основные характеристики при определении индекса биохимического потребления кислорода.
Ключевые слова: полимер, поливиниловый спирт, УФ-облучение, иммобилизация, дрожжи Debaryamyces hansenii, биорецепторный элемент, биосенсор, индекс биохимического потребления кислорода (БПК).
Введение
Биологические и химические сенсоры применяются для контроля окружающей среды, для оценки уровня промышленных загрязнений в воздухе и воде, для контроля безопасности производств, в клинической диагностике и во многих других областях. В целом, биосенсоры можно включить в список тех высокотехнологичных устройств, которые в настоящее время активно разрабатываются.
Основой микробных биосенсоров являются иммобилизованные клетки микроорганизмов [1]. В качестве носителей для иммобилизации микроорганизмов широко используются полимерные материалы на основе ПВС [2], так как гидрогели поливинилового спирта макропористые, вязкоупругие и представляют собой слабосшитые сетки, способные сорбировать и удерживать большое количество жидкости и реагировать на незначительные изменения внешних параметров.
Целью данной работы является модификация поливинилового спирта под действием УФ-облучения, изучение влияния концентрации раствора ПВС и продолжительности облучения на характеристики полимера и создание стабильных рецепторных элементов биосенсоров на основе полученного материала.
Экспериментальная часть
Модификация ПВС УФ-облучением. Облучение проводили УФ-лампой с длиной волны А= 254. Для этого 5 мл 5-10% водного раствора ПВС (М = 78000, марка 16/1) переносили в чашку Петри диаметром 9 см и
облучали в течение 15-60 минут на расстоянии 10 см в присутствии атмосферного кислорода.
Определение вязкости раствора поливинилового спирта.
Анализ проводили методом капиллярной вискозиметрии. Измерения вязкости проводились на вискозиметре ВПЖ-2. Экспериментально определяли относительную вязкость как отношение времени истечения раствора полимера ко времени истечения растворителя по известной методике [3]:
Лоты t/to
Потн . - относительная вязкость;
t и to - время истечения раствора полимера и растворителя.
Определение доли сшитого полимера в пленке модифицированного поливинилового спирта. Определение доли сшитого полимера проводили методом экстракции. Образец пленки взвешивали, заливали водой и перемешивали в течение 4-6 часов при t = 50-60°C, затем воду сливали, а набухшую пленку сушили до постоянной массы [4]. Опыт повторяли несколько раз до постоянной массы образца.
Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штамма Debaryamyces hansenii BKM Y-2482 были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (г. Пущино). Дрожжи выращивали на богатой минеральной среде следующего состава: глюкоза -
3 3 3
10 г/дм , пептон - 5 г/дм , дрожжевой экстракт - 0,5 г/дм (Sigma, США). Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении 101,325 кПа и температуре 121 0C в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см при температуре 29°С.. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре 10 минут (10000 об/мин) и промывали центрифугат 20 мМ фосфатным буфером, рН 6,8. Осевшие клетки переносили в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 10000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре 25°С.
Иммобилизация дрожжевых клеток в гидрогель ПВС. Микропипеткой отбирали необходимое количество раствора модифицированного ПВС и добавляли в него дрожжевые клетки D. hansenii (20 мг биомассы на 100 мкл ПВС). Для равномерного распределения клеток в полимере проводили встряхивание в течение 5 минут на центрифуге «Sky Line». 200 мкл полученной смеси переносили в блистерную упаковку d = 6-8 мм и высушивали на воздухе до полного высыхания в течение 24 часов. Полученные рецепторные элементы хранили в сухом виде в холодильнике (+4°С). Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и закрепляли с помощью фиксатора.
Иммобилизация клеток адсорбцией на стекловолоконном фильтре. Выращенные клетки микроорганизмов промывали фосфатным буферным раствором (20 мМ, pH 6,8), центрифугировали (2000 об/мин, 10 мин), осадок сырой массы клеток взвешивали и разбавляли определённым количеством раствора буфера до концентрации 150 мг/см3. Полученную смесь наносили на пористый стекловолоконный фильтр (Whatman GF/A, Sigma) в объеме 0,003 см . Рецепторный элемент размером 3x3 мм подсушивали на воздухе в течение 15 мин при 200 C. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и закрепляли с помощью фиксатора.
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием рН-метр-иономер-БПК-термооксиметра ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (ООО «Эконикс-эксперт», Россия), сопряженного с персональным компьютером, работающим под управлением специализированного программного обеспечения EXP2PR (ООО «Эконикс-эксперт», Россия). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения концентрации кислорода при добавлении субстратов (мг/дм -мин). Датчиками являлись кислородные электроды типа Кларка с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (рН = 6,8), концентрация солей в котором составляла 20 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема (200 - 1000 мкл, 20 - 200 мкл, 0.5 - 10 мкл, Biotech, США).
Результаты и обсуждение
Поливиниловый спирт широко используется для иммобилизации микроорганизмов в виде криогеля или пленок, полученных УФ-облучением суспензии клеток в растворе ПВС, или путем сшивки полимерных цепей с использованием различных сшивающих агентов, например N-винилпироллидона [5]. Однако указанные способы иммобилизации имеют ряд недостатков, а именно - при получении криогеля путем глубокой заморозки часть клеток теряет свою активность, так же как и при УФ-облучении. Использование сшивающих агентов часто осложняется их труднодоступностью и нередко приводит к усложнению технологии получения гидрогеля.
Ранее сообщалось о получении сетчатого ПВС при использовании в качестве инициатора радикальной сшивки нитрата церия (IV) аммония [6]. В настоящей работе предлагается провести модификацию ПВС УФ-облучением до введения в раствор полимера микроорганизмов, что позволит сохранить их жизнеспособность и отказаться от применения дорогостоящего катализатора.
Процессы, приводящие к сшивке макромолекул ПВС при УФ-
облучении, достаточно хорошо изучены [7]. ПВС, полученный из
поливинилацетата, содержит некоторое количество ацетатных и
карбонильных групп, которые при облучении светом с длиной волны 254
нм легко переходят в возбужденное состояние. Реакция протекает по
радикальному механизму, и приводит к разрыву цепи.
о
«ллл СН2-С-СН2»лл/
чЛллСН2-С •
СН9*лл,
(1)
Н2С«лл^ + СО
Свободные радикалы, образующие по реакции (1), взаимодействуют с макромолекулой поливинилового спирта, образуя макрорадикалы:
чЛЛЛСН2-СН3+*Л/СН2-С^АААГ (2)
^ЛЛЛСН2 + ЧААЛСН2-СН^ЛАА
ОН
ОН
Так как облучение проводили в открытой емкости в присутствии
атмосферного кислорода, макрорадикалы с высокой скоростью
взаимодействуют с кислородом, образуя гидропероксиды:
о—о-
«ЛЛАСН2—С-СН2—СН-ЛЛА + 02—►>лллСН2—С-СН2—СН*ллл
чЛАдСНг-С-СН2-СН^ллл + <лллСН2-СН^ллл
о—ОН
»лллСН2-С-СН2-СН^ллл + *л/\л.СН2-С^лллл
ОН ОН ОН
Свет инициирует распад гидропероксидов:
(3)
(4)
о-ОН
лад СН2-С-СН2>л^г
О •
«лллсн2-С-СН2лл/
(5)
*лллсн2—СИ-СН2*лл/ + НО- —► члллсн2—С-СН2^лл/ + цо
(6)
он он
Далее в результате бимолекулярного обрыва цепи возникают углерод-углеродные и углерод-кислородные сшивки, приводящие к образованию сетчатого полимера:
2 лла сн2—с-СН2»л/\/
он
(7)
«АЛЛ сн2-С-СН2*/\/\/
н ■
чллл СН2-С-СН2»ЛА/ + ^ЛААСН2-С
О
-СН2*лл/
^ЛАА СН2-С-СН2^лл/
(8)
^ЛААСН2-С-
Н
-СН2^ал/
О степени сшивки судили по изменению вязкости раствора, которую определяли методом капиллярной вискозиметрии, как отношение времени истечения раствора полимера ко времени истечения растворителя [3] (табл. 1).
Как следует из представленных на рис. 1 данных, вязкость растворов (5-10%) монотонно увеличивается при увеличении содержания ПВС и продолжительности облучения (15 - 60 мин). Причем, в более концентрированных растворах продолжительность облучения в меньшей степени влияет на вязкость, а, следовательно, на процессы сшивки. Данный факт можно объяснить проявлением гель-эффекта, наблюдаемого при полимеризации в вязких растворах. Бимолекулярный обрыв цепи при взаимодействии радикалов в вязкой среде определяется скоростью диффузии активных центров друг к другу. При сравнительно высокой вязкости полимерные радикалы не обладают достаточной подвижностью
для того, чтобы в результате рекомбинации радикалов произошла сшивка макромолекул [8].
Таблица 1
Экспериментальные данные по определению относительной вязкости
растворов полимера
Концентрация ПВС, % Время облучения, мин
0 15 30 45 60
5 22,6±0,1 25,33±0,03 29,8±0,1 31,8±0,5 32,04±0,02
6 33,07±0,04 34,01±0,01 35,8±0,7 36,2±0,9 39,06±0,04
7 40,1±0,07 42,9±0,08 43,07±0,01 44,6±0,5 45,2±0,3
8 47,09±0,01 48,09±0,02 50,3±0,6 51,02±0,01 55,1±0,5
9 56,9±0,5 57,9±0,4 58,08±0,03 59,6±0,4 60,9±0,8
10 62,81±0,02 63,4±0,5 64,9±0,8 65,1±0,8 66,9±0,1
80 1 70 -60 -50 -40 30 -20 10 О
15 30 45
Время облучения, мин
ч? \ N Ч
X —
ч ч ч ч ч ч ч
60
□ 5% К 6% 07% £3 8% Ш9% ■ 10%
Рис. 1. Зависимость относительной вязкости растворов ПВСразной концентрации от времени облучения
Для доказательства сетчатой структуры полимерного материала, была определена доля сшитого полимера в пленках, полученных при высушивании облученных растворов, методом экстракции. Известно, что линейные полимеры, к каким относится ПВС, растворяется в воде [9], а сетчатые склонны к ограниченному набуханию без растворения. Образец пленки взвешивали, заливали водой и перемешивали в течение 4-6 часов, при 1 = 50-60° С, затем воду сливали, а набухшую пленку сушили и взвешивали. Опыт повторяли несколько раз до постоянной массы высушенного образца [4].
Таблица 2
Экспериментальные данные для расчета доли сшитого полимера
в массе пленки ПВС
Концентрация Время облучения, мин
ПВС, % 0 15 30 45 60
5 - - - 51,30±0,01
6 - - - 55,4±0,1 58,3±0,3
7 - - 59,3±0,1 60,1±0,4 61,9±0,1
8 - - 63,2±0,3 64,60±0,01 65,4±0,2
9 - 66,10±0,06 66,5±0,3 67,9±0,3 68,10±0,04
10 - 69,8±0,3 70,1±0,2 71,5±0,4 72,6±0,1
*)---
'«-»- растворяются в воде
80
70 -
60
5я.
X 50 -
а
з
3 40
о;
^ о 30 -
20
10
0
□ 5
□ б В 7 ЕЗ
шэ
■ 10
15 30 45
Время облучения, мин
60
Рис 2. Зависимость доли сшитого полимера от времени облучения
Полученные данные по доле сшитого полимера говорят о том, что необлученные растворы ПВС дают растворимые в воде пленки. Причем для получения нерастворимого полимера из 10% раствора достаточно проводить облучение в течение 15 минут, а разбавленные растворы необходимо облучать более продолжительное время, например, 5% раствор, только при облучении в течение часа образует нерастворимый полимер.
Полученные УФ-облучением гидрогели, образующие не растворимые в воде пленки, были испытаны в качестве носителей для иммобилизации микроорганизмов. При этом оказалось, что рецепторные элементы, сформированные на основе гидрогелей, содержащих более 51% доли сшитого полимера, обладают низкой долговременной стабильностью или вовсе не дают отклика на органические субстраты. Это можно
объяснить тем, что увеличение доли сшитого полимера приводит к образованию вязко-упругого гидрогеля, размер пор в котором не позволяет иммобилизовать микроорганизмы методом включения.
Время облучения, мин.
Рис. 3. Зависимость долговременной стабильности полученных биорецепторов от времени облучения полимера при определении глюкозо-глутаматной смеси (ГГС)
По результатам проведенных исследований для дальнейшей работы был использован гидрогель на основе 5% ПВС, облученного в течение 60 минут, содержащий около 51% сшитого полимера.
Иммобилизацией дрожжевых клеток ВвЬагуатусв8 Иатвпи в полученный гидрогель был сформирован рецепторный элемент биосенсора для определения индекса биологического потребления кислорода (БПК-биосенсора).
Оценка субстратной специфичности иммобилизованных микроорганизмов была проведена по 31 субстрату, включая спирты, углеводы и карбоновые кислоты и т.д. Для проведения эксперимента использовались растворы субстратов одинаковой концентрации (0,1 моль/дм ), за 100% принимался ответ биосенсора на этанол. Результаты представлены на рис. 4.
Из данных, приведенных на рис. 4, видно, что микроорганизмы обладают высокой окислительной активностью по отношению к этанолу, глюкозе и глутаминовой кислоте. Величина отклика на спирты уменьшается по мере увеличения длины углеводородного радикала и степени его разветвления, что, по-видимому, объясняется особенностями ферментной системы выбранных дрожжей. Величина отклика на углеводы уменьшается при переходе от альдоз (глюкоза) к кетозам (фруктоза). Окисление дисахаридов (сахароза и лактоза) проходит менее интенсивно, чем моносахаридов. Надо отметить, что иммобилизация дрожжей
Debaryomyces Иатепи в пленку ПВС, модифицированного УФ-облучением, практически не изменяет их субстратную специфичность по сравнению с наиболее щадящим методом иммобилизации - адсорбцией на стекловолокном фильтре.
100 -
30 -60 -40 -20 -
Г|]||Ц|
■ иммобилизация в матрицу из ПВС
о адсорбция на стекловолокон ном фильтре
»I 1||1|.1|||Н
11111111 И1IIIIIIII IIIIIIIIIIIIIII,.
******* %*//**/ *
V ¿г*/'
\
/
Рис. 4. Портрет субстратной специфичности дрожжей БеЬагуотусе8 Натени, иммобилизованных адсорбцией на стекловолоконном фильтре
и в пленку модифицированного ПВС
Все характеристики биорецепторного элемента были определены для глюкозо-глутаматной смеси (ГГС), так как её применение как стандарта при анализе индекса БПК предусмотрено федеративными природоохранными нормативными документами [10].
Метрологические и аналитические характеристики полученного рецепторного элемента и БПК-биосенсора на основе дрожжей D. Натепи (полимер I) в сравнении с ПВС, модифицированным N винилпироллидоном (полимер II), и сшивкой в присутствии нитрата церия (IV) аммония в качестве инициатора радикальной сшивки (полимер III) приведены в табл. 3.
Как следует из данных, приведенных в таблице 3, биорецепторный элемент на основе гидрогеля ПВС, модифицированного УФ-облучением (полимер I), обладает более высокой долговременной стабильностью - 43 сутки, по сравнению с другими (30 и 36 суток). Операционная стабильность, характеристикой которой является относительное стандартное отклонение по 10 последовательным измерениям, имеет промежуточное значение 2,5 % между сравниваемыми биорецепторами (4,2 для полимера II и 1,0 для полимера III). Коэффициент чувствительности, характеризующий скорость развития отклика
биосенсора при введении субстрата, для рецепторного элемента на основе полимера I снижается по сравнению с другими (0,0011 с-1). Возможно, в полимере, полученном УФ-сшивкой цепей, размер пор меньше и активные центры фермента менее доступны. По этой же причине, вероятно, нижняя граница определяемых содержаний субстрата для полимера I выше (1,6
3 3 3
мг/дм ), чем для полимеров II (0,7 мг/дм ) и III (0,5 мг/дм ).
Таблица 3
Сравнительная характеристика биосенсоров и рецепторных элементов на основе гидрогелей поливинилового спирта, модифицированного разными способами, при определении содержания _глюкозо-глутаматной смеси (ГГС)__
Характеристики Полимер I Полимер II [11] Полимер III [6]
Относительное стандартное
отклонение по 10 2,5 4,2 1,0
измерениям, %
Долговременная стабильность, сутки 43 30 36
Коэффициент чувствительности, с-1 0,0011±0,0003 0,25±0,02 0,15±0,01
Нижняя граница
определяемых содержаний, мг/дм3 1,6 0,7 0,5
Продолжительность одного измерения, мин. 5-7 5-7 5-7
Тем не менее, несмотря на снижение некоторых показателей, биосенсоры с рецепторными элементами на основе ПВС, модифицированного УФ-облучением, могут быть с успехом использованы при определении индекса БПК, так как имеют низкую границу определяемых содержаний и высокую долговременную и операционную стабильность.
Таким образом, проведенные исследования показали, что модификация поливинилового спирта в результате УФ-облучения позволяет получать гидрогель для иммобилизации микроорганизмов с целью получения стабильных биорецепторных элементов, используемых в БПК-биосенсорах, отказавшись от сшивающего агента - N винилпирролидона, производство которого в России прекращено, и дорогостоящего инициатора радикальной сшивки.
Выводы
1. Показано, что УФ-облучение растворов ПВС позволяет получить сетчатый полимер, пригодный для иммобилизации микроорганизмов, без использования К-винилпирролидона в качестве сшивающего агента и без инициатора нитрата церия (IV) аммония.
2. Показано, что биорецепторные элементы на основе ПВС, модифицированного УФ-облучением, обладают более высокой долговременной стабильностью по сравнению с биорецепторами на основе гидрогеля ПВС, полученного под действием инициатора радикальной сшивки или модифицированного К-винилпирролидоном.
3. Биосенсоры с рецепторными элементами на основе ПВС, модифицированного УФ-облучением, могут быть с успехом использованы при определении БПК, так как имеют низкий предел обнаружения органических примесей и обладают высокой долговременной и операционной стабильностью.
Список литературы
1. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода / Понаморева О.Н., Арляпов В. А., Алферов В. А. [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №1. С. 5-15.
2. Иммобилизация клеток 01исопоЬас1ег охуёаш для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров / Арляпов В. А., Асулян Л. Д., Блохин И. В. [и др.] // Изв. ТулГУ. Сер. «Химия». 2006. Вып. 6. С. 137-144.
3. Выдрина Т.С. Химия и физика высокомолекулярных соединений. Методические указания для выполнения лабораторного практикума по дисциплине «Химия и физика высокомолекулярных соединений». Екатеринбург: УГЛТУ. 2014. 30с.
4. Рабек Я. Экспериментальные методы в химии полимеров: в 2-х частях. Пер. с англ. М.: Мир. 1983. 384 с.
5. Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора, иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter Oxydans в плёнку из поливинилового спирта, модифицированного К-винилпирролидоном / В.А. Алфёров, Н.М. Филатова, Л.Д. Асулян [ и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. Вып. 1. 2011. С. 210-220.
6. Получение стабильных рецепторных элементов на основе гидрогеля поливинилового спирта для создания БПК-биосенсора / Л. Д. Асулян, О. А. Камаева, В.А. Арляпов [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. Вып. 1. 2016. С. 37-45.
7. Валиева А.Ф. Кинетика и механизм окисления поливинилового спирта в водной среде: автореферат дис. ... канд. хим. наук. Уфа, 2007. 23 с.
8. Семчиков Ю.Д. Высокомолекулярные соединения: Учеб. для студ. учреждений высш. проф. образования / Юрий Денисович Семчиков. 5-е изд., стер. М.: Издательский центр «Академия». 2010. 368 с.
9. Бойко В.В. Синтез поливинилового спирта в водно-спиртовых средах: дис... канд. хим. наук. М., 2004. 112с.
10. ПНД Ф 14.1:2:3:4.123-97 Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде после n-дней инкубации (БПК полн.) в поверхностных пресных, подземных (грунтовых), питьевых, сточных и очищенных сточных водах.
11. BOD biosensor based on the yeast Debaryomyces hansenii immobilized in poly (vinylalcohol) modified by N-vinylpyrrolidone / V.A. Arlyapov, N.Yu. Yudina, L.D. Asulyan [и др.] // Enzyme and Microbial Technology. 2013. V.53. P. 257-262.
Асулян Людмила Дмитриевна, канд. хим. наук, доц., asuljan@,rambler.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Гавриков Андрей Сергеевич, магистрант, andrejj-gavrikov2@rambler.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., v.a.arlyapov@gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Алферов Валерий Анатольевич, канд. хим. наук, проф., директор, chem.@,tsu.tula.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
THE USE OF ULTRAVIOLET RADIATION FOR MODIFYING THE POLYVINYL ALCOHOL USED IN THE RECEPTOR CELL BIOSENSORS
L. D. Asulyan, A. S. Gavrikov, V.A. Arlyapov, V.A. Alferov
Modification of polyvinyl alcohol (PVA) was carried out by cross-linking the polymer chains with ultraviolet irradiation (UV-radiation), which led to the formation of a network structure. The effect of the concentration of the PVA solution and the duration of irradiation on the characteristics of the polymer was studied. A stable receptor element was obtained by immobilization of the yeast cells of Debaryamyces hansenii into a modifiedpoly-mer and its main characteristics in determining the index of biochemical oxygen consumption.
Keywords: polymer, polyvinyl alcohol, UV-radiation, immobilization, yeast Deba-ryamyces hansenii, bioreceptor element, a biosensor, an index of biochemical oxygen demand (BOD).
Asulyan Lyudmila Dmitrievna, candidate of chemical sciences, docent, asuljan@rambler.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Gavrikov Andrey Sergeevich, graduate student, andrejj-gavrikov2@rambler.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, docent, v.a.arlyapov@gmail.com, Russia, Tula, Tula State University,
Alferov Valeriy Anatolievich, candidate of chemical sciences, professor, director, chem.@,tsu.tula.ru, Russia, Tula, Tula State University
