CC BY
311
Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2012. Вып. 3. С. 186-197
Химия
УДК 602.4:628.35:664
Влияние времени культивирования, состава исследуемых проб и условий анализа на окислительную активность дрожжей ВеЬатуотусев Напвепп *
Н. Ю. Юдина, В. А. Арляпов, А. С. Зайцева, А. Н. Решетилов
Аннотация. В работе проведен анализ кривых роста дрожжей DeЪaryomyces hansenii и выявлено оптимальное время культивирования микроорганизмов. Проведена оценка физиологических параметров дрожжей DeЪaryomyces hansenii в зависимости от стадии роста. Определено влияние состава исследуемых проб и условий анализа на окислительную активность дрожжей DeЪaryomyces hansenii. Показано, что биосенсор на их основе устойчив к ингибирующему действию ионов тяжелых металлов — №2+, Ев2+, Ее3+, Си2+, Zn2+, С^+, РЪ2+, Мп2+, Со2+,
Б13+, Бп2+, Н^3+, Сг3+ и Сг202~. Для процессов дыхания дрожжей DeЪaryomyces hansenii, иммобилизованных в поливиниловый спирт, модифицированный М-винилпирролидоном, оптимальным является интервал температур от 15°С до 25°С, и диапазон рН от 6,8 до 7,2. Дрожжи DeЪaryomyces hansenii способны к окислению субстратов при солености среды до 25 %.
Ключевые слова: биосенсор, биохимическое потребление
кислорода, БПК, дрожжи DeЪaryomyces hansenii.
Введение
В природных водоемах всегда присутствуют органические вещества. Степень загрязнения воды органическими соединениями определяют как количество кислорода, необходимое для их окисления микроорганизмами в аэробных условиях. Соответствующий показатель качества воды, характеризующий суммарное содержание в воде органических веществ, называется биохимическим потреблением кислорода (БПК). Стандартный метод определения БПК, регламентированный ПНДФ, основан на тестах,
* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-08-90805-мол_рф_нр) и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», соглашение № 14.B37.21.0561.
продолжительность которых составляет 5 [1]. Альтернативой являются экспрессные методы определения БПК с использованием биосенсорных анализаторов, основанные на применении микроорганизмов, способных окислять широкий спектр органических соединений. Отличием данного метода от стандартного является сокращение времени анализа с 5 суток до 10 - 20 минут.
Для создания биораспознающих элементов БПК-сенсоров используют несколько подходов. Первый — применение чистых культур, обладающих определенными свойствами (широкий спектр окисляемых субстратов, устойчивость к воздействию негативных факторов окружающей среды); второй — использование смеси идентифицированных микроорганизмов (искусственные ассоциации); третий — применение активного ила. БПК-биосенсоры на основе чистой культуры имеют преимущества в стабильности функционирования биосенсорной системы. Применение дрожжей в качестве биокатализаторов является предпочтительным, чем применение бактериальных клеток, поскольку они более устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать длительное время.
Для увеличения стабильности биорецепторного элемента применяют различные методы иммобилизации биоматериала. Эффективные методы получения иммобилизованных клеток связаны с процессами включения их в природные и синтетические гели. В качестве синтетического гелеобразователя используют поливиниловый спирт (ПВС). Данные гели, как правило, обеспечивают высокий уровень диффузии субстратов и продуктов, а также полную невозможность для клеток покинуть матрицу геля. Процесс иммобилизации происходит в мягких условиях, и клетки сохраняют основные физиологические функции, такие как возможность дыхания и синтеза АТФ, способность к биосинтезу белка и регенерации ферментов. Водопроницаемые гели ПВС характеризуются устойчивостью температур до 70-80?С, высокой емкостью (до 10% массы в гелях может составлять масса клеток), высокой проницаемостью для субстратов и продуктов. Однако применение ПВС в качестве основы рецепторного элемента биосенсорного анализатора малоэффективно, так как он образует тонкие пленки с низкой механической прочностью. Новым подходом при иммобилизации микроорганизмов для создания распознающих элементов биосенсоров является использование К-винилпирролидона для модификации ПВС [2]. Использование К-винилпирролидона для модификации ПВС позволяет значительно повысить долговременную стабильность получаемых рецепторных элементов при сохранении высокой чувствительности и широкой субстратной специфичности.
Целью данной работы является изучение влияния времени культивирования, состава исследуемых проб и условий анализа на окислительную активность дрожжей ВеЪатуошусез Наивепп иммобилизованных в
поливиниловый спирт, модифицированный N-винилпирролидоном, в рамках создания БПК-биосенсора.
Материалы и методы
Биосенсорные измерения. Исследования проводились с помощью многофункционального анализатора рН-метр-иономер-БПК-термооксиметр ЭКСПЕРТ-001-4.0.1 (научно-производственная фирма «Эконикс-эксперт», Москва) в режиме «термооксиметр», что позволяло производить непрерывную регистрацию сигнала. Принцип работы микробного сенсора на основе кислородного электрода основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами возрастает их дыхательная активность, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода. Управление прибором и обработка результатов проводилась с помощью встроенной программы «EXP2PR» (научно-производственная фирма «Эконикс-эксперт», Москва). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов.
Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штамма Debaryamyces hansenii BKM Y-2482 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Состав жидкой среды: глюкоза — 10 г/дм3, пептон — 5 г/дм3, дрожжевой экстракт — 0,5 г/дм3 (Sigma, США). Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29°С. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 8000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Осевшие клетки рассуспендировали в свежие порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 8000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -25°С.
Определение ростовых параметров дрожжевого штамма.
Культивирование дрожжей проводили путём перекрывания интервалов времени, в течение которых проводилась оценка оптической плотности. Измерения оптической плотности суспензии проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-103 при длине волны 540 нм и толщине кюветы 1 см относительно кюветы с дистиллированной водой, каждые 2 часа в течение 4 суток.
Получение поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном. Для приготовления поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном к водному раствору ПВС
прибавляли водный раствор нитрата церия-аммония (NH4)2Ce(NÜ3)6 и N-винилпирролидон при постоянном перемешивании.
Иммобилизация клеток Debaryamyces hansenii в модифицированный ПВС. Для формирования рецепторного элемента к 20 мг дрожжей D. hansenii добавляли 100 мкл модифицированного ПВС. Для распределения дрожжей в пленки проводили встряхивание в течение 5 минут на центрифуге «Sky Line». Полученную субстанцию переносили на предметное стекло и оставляли на воздухе до полного высыхания.
Формирование рецепторного элемента. Полученную пленку разрезали на одинаковые части размером 3x3 мм. Биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью капроновой сетки.
Результаты и обсуждение
Характеристика дрожжей Debaryamyces hansenii. Согласно имеющимся данным дрожжи Debaryomyces hansenii обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества [3]. Известно также, что дрожжи D. hansenii устойчивы к высоким концентрациям солей и высокому осмотическому давлению. Представленные особенности позволяют предположить, что эти микроорганизмы могут быть эффективно использованы для разработки БПК-биосенсора, обладающего устойчивостью к воздействию негативных факторов окружающей среды.
Анализ кривых роста дрожжей Debaryamyces hansenii. Кривые роста микроорганизмов регистрировали спектрофотометрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости во времени. В работе получены три кривые роста. Первая, при пересеивании дрожжей с твердой питательной среды в жидкую глюкозо-пептонную среду; вторая, при пересеивание единичной колонии в жидкую питательную среду; третья, при пересеивание с жидкой глюкозо-пептонной среды в новую жидкую среду.
Таблица 1
Фазы роста дрожжей D. hansenii
Фаза роста / Тип питательной среды Твердая- жидкая Твердая-жидкая, единичная колония Жидкая- жидкая
Лаг-фаза 0-14 0-12 0-6
Экспоненциальная фаза 14-24 12-18 6-15
Фаза линейного роста 24-36 18-36 15-27
Переходная фаза 36-62 36-48 27-45
Стационарная фаза 62-80 48-56 45-57
Графическая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени имеет сигмоидальную форму и является типичной кривой роста дрожжевых штаммов. На кривых роста дрожжевых штаммов можно выделить несколько фаз роста.
Из таблицы видно, что при пересеве из питательной глюкозо-пептонной в новую питательную среду идет сокращение индукционного периода (лаг-фазы) на 8 часов в сравнении с пересевом клеточной культуры с агара в питательную глюкозо-пептонную среду. Данное явление можно объяснить отсутствием необходимости адаптации клеток к новой культуральной среде при пересеивании.
При высеве из единичной колонии наблюдается сокращение переходной фазы и более ранний выход на стационар. В дальнейшей работе целесообразно применять пересеивание дрожжей с жидкой глюкозо-пептонной среды в новую жидкую среду.
Изменение физиологических характеристик дрожжей О. Напввпп от стадии роста. Для регистрации изменения физиологических характеристик дрожжей проводили изучение биомассы под микроскопом. Для выполнения анализа производился отбор культуральной жидкости каждые два часа начиная с 14 часов роста. Для лучшей визуализациидрожжей производили окрашивание фуксином. Все работы производили на микроскопе Биомед-6, применяемое увеличение составило 1600 раз.
Рис. 1. Дрожжи D. hansenii культивирование на твердой среде агара — 26 часов (середина линейной фазы роста), увеличение 1600 раз
В экспоненциальной фазе роста не наблюдается слипания дрожжей В. Напвепп. В начале фазы линейного роста происходит увеличение размеров клеток дрожжей БеЪатуошусез Ьапзепгг. Наблюдается слипание и образование пар. Размер дрожжей не однороден. В середине фазы
линейного роста наблюдается дальнейшее увеличение размера клеток и их однородность. Практически все клетки культуры сцеплены между собой. Вначале переходной фазы роста происходит видимая дифференциация клеток по размеру. В начале стационарной фазы размер клеток соответствует размеру дрожжей в середине линейной фазы роста. Наблюдается сильное слипание дрожжей.
Выбор оптимального времени культивирования штамма Ов-Ъагуатусвв Напввпп. Для выбора оптимального времени культивирования дрожжей В. Напвепп была проанализирована зависимость активности рецепторного элемента от стадии роста.
О 10 20 30 40 50 60
Время, часы
Рис. 2. Активность дрожжевого штамма DeЪaryamyces hansenii на разных
стадиях роста
Для выполнения анализа был произведен отбор проб после 14, 18, 22, 30 и 40 часов культивирования. Полученная биомасса была отделена центрифугированием от культуральной жидкости.
Наибольшая активность клеток наблюдается в конце экспоненциальной фазы роста (14 часов) и начале фазы линейного роста (18 часов). В середине фазы линейного роста (22 часа) активность снизилась на 50 %. Активность на стадии переходной фазы и стационарной фазы находится на одном уровне, и составляет лишь 20 % от максимально зафиксированной активности (18 часов).
Влияние рН—среды на окислительную способность дрожжевого штамма. pH среды является одним из факторов, влияющих на активность
клеточных ферментов и чувствительность биорецептора к различным субстратам. В данной работе исследован характер изменения откликов биосенсора при изменении pH от 5,6 до 7,8; нижней и верхней границами возможных pH буферной системы KH2PO4/Na2НPO4. В качестве субстрата была выбрана глюкозо-глютаматная смесь (ГГС), которую применяют в качестве стандарта в Российской Федерации и в международной практике при определении БПК5.
0,6 1----------------------------------------
"г
С[
о1
го
о.
0
Ш
О
pH
Рис. 3. Зависимость ответа сенсора от рН среды
Показано, что максимальный ответ биосенсора на основе дрожжей В. Ьапвепгг наблюдается в интервале рН 6,8-7,2.
Зависимость окислительной активности дрожжей ПеЬатуотусев Напвепп от солености раствора. Из литературных данных известно, что дрожжи ВеЬагуотусев Ьапвепгг выделены из соленых сред, таких как морская вода, концентрированные рассолы, соленая пища. Они относятся к одним из самых галотолерантных видов дрожжей, т.е. они могут расти в среде, содержащей 4 М КаС1 [4].
Соленость среды, прежде всего, влияет на давление внутри клетки. Зависимость ответа сенсора от концентрации КаС1 отражает способность клеток к окислению в средах с высоким осмотическим давлением.
В ходе эксперимента исследована окислительная способность дрожжевого штамма ВеЬагуотусев Ьапвепгг при различных концентрациях КаС1 (от 0,5% до 25%). В качестве субстрата применяли глюкозо-глутаматную смесь (ГГС), концентрация в кювете составила 34,7 мг/дм3. При повышении солености среды происходит незначительное уменьшение концентрации растворенного кислорода.
На полученной диаграмме можно условно выделить три участка. Первый участок при содержании соли от 0,5 % до 2%, второй — от 2% до16%, третий участок — от 16% до 25%.
0,7
2
*2
с[
04
5
ГО
о.
ф
Ш
О
0,0 -I-----1-----1-------1--------1-------1---
0 5 10 15 20 25
Концентрация МаС1 в кювете, %
Рис. 4. Влияние NaCl на окислительную активность дрожжей В. Напввпп
Падение ответа на первом участке составило 23% от первоначально зафиксированных ответов сенсора. При увеличении солености с 2% до 16% наблюдается незначительное снижение величины отклика сенсора. При концентрации соли КаС1 25% отклик понизился до 92%. Два перегиба на зависимости ответа сенсора от концентрации КаС1 можно предположительно объяснить сменой механизма поддержания стабильного внутриклеточного К+/Ка+ коэффициента. Таким образом, можно говорить о наличии у дрожжей В. Напвепп эффективной системы регуляции внутриклеточного осмотического давления.
Зависимость окислительной активности дрожжей от присутствия в системе ионов тяжелых металлов. Ионы тяжелых металлов обладают как бактериостатичным, так и бактерицидным действием. Механизмы их взаимодействия с ферментами различны: замещение физиологически важных катионов и неметаллсодержащих оксианионов в активных центрах ферментов, связывание функциональных сульфидгидрильных групп и др.
Для изучения ингибирующего действия соединений тяжелых металлов была исследована зависимость окислительной способности клеток штамма ВеЬагуотусев Напвепп от присутствия в растворе ионов №2+, Ре2+, Ре3+, Си2+, Zn2+, Сё2+, РЬ2+, Мп2+, Со2+, Б13+, Бп2+, Щ3+, Сг3+ и Сг207_ в диапазоне концентраций превышающих ПДК рыбхозяйственных водоемов от 0 до 100 раз. Измеряемым параметром был ответ сенсора на добавление ГГС в присутствии солей.
Наибольшее влияние на дыхательную активность дрожжей ВеЬатуошуоев Напвепп оказывает присутствие в кювете ионов РЬ2+, Ре3+ и Бп2+ снижении ответов при повышении ПДК в 100 раз составило 72%, 85 и 77 % соответственно. Показано, что уже при таких малых концентрациях
90
80
70
н 50 -
0
О)
1 40
* п
| зо - п /
о
20 - I / ю Г '?• о ИМ , \ хМ ,
Си(11) Сс!(11) РЬ(11) N¡(10 2п(11) Сг(У1) Сг(111) Мп(11) ВОДИ) Ре(11) Ре(111) Со(11) 8п(11)
| □ Превышение ПДК в 10 раз 0 Превышение ПДК в 50 раз □ Превышение ПДК в 100 раз |
Рис. 5. Влияние ионов тяжелых металлов на окислительную активность
дрожжей
солей свинца в кювете (0,06 мг/л) наблюдается снижение ответа в 2 раза. Сильное влияние олова на дыхательную активность дрожжей обусловлено высокой концентрацией данных ионов в кювете (концентрация Бп2+ на порядки превышает концентрацию других исследуемых ионов). Устойчивость отдельных ферментов и активация ферментных систем, ответственных за стресс-метаболизм, может быть одной из возможных причин нечувствительности дрожжей к избытку тяжелых металлов.
При превышении ПДК в 10 раз для всех исследуемых ионов тяжелых металлов, кроме
Ре3+
и РЬ3+, снижение ответов составляет не более 20%, что может свидетельствовать о стресс-устойчивости дрожжей В. Напвепп.
Определение зависимости окислительной активности дрожжей ПеЪатуотусев Напвепп от температуры среды. Температура является важным фактором жизнедеятельности всех дрожжей. Для каждой из различных функций дрожжевых клеток: дыхания, брожения, роста — существуют оптимальные, минимальные и максимальные температурные условия.
В данной работе исследован характер изменения откликов биосенсора при изменении температуры от 5°С до 40°С. Все измерения проводились в термостатируемой ячейке. Изменение температуры в кювете проводили с помощью измерительного датчика (кислородного электрода Кларка).
Показано, что максимальный ответ биосенсора на основе дрожжей В. Напвепп наблюдается в интервале температур от 15°С до 25°С. При понижении температуры до 10°С наблюдается резкое понижение (на 50 % от максимально зафиксированной) дыхательной активности дрожжей В. Напвепп. Это объясняется тем, что при понижении температуры, замедляется броуновское движение, уменьшается скорость диффузии и, следовательно, замедляется процесс образования комплекса между
0,6
о,о -------1--------1-------1--------1-------
0 10 20 30 40 50
Температура, °С
Рис. 6. Зависимость ответа сенсора от температуры
ферментом и компонентами реакции (субстратами). Наибольшее снижение дыхательной активности наблюдается при температуре 40°С (80%), и может быть обусловлено денатурацией белка входящего в состав ферментов дрожжей [5].
Таким образом, для процессов дыхания дрожжей В. Ьапвепгг, иммобилизованных в химически модифицированный ПВС, оптимальным является интервал температур от 15°С до 25°С.
Выводы
В работе проведен анализ кривых роста и оценка физиологических параметров роста дрожжей ВеЬагуотусев Ьапвепгг. Оптимальное время культивирования дрожжей составило 18 часов. Определено влияние состава исследуемых проб и условий анализа на окислительную активность дрожжей ВеЬагуотусев Ьапвепгг. При превышении ПДК в 10 раз для всех исследуемых ионов тяжелых металлов, кроме Рв3+ и РЪ3+, снижение ответов составляет не более 20%, что может свидетельствовать о стресс-устойчивости дрожжей ВеЬагуотусев Ьапвепгг. Для процессов дыхания дрожжей, иммобилизованных в поливиниловый спирт, модифицированный К-винилпирролидоном, оптимальным является интервал температур от 15°С до 25°С, и диапазон рН от 6,8 до 7,2. Дрожжи ВеЬагуотусев Ьапвепгг способны к окислению субстратов при солености среды до 25 %.
Список литературы
1. ПНДФ 14. 1:2:3:4. 123-97. Методика выполнения измерений биохимической потребности в кислороде в пресных, подземных, питьевых, сточных и очищенных сточных водах. М., 1997. 25 с.
2. Получение стабильного рецепторного элемента биосенсора, иммобилизацией бактериальных клеток Gluconobacter oxydans в пленку из поливинилового спирта, модифицированного N-винилпирролидоном / В.А. Алферов [и др.] // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2011. Вып.1. C.210-219.
3. БПК-биосенсор на основе дрожжей Debaryomyces hansenii, иммобилизованных в поливиниловый спирт, модифицированный N-винилпирролидоном / В.А. Арляпов [и др.] // Сенсорные системы. 2012. Т.26, №3. С.246-255.
4. Prista C, Loureiro-Dias M.C., Montiel V., Garcia R. Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii // FEMS Yeast Res 5. 2005. P.693-701.
5. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998. 479 с.
Юдина Наталья Юрьевна (tysia21-05-90@mail.ru), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Арляпов Вячеслав Алексеевич (v.a.arlyapov@gmail.com), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Зайцева Анна Сергеевна (anyuta_zaytseva@mail.ru), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.
Решетилов Анатолий Николаевич, д.х.н., профессор, Институт
биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино.
The influence of cultivation time, the composition of the investigated samples and analysis conditions on the oxidative activity of immobilized yeast Debaryomyces hansenii as part of
a BOD-biosensor
N.Yu. Yudinav, V. A. Arlyapov, A. S. Zaitseva, A.N. Reshetilov
Abstract. In work the analysis the growth curves of yeast Debaryomyces hansenii and identified the optimal time of cultivation of microorganisms. Performed evaluation of physiological parameters yeast Debaryomyces hansenii depending on the stage of growth. Determined the effect of investigated tests and analysis conditions on the oxidative activity of yeast Debaryomyces hansenii. The biosensor is resistant to the inhibitory effects of heavy metals — Ni2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Cd2+, Pb2+, Mn2+, Co2+, Bi3+, Sn2+, Hg3+, Cr3+ h Cr2O2_. For the processes of respiration of yeast Debaryomyces hansenii, immobilized in polyvinyl alcohol, modified N-vinylpyrrolidon, is optimal temperature range from 15°C to 25°C, and the pH range from 6.8 to 7.2. Yeast Debaryomyces hansenii oxidizable substrates in environmental salinity to 25%.
Keywords: biosensor, biochemical oxygen demand, BOD, yeast Debaryomyces hansenii.
Yudina Natal’ya (tysia21-05-90@mail.ru), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.
Arlyapov Vyacheslav (v.a.arlyapov@gmail.com), candidate of chemical sciences, assistant professor, department of chemistry, Tula State University.
Zaitseva Anna (anyuta_zaytseva@mail.ru), student, department of chemistry, Tula State University.
Reshetilov Anatoly, doctor of chemical sciences, professor, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms of RAS, Pushchino.
Поступила 12.09.2012
