CC BY
55
УДК 602
МОДИФИКАЦИЯ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА ФЕРРОЦЕНКАРБАЛЬДЕГИДОМ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРНОГО ЭЛЕМЕНТА МЕДИАТОРНОГО БИОСЕНСОРА
А.М. Крутских, И.И. Демкина, С.С. Казакова
Проведена модификация поливинилового спирта (ПВС) действием ферроцен-карбальдегида, приводящая к образованию циклического ацеталя. Получен стабильный рецепторный элемент иммобилизацией бактерии Gluconobacter oxydans в гель модифицированного ПВС, содержащий ковалентно связанный медиатор. Определены аналитические и метрологические характеристики полученного медиаторного биосенсора.
Ключевые слова: поливиниловый спирт, ферроценкарбальдегид, ацеталь, иммобилизация, бактерии Gluconobacter oxydans, медиаторный биосенсор.
Введение
Амперометрические биосенсоры - самый распространенный и успешный в плане коммерциализации класс приборов биомолекулярной электроники. Основой микробных биосенсоров являются иммобилизованные клетки микроорганизмов. Значительный прогресс в создании амперометрических биосенсоров стал возможен благодаря использованию веществ, способных к переносу электронов от активных центров ферментов на электрод, - медиаторов электронного транспорта [1]. Перспективным классом соединений, применяемым в качестве медиаторов, является ферроцен и его производные [2]. Медиаторы можно добавлять в измеряемый раствор или иммобилизовать на поверхность электрода. Одним из недостатков, сдерживающих развитие биосенсоров на основе иммобилизованных медиаторов, является низкая стабильность таких датчиков. Для преодоления этого недостатка разрабатываются проводящие полимеры, модифицированные медиаторами [3].
Целью настоящей работы является получение полимерной матрицы ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом, для создания амперометрического медиаторного биосенсора на основе бактерий Gluconobacter oxydans.
Экспериментальная часть
Реактивы и материалы. Для получения полимерной матрицы использовали ПВС марки 16/1 (М=78000) и ферроценкарбальдегид («Aldrich», Германия).
Для культивирования бактерий Gluconobacter oxydans использовали D-сорбит («Sigma», США); дрожжевой экстракт («Oxoid Ltd.», Великобритания).
Для изготовления угольно-пастовых электродов использовали графитовую пудру (Fluka, Германия), парафиновое масло («Fluka», Германия), диализную мембрану («Roth», Германия).
Модификация ПВС ферроценкарбальдегидом. 5 %-й водный раствор ПВС помещали в чашку Петри и облучали УФ-лампой с длиной волны X = 254 нм в течение 60 минут с расстояния 10 - 20 см в присутствии атмосферного кислорода.
Полученный раствор переносили в круглодонную трехгорлую колбу объемом 100 мл, снабженную мешалкой, термометром и обратным холодильником и добавляли к нему в атмосфере аргона концентрированную соляную кислоту (р=1,18 г/см3), а затем 2 %-й раствор ферроценкарбальдегида в этаноле. Реакционную смесь нагревали в токе аргона при перемешивании в течение 4 часов, поддерживая температуру 50-60 °С. Мольное соотношение ферроценкарбальдегид : ПВС варьировали в интервале от 1 : 28 до 1 : 44 (из расчета на одно элементарное звено ПВС). Мольное соотношение ферроценкарбальдегид : HCl во всех опытах было постоянным и равным 1 : 1,5.
Реакционную смесь охлаждали в атмосфере аргона и нейтрализовали добавлением твердого ацетата натрия, а затем удаляли этанол в вакууме. Полученный гель использовали для иммобилизации бактерий и формирования микробного медиаторного электрода.
Спектральный анализ образцов ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом. Гель модифицированного ПВС очищали от низкомолекулярных примесей методом диализа в течение 48 часов. Раствор после диализа переносили в чашку Петри и высушивали на воздухе при комнатной температуре до образования пленки постоянной массы.
Для определения содержания железа в образцах использовали атомно-абсорбционный спектрометр МГА-915М («Люмэкс», Россия). Навеску модифицированного ПВС массой 25 мг растворяли в 3 мл кипящей концентрированной азотной кислоты. Полученный раствор разбавляли в мерной колбе дистиллированной водой до объема 25 мл. Для анализа брали по 10 мкл полученного раствора.
ИК-спектры образцов ПВС и модифицированного ПВС регистрировали в виде пленок с помощью инфракрасного Фурье-спектрометра ФМС 1201 (ООО «Мониторинг», Россия). ИК-спектр ферроценкарбальдегида был получен в таблетке KBr.
Культивирование бактерий Gluconobacter oxydans. Штамм Gluconobacter oxydans subsp. industrius VKMB-1280 был получен во Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН. Клетки выращивали в жидкой среде аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объёмом 500 мл при температуре 28 оС в среде следующего состава: сорбит - 200 г/л, дрожжевой экстракт - 20 г/л, дистиллированная вода - 100 мл. Посевной
материал выращивали аналогично 24 часа. Биомассу собирали центрифугированием при комнатной температуре на центрифуге T30 (Россия) при 4500 об/мин 15 минут и отмывали от культуральной среды двукратно 20 мМ фосфатным буфером, рН 6,0. Осевшие клетки ресуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 3 минуты при 12000 об/мин. Полученные осадки в микропробирках подсушивали на воздухе в течение часа и замораживали для длительного хранения при температуре -15°С. Массу всех порций биомассы регистрировали.
Иммобилизация бактерий Gluconobacter oxydans в гель ПВС, модифицированный ферроценкарбальдегидом. К гелю модифицированного ПВС объемом 100 мкл добавляли 20 мг биомассы. Для равномерного распределения клеток в полимере проводили встряхивание в течение 5 минут на центрифуге «Sky Line». Полученную смесь переносили в блистерную упаковку d = 6-8 мм и высушивали на воздухе в течение 24 часов. Полученные рецепторные элементы хранили в холодильнике при 4 °С.
Формирование электрода. Микробный биосенсор формировали, наполняя пастой «графитовая пудра-минеральное масло» пластиковую трубку. Пластиковая трубка содержала серебряную проволоку для электрического контакта с частицами графита. Пасту готовили смешением 100 мг графитовой пудры с 40 мкл парафинового масла. На поверхность электрода с помощью клея высокой проводимости наклеивали высушенный рецепторный элемент. Для прочности на поверхность электрода закрепляли диализную мембрану при помощи пластикового кольца.
Регистрация вольтамперных зависимостей. Циклические вольтамперограммы регистрировались при помощи
вольамперометричекого анализатора «Экотест-ВА» (ООО «Эконикс-Эксперт», Россия) по трехэлектродной системе. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод (площадь поверхности ~ 7 мм2) с иммобилизованными клетками бактерий Gluconobacter oxydans, вспомогательным - платиновый электрод. В качестве электрода сравнения использовали насыщенный хлоридсеребряный электрод (Ag/AgCl), относительно которого представлены все значения потенциалов. Циклические вольтамперограммы регистрировали при скорости наложения потенциала 50 мВ/с в калий-натрий-фосфатном буфере (рН 6,0), объем ячейки - 40 мл.
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили при помощи гальванопотенциостата «IPC-micro» (ЗАО «Вольта», Россия). Регистрацию и обработку данных, полученных в результате электрохимических измерений, проводили при помощи персонального компьютера.
Регистрацию ответов сенсора проводили по двухэлектродной схеме. Рабочим электродом служил угольно-пастовый электрод (площадь поверхности ~ 7 мм2) с иммобилизованными клетками микроорганизмов Gluconobacter oxydans, электродом сравнения - насыщенный хлорид-серебряный. Измерения проводили в калий-натрий-фосфатном буфере с рН 6,0 при постоянном потенциале -200 мВ; объем ячейки - 4 мл. Измерения производились при перемешивании раствора на магнитной мешалке (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими пипетками (Biotech, США). Измеряемым параметром сигнала сенсора являлась амплитуда изменения силы тока, определяемая как разность между начальным и конечным значениями токов до и после введения субстрата в измерительную кювету.
Одним из основных направлений химической модификации ПВС является ацеталирование [4-7]. Альдегиды используют как сшивающие реагенты [5, 6], а также при обработке волокон на основе ПВС для придания им необходимых физических свойств [4, 7]. В литературе описана обработка волокна ПВС ферроценкарбальдегидом с целью придания ему электроноионообменных свойств [7].
Сшитые гели ПВС получают при воздействии на водные растворы полимера УФ-излучения и используют для иммобилизации микроорганизмов в рецепторных элементах биосенсоров [8].
В настоящей работе проводили ацеталирование геля ПВС, предварительно сшитого УФ-облучением, действием
ферроценкарбальдегида в водно-спиртовой среде в присутствии HCl по схеме:
В ходе эксперимента варьировали мольное соотношение ферроценкарбальдегид : ПВС в интервале от 1 : 28 до 1 : 44 (из расчета на одно элементарное звено ПВС). Для определения состава и строения модифицированного полимера гель очищали от низкомолекулярных примесей путем диализа и высушивали до образования пленки.
Содержание железа в полученных образцах определяли методом атомно-абсорбционной спектроскопии. Наибольший выход процесса модификации был достигнут при соотношении ферроценкарбальдегид : ПВС : HCl = 1 : 44 : 1,5. Содержание железа в пленке ПВС составило
Результаты и обсуждение
О S
2,4±0,2 %, что соответствует выходу 92 % от теоретического (в расчете на введенный в реакцию ферроценкарбальдегид).
Для подтверждения строения модифицированного ПВС проводили анализ ИК-спектров исходного и модифицированного полимеров, а также модифицирующего реагента - ферроценкарбальдегида. ИК-спектр модифицированного ПВС содержит полосы поглощения в области 11451040 см-1, которые соответствуют колебаниям связей -С-О-С-О-С-ацетальных групп. Сравнение спектров ферроценкарбальдегида и модифицированного полимера показывает отсутствие полосы поглощения 1680 см-1, соответствующей колебаниям карбонильной группы альдегида.
Полученный гель ПВС был испытан в качестве полимерной матрицы для иммобилизации микроорганизмов и медиатора электронного транспорта. Рецепторный элемент был сформирован иммобилизацией бактерий Gluconobacter oxydans в гель на основе модифицированного ПВС с содержанием железа 2,4±0,2 %. Для изучения возможности использования модифицированного ПВС в качестве медиатора электронного транспорта были изучены его окислительно-восстановительные свойства методом циклической вольтамперометрии. Циклическая вольтамперограмма, представленная на рис. 1, демонстрирует термодинамическую обратимость данной системы, о чем свидетельствует две кривые, соответствующих анодному и катодному процессам. Окислению медиатора соответствует анодный пик при 500 мВ. Процесс восстановления характеризуется катодным пиком при потенциале -200 мВ. Вследствие высокого значения анодного потенциала далее ответы сенсора регистрировались при потенциале -200 мВ, который соответствует восстановлению окисленной формы медиатора на катоде.
Важнейшей метрологической характеристикой биосенсора является градуировочная зависимость ответа сенсора от концентрации. Для построения градуировочной кривой была получена зависимость ответа сенсора от концентрации глюкозы, которая представлена на рис. 2. Клетки микроорганизмов рода Gluconobacter содержат мембранолокализованную PQQ-зависимую глюкозодегидрогеназу и являются биорецепторами каталитического типа. Поэтому полученная кривая хорошо аппроксимируется с помощью уравнения Хилла:
у _
где Утах - максимальная скорость ферментативной реакции; [Б] -концентрация субстрата; И - коэффициент Хилла; Км - эффективная константа Михаэлиса.
Рис. 1. Циклическая вольтамперограмма графитово-пастового электрода с бактериями Gluconobacter oxydans, иммобилизованными е гель ПВС, модифицированного ферроценкарбалъдегидом
С,ммоль/дм'
Рис. 2. Зависимость ответов сенсора на основе Gluconobacter oxydans, иммобилизованных в гель ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом, от концентрации глюкозы
Параметры градуировочной кривой представлены в табл. 1. Для сравнительной характеристики полученных результатов в таблице приведены также данные для медиаторного биосенсора с углеродно-пастовым электродом, в котором ферроцен входит в состав пасты рабочего электрода, а биокатализатором служат клетки бактерий Gluconobacter oxydans [9].
Таблица 1
Параметры уравнения градуировочной зависимости медиаторных
биосенсоров на основе Gluconobacter oxydans (субстрат - глюкоза)
Параметр Значения
полученные в работе литературные данные [9]
Эффективная константа Михаэлиса (Км), ммоль/дм3 1,74±0,05 3,9±0,2
Максимальная скорость (Утах), мкА 18,2±0,2 1,06±0,02
Коэффициент Хилла (И) 1,86± 0,07 -
Коэффициент смешанной корреляции 0,9971 -
Как следует из данных таблицы, биосенсор, содержащий рецепторный элемент на основе геля ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом, характеризуется более низким значением константы Михаэлиса и более высокой максимальной скоростью. Значительные различия могут быть вызваны, как влиянием заместителя в ферроценовом ядре на свойства медиатора, так и разными условиями измерений, например, значением потенциала.
Для снижения ошибок анализа использовали линейный участок градуировочной зависимости, ограниченный сверху константой Михаэлиса. Нижняя граница соответствует относительному стандартному отклонению Sr = 0,33. На основе полученной градуировочной зависимости были рассчитаны аналитические и метрологические характеристики медиаторного биосенсора на основе Gluconobacter oxydans, иммобилизованных в гель ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом (табл. 2).
Проведено сравнение полученных результатов с литературными данными для содержащего ферроцен углеродно-пастового электрода [9]. Оба биосенсора демонстрируют близкие значения таких характеристик, как операционная и долговременная стабильность, но отличаются по параметрам, определяющим чувствительность сенсора по отношению к глюкозе.
Таблица 2
Аналитические и метрологические характеристики амперометрических медиаторных биосенсоров на основе _Gluconobacter охучШт ^ (субстрат - глюкоза)_
Параметр Значения
полученные в работе литературные данные [2,9]
Коэффициент чувствительности, мкА-дм3/ммоль 4,5±0,2 0,41
Нижняя граница определяемых концентраций, ммоль/дм3 0,2 0,6
Предел обнаружения, ммоль/дм3 0,06 -
Операционная стабильность, % 4,5 5
Долговременная стабильность, сутки 22 23
Экспрессность, мин 8-12 7
Важной характеристикой медиаторных биосенсоров является субстратная специфичность, от которой зависит возможность определения одного компонента анализируемой смеси независимо от других. В работе проведена оценка субстратной специфичности бактерий Gluconobacter oxydans в условиях электрокаталитического окисления субстратов по 26 субстратам, относящимся к разным классам органических соединений. Для оценки субстратной специфичности регистрировали отклик биосенсора на введение в кювету по 10 мкл раствора субстрата с концентрацией 1М. Результаты измерений приведены на рис. 3.
Анализ субстратной специфичности показывает, что биосенсор имеет узкий спектр определяемых субстратов. Наибольшие ответы генерировались при введении в систему первичных спиртов нормального и разветвленного строения. Биорецепторный элемент не давал ответов на такие спирты, как метанол, 2-метилпропанол-2 и глицерин. Среди моносахаридов эффективно подвергалась биоэлектрокаталитическому окислению только глюкоза. Полученный портрет субстратной специфичности значительно отличается от литературных данных для содержащего ферроцен углеродно-пастового электрода, который демонстрирует меньшую субстратную специфичность и может быть использован для детекции таких моносахаридов, как глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза, а также первичных спиртов нормального строения [2].
Рис. 3. Селективность рецепторного элемента на основе клеток Gluconobacter oxydans, иммобилизованных в гель ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом
Заключение
Разработана методика получения геля ПВС, модифицированного ферроценкарбальдегидом, который может быть использован в качестве полимерной матрицы, содержащей ковалентно связанный медиатор. На основе полученного геля и бактерий О. oxydans сформирован медиаторный биосенсор, функционирующий при потенциале -200 мВ. Определены основные метрологические и аналитические характеристики биосенсора. Показано, что такие характеристики, как долговременная стабильность и операционной стабильность сопоставимы с литературными данными для для содержащего ферроцен углеродно-пастового электрода. Анализ субстратной специфичности показал, что данный биосенсор может быть использован для определения глюкозы и первичных спиртов нормального и разветвленного строения.
Список литературы
1. Понаморева О.Н. Биосенсоры и биотопливные элементы на основе целых клеток микроорганизмов и выделенных из них ферментов: обзор // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2009. Вып. 1. С. 138-157.
2. Микробные сенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемые в качестве медиаторов / Е.Ю. Чигринова [и др.] // Сенсорные системы. 2007. Т. 21. С. 263-269.
3. Полимеры в биологии и медицине / под ред. М. Дженкинса. М.: Научный мир, 2011. 256 с.
4. Розенберг М.Э. Полимеры на основе винилацетата. Л.: Химия, 1983. 176 с.
5. Patel A.R., Vavia P.R. Evaluation of synthesized cross linked polyvinyl alcohol as potential disintegrant // J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 2010. V.13. № 2. P. 114-127.
6. Ямсков И.А., Буданов М.В., Даванков В.А. Гидрофильные носители на основе поливинилового спирта для иммобилизация ферментов // Биоорганическая химия. 1979. Т. 11. № 5. С. 1728-1734.
7. А. с. 348650 СССР. Способ обработки поливинилового спирта и изделий из него / Г.И. Бочков, И.И. Борщев, Л.А. Вольф [и др.]. Опубл. 23.08.1972. Бюл. №25.
8. Модификация поливинилового спирта УФ-облучением для получения рецепторных элементов биосенсоров / Л.Д. Асулян [и др.] // Известия ТулГУ. Естественные науки. 2017. Вып. 1. С. 12-23.
9. Бабкина Е. Е. Кинетические закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий G. oxydans. дис....канд. хим. наук. Тула, 2006. - 129с.
Крутских Анастасия Михайловна, магистрант, nastknit 'a mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Демкина Ираида Ивановна, канд. хим. наук, доц., demkinaii'rambler.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Казакова Светлана Сергеевна, студент, sweta.kazackova2017@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет
MODIFICA TION OF POLYVINYL ALCOHOL WITH FERROCENCARBALDEHYDE FOR OBTAINING THE RECEPTOR ELEMENT OF THE MEDIATOR BIOSENSOR
A.M. Krutskikh, I.I. Demkina, S.S. Kazakova
Modification of polyvinyl alcohol (PVA) by ferrocene carbaldehyde was carried out to form a cyclic acetal. A stable receptor element was obtained by immobilization the bacterium Gluconobacter oxydans into modified PVA gel containing a covalently bound mediator. Analytical and metrological characteristics of the mediator biosensor are determined.
Key words: polyvinyl alcohol, ferrocenicarbaldehyde, acetal, immobilization, bacterium Gluconobacter oxydans, mediator biosensor.
Krutskikh Anastasiya Mikhaylovna, graduate student, nastkruta'amail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Demkina Iraida Ivanovna, candidate of chemical scienc, docent, demkinaii'arambler. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Kazakova Svetlana Sergeyevna, student, sweta.kazackova2017@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University.
