CC BY
68
ДОСТИЖЕНИЯ НАУКИ В ПРАКТИКУ
УДК 578.81:579.67
© А.В. Алешкин, Е.О. Рубальский, А.В. Попова, А.Г. Богун, В.И. Евстигнеев, С.Ю. Пчелинцев, С.С. Афанасьев, Э.А. Светоч, Н.В. Воложанцев, В.В. Веревкин, И.А. Киселева, С.С. Бочкарева, 2014
БАКТЕРИОФАГИ В УСЛОВИЯХ ДЛИТЕЛЬНОГО КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук, мастер делового администрирования, главный научный сотрудник, ООО «БиФаг», Россия, 125047, г. Москва, ул. Бутырский Вал, д. 10; главный научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, е-mail: andreialeshkin@googlemail.com.
Рубальский Евгений Олегович, главный специалист, ООО «БиФаг», Россия, 125047, г. Москва, ул. Бутырский Вал, д. 10; аспирант лаборатории прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-961-798-37-53, email: e.o.rubalsky@gmail.com.
Попова Анастасия Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия, 142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск, тел. : (4967) 36-00-79, e-mail: popova_nastya86@mail.ru.
Богун Александр Геннадьевич, кандидат биологически наук, заведующий отделом коллекционных культур, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск, тел.: (926) 330-77-25, e-mail: bogun62@mail.ru.
Евстигнеев Валентин Иванович, кандидат медицинских наук, профессор, первый заместитель генерального директора, ОАО «Биопрепарат», Россия, 127299, г. Москва, ул. Клары Цеткин, д. 4, тел.: (495) 459-91-91, e-mail: biopreparat_1@mail.ru.
Пчелинцев Сергей Юрьевич, доктор медицинских наук, профессор, генеральный директор, ОАО «Институт инженерной иммунологии», Россия, 142380, Московская область, Чеховский р-н, дер. Любучаны, ул. Научная, д. 1, тел.: (495) 996-15-55, е-mail: serg.pch@yandex.ru.
Афанасьев Станислав Степанович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, заместитель директора, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-903-667-20-68, е-mail: afanasievss409.4@bk.ru.
Светоч Эдуард Арсеньевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий отделом молекулярной микробиологии, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия, 142279, Московская область, Серпуховский район, п. Обо-ленск, тел.: (4967) 36-00-79, e-mail: svetoch@obolensk.org.
Воложанцев Николай Валентинович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия, 142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск, тел.: (4967) 36-00-79, e-mail: nikvol@obolensk.org.
Веревкин Владимир Васильевич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов, ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия, 142279, Московская область, Серпуховский район, п. Оболенск, тел.: (4967) 36-00-79, e-mail: lab-mdgip@mail.ru.
Киселева Ирина Анатольевна, научный сотрудник, ООО «БиФаг», Россия, 125047, г. Москва, ул. Бутырский Вал, д. 10; научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-916-397-22-38, e-mail: irina6804@mail.ru.
Бочкарева Светлана Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунобиологических препаратов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-38-03, e-mail: cip1989@gmail.com.
Различные факторы космического полета, гиподинамия, стресс, особенности питания, ограниченность и специфичность микрофлоры на Международной космической станции вызывают дисбиотические нарушения ЖКТ, которые могут провоцировать развитие тяжелых патологических состояний у космонавтов. Пробиотики помогают эффективно скорректировать доклинические проявления дисбаланса микрофлоры, развивающиеся у космонавтов в непривычных условиях обитания. Новый класс пробиотиков - фагобиотики могут быть использованы для улучшения состояния их здоровья. В рамках долгосрочной программы научно-прикладных исследований и экспериментов, планируемых на Российском сегменте Международной космической станции, и космического эксперимента «Бактериофаг» сравнивали фенотипические свойства и проводили полногеномное се-квенирование фагов до, после 1,5 и 3 месяцев хранения на Земле и Международной космической станции. Подтверждена неизменность фенотипических (за исключением концентрации вирусных частиц) и генотипических свойств у всех штаммов бактериофагов в жидкой и лиофилизированной формах, что открывает возможность безопасного и эффективного использования бактериофагов для нормализации дисбиотических состояний у космонавтов в условиях Международной космической станции.
Ключевые слова: бактериофаги, фагобиотики, дисбиоз, титр бактериофагов, полногеномное секвени-рование бактериофагов, длительный космический полет, Международная космическая станция.
BACTERIOPHAGES UNDER THE PROLONG SPACEFLIGHT
Aleshkin Andrey V., Dr. Sci. (Biol.), MBA, Chief Research Associate, BPhage LLC, 10 Butyrskij Val St., Moscow, 125047, Russia, Chief Research Associateof Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: (495) 452-18-16, е-mail: andreialeshkin@googlemail.com.
Rubalsky Evgeniy O., Chief Specialist, BPhage LLC, 10 Butyrskij Val St., Moscow, 125047, Russia, Post-graduate student of Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-961-798-37-53, e-mail: e.o.rubalsky@gmail.com.
Popova Anastasiya V., Cand. Sci. (Biol.), Research Associate of Laboratory of Molecular Diagnostics and Genetically Engineered Preparations, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, 142279, Russia, tel: (4967) 36-00-79, e-mail: popova_nastya86@mail.ru.
Bogun Alexander G., Cand. Sci. (Biol.), Head of Culture Collection Department, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, 142279, Russia, tel: (926) 330-77-25, e-mail: bogun62@mail.ru.
Evstigneev Valentin I., Cand. Sci. (Med.), Professor, First Deputy General Director, Biopreparat JSC, 4 Klari Tsetkin St., Moscow, 127299, Russia, tel.: (495) 459-91-91, e-mail: biopreparat_1@mail.ru.
Pchelintsev Sergey Yu., Dr. Sci. (Med.), Professor, General Director, Institute for Immunological Engineering, 1 Nauchnaya St., Lyubuchany, 142380, Russia, tel: (495) 996-15-55, е-mail: serg.pch@yandex.ru.
Afanasiev Stanislav S., Dr. Sci. (Med.), Professor, Honored Scientist, Deputy Director, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-903-667-20-68, е-mail: afanasievss409.4@bk.ru.
Svetoch Edward A., Dr. Sci. (Vet.), Professor, Head of Molecular Microbiology Department, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, 142279, Russia, tel: (4967) 36-00-79, e-mail: svetoch@obolensk.org.
Volozhantsev Nikolai V., Cand. Sci. (Biol.), Head of Laboratory of Molecular Diagnostics and Genetically Engineered Preparations, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Ob-olensk, 142279, Russia, tel:(4967) 36-00-79, e-mail: nikvol@obolensk.org.
Verevkin Vladimir V., Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of Laboratory of Molecular Diagnostics and Genetically Engineered Preparations, State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, 142279, Russia, tel: (4967) 36-00-79, e-mail: lab-mdgip@mail.ru.
Kiseleva Irina A., Research Associate, BPhage LLC, 10 Butyrskij Val St., Moscow, 125047, Russia, Research Associate of Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: 8-916-397-22-38, e-mail: irina6804@mail.ru.
Bochkareva Svetlana S., Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of Laboratory of Immunobi-ological Preparations, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel: (495) 452-38-03, e-mail: cip1989@gmail.com.
Different factors of the space flight, hypodynamia, stress, feeding features, boundedness and specificity of microbi-ota on the ICS (International Cosmic Station) may result in alterations of intestinal microbiota which may predispose astronauts to illness. This concern is heightened by increase in virulence of pathogenes and their resistance to antibiotics in microgravity. Probiotics help to effective correction of pre-clinical manifestations of microbiota imbalance development in astronauts in unusual environmental conditions. A new class of probiotics - phagebiotics should be used to improve the health status of astronauts. In the long-term program of scientific applied researches and experiment planning on ICS and the space experiment «Bacteriophage» there were compared phenotypic properties and was done complete genome sequencing of the phages before and after 1,5 months and 3 months of storage on the Earth and the ICS. Phenotype (except the concentration of viral particles) and genotype properties were invariable for all of the bacteriophage strains in the liquid and lyophilized forms, that opened up the opportunity to safe and effective use of bacteriophages for improvement of the health status of astronauts.
Key words: bacteriophages, phagebiotics, dysbiosis, bacteriophage titer, phagecomplete genome sequencing, prolong spaceflight, International Cosmic Station.
Введение. Одной из основных проблем медико-биологического обеспечения жизнедеятельности человека в условиях воздействия на него экстремальных факторов агрессивной среды в процессе длительной изоляции в герметичных помещениях (например, пребывание на орбитальной космической станции, на подводной лодке и т.д.) является предотвращение возможности развития инфекционных заболеваний у членов экипажей. Многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов показали, что пребывание человека в среде с измененными параметрами неизбежно ведет к развитию синдрома нарушения колонизационной резистентности: снижению реактивности организма и возрастанию численности представителей патогенной и условно-патогенной микрофлоры, что может провоцировать развитие острых воспалительных заболеваний [3]. В условиях эксплуатации Международной космической станции при частой сменяемости членов экипажей, прибывающих из различных географических регионов, серьезно возрастает опасность развития оппортунистических инфекций у космонавтов. В связи с этим особую актуальность приобретают профилактические мероприятия. Несмотря на обилие и разнообразие лекарственных средств, имеющихся в настоящее время на фармацевтическом рынке, проблема создания «идеального» препарата, эффективно и безопасно предохраняющего человеческий организм от микроэкологического дисбаланса остается открытой. Так, результаты исследований, проведенных в рамках космической и экстремальной медицины, показали, что пробиотики помогают эффективно скорректировать доклинические проявления дисбаланса микрофлоры, развивающиеся у космонавтов в непривычных условиях обитания вследствие снижения колонизационной резистентности и тем самым предотвратить инфекционно-воспалительные процессы, вызываемые условно-патогенной микрофлорой [4]. Однако настороженность, появившаяся в последние годы в отношении бактериальных препаратов, с одной стороны, увеличивающих антигенную нагрузку на макроорганизм, а с другой - проявляющих неспецифический антагонистический эффект в отношении негомологичных видов микроорганизмов, предполагает продолжение поиска эффективных и безопасных лечебно-профилактических средств.
В качестве нового класса пробиотических препаратов, не содержащих бактериальные клетки и обладающих специфическим бактерицидным действием в отношении конкретных видов микроорганизмов, могут выступать фагобиотики - бактериофаги. По мнению американских ученых S.T. Abedon, V. Mai, А. Сулаквелидзе и Э. Каттер, фагобиотики полностью соответствуют определению, данному ВОЗ для этого класса препаратов: «Пробиотики - живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах полезны для организма хозяина» [5, 6, 11]. Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода с последующим лизисом (после внутриклеточной репликации) клетки-хозяина [1]. Они присутствуют повсеместно на объектах окружающей среды в воде, почве, на растениях и т.д.
в количествах, превышающих миллионы частиц на единицу субстрата. Подтверждено их присутствие и в организме человека и животных. По многочисленным данным литературы, вирулентные фаги могут быть использованы в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур. Опыт фаготерапии польских ученых из группы Анжея Горски подтверждает исследования отечественных бактериофагологов в части отсутствия существенных анафилактических реакций у фагированных пациентов, что свидетельствует о незначительной антигенной нагрузке вирусов бактерий на организм человека [9].
Цель: создать профилактический препарат на основе бактериофагов, обладающий специфическим литическим действием в отношении потенциально опасных в условиях Международной космической станции (МКС) микроорганизмов, позволяющий эффективно и безопасно предохранять человеческий организм от микроэкологического дисбаланса и, соответственно, развития инфекционного процесса бактериального генеза, что приобретает особую важность при длительной изоляции людей в герметичных помещениях. Задачами первого этапа исследования, проводимого в рамках долгосрочной программы научно-прикладных исследований и экспериментов, планируемых на Российском сегменте МКС, и космического эксперимента «Бактериофаг» стало изучение влияния факторов космического полета на биологические свойства и ДНК штаммов бактериофагов в жидкой и лиофи-лизированной формах.
Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования в эксперименте использовали лиофилизированные культуры отдельных бактериофагов Staphylococcus aureus (St. aureus), Streptococcus pyogenes (Str. pyogenes) и Pseudomonas aeruginosa (Ps. aeruginosa), а также сухую и жидкую формы коктейля бактериофагов «ФудФаг», служащего основой для производства одноименного специализированного продукта диетического (профилактического) питания, зарегистрированного в феврале 2013 года на территории стран Евразийского экономического сообщества. Характеристика данного фагового коктейля, состоящего из 7 штаммов бактериофагов, активных в отношении: Salmonella enteritidis (S. enteritidis), Salmonella infantis (S. infantis), Salmonella typhimurium (S. typhimurium), Escherichia coli (E. coli) O157, E. coli 0104, St. aureus и Listeria monocytogenes (L. monocytogenes), содержащая происхождение фагов, спектр их литической активности, максимальные титры при культивировании, а также ПЦР-подтверждение отсутствия известных локусов патогенно-сти, представлена в опубликованных ранее материалах [8].
В 2013 и 2014 годах ампулы с образцами бактериофагов в специальных пеналах с помощью транспортного грузового космического корабля «Прогресс» отправляли на МКС на срок от 1,5 до 3 месяцев. В процессе эксперимента сравнивали фенотипические свойства (спектр литической активности, титр вирусных частиц, морфологию бляшек и устойчивость фагов к повышенным температурам и изменениям pH) и нуклеотидные последовательности фаговых геномов одноименных штаммов бактериофагов до космического полета, после 1,5 и 3 месяцев их пребывания на МКС, а также после синхронного хранения контрольных образцов на Земле при постоянной температуре 21-22° С.
Для определения количества вирусных частиц в сухих и жидких препаратах бактериофагов использовали метод агаровых слоев Грациа [10].
Определение спектра литической активности проводили на культурах патогенных микроорганизмов, хранящихся в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», методом спот-теста [7].
Устойчивость бактериофагов к повышенной температуре наблюдали в интервале от 50 до 85° C. Количественное определение негативных колоний в прогретых образцах проводили с помощью метода агаровых слоев Грациа. Для определения устойчивости бактериофагов к щелочным и кислым значениям рН среды фаголизаты тестировали по методу Грациа после их инкубирования в течение часа при комнатной температуре с калиброванными по конкретным значениям рН буферными растворами [2].
Для подготовки фаговых вирионов к полногеномному секвенированию проводили микрофильтрацию через стерилизующий фильтр, после чего проводили ультрацентрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия [12]. ДНК бактериофагов выделяли при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific, США) согласно протоколу производителя.
Затем готовили штрих-кодированные библиотеки случайных фрагментов для секвенирования при помощи набора Ion Xpress Plus Fragment Library Kit (Life Technologies, США). Субстрат для секвенирования получали из подготовленных библиотек при помощи набора Ion PGM Template OT 200 Kit (Life Technologies, США) с использованием устройства Ion One Touch (Life Technologies, США). Секвенирование образцов осуществляли на секвенаторе второго поколения
Ion Torrent PGM (Life Technologies, США) с использованием чипов Ion 314 Chip (Life Technologies, США). Данные этапы проводили согласно протоколу производителя.
В ходе биоинформационного анализа проводили фильтрацию качества прочтений. Для сборки фаговых геномов de-novo использовали риды с качеством прочтения нуклеотидов не ниже Q20 и длиной не менее 50 оснований. Сборку геномов осуществляли с использованием программного обеспечения GS De Novo Assembler (программный пакет Newbler, Roche). Глубина покрытия была не менее 100 ридов на каждый нуклеотид генома. Выравнивание и сравнение фаговых геномов из образцов, полученных до и после трехмесячного космического полета, проводили при помощи программного обеспечения Geneious (Biomatters Ltd.).
Результаты исследования и их обсуждение. Исходные показатели спектра литической активности, морфологии бляшек и устойчивости к повышенным температурам и изменениям pH всех исследуемых бактериофагов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Спектр литической активности, морфология бляшек и устойчивость к повышенным температурам
и изменениям pH бактериофагов до космического полета
Штамм Спектр литической Морфология Устойчивость Устойчивость
бактериофага активности (% ли- бляшек бактериофагов бактериофагов
зированных бакте- к повышенной к изменениям
риальных культур температуре*, °C pH**
Специализированный продукт профилактического питания «ФудФаг»
St. aureus CH1 92,0 ± 2,0 круглые, прозрачные, 0 1,0-2,0 шш 50,0 ± 5,0 5,2-8,0
S. typhimurium ST11 100,0 ± 2,0 круглые, мутные, 0 1,0-3,0 шш 65,0 ± 2,0 3,6-9,6
S. enteritidis SE40 85,0 ± 1,0 круглые, прозрачные, 0 2,0-3,0 шш 70,0 ± 2,0 3,6-9,6
S. infantis SI3 64,0 ± 1,0 круглые, мутные, 0 1,0-3,0 шш 65,0 ± 2,0 5,2-8,0
E. coli ECD7 100,0 ± 1,0 круглые, прозрачные, с мутным ореолом, 0 1,0-2,0 шш 55,0 ± 2,0 5,2-9,6
E. coli V18 100,0 ± 2,0 круглые, прозрачные, 0 2,0-3,0 шш 50,0 ± 2,0 5,2-9,6
L. monocytogenes 92,0 ± 1,0 круглые, прозрачные, 55,0 ± 2,0 7,0-8,0
Lm1 с мутным ореолом, 0 1,0-3,0 шш
Лиофилизированные штаммы бактериофагов
St. aureus StaK 100,0 ± 2,0 круглые, прозрачные, 0 1,0-2,0 mm 50,0 ± 2,0 5,2-8,0
Str. pyogenes SpK1 37,0 ± 1,0 круглые, прозрачные, 0 1,0-2,0 mm 55,0 ± 3,2 5,2-9,6
Ps. aeruginosa PaK 68,0 ± 2,0 круглые, прозрачные, 0 1,0-3,0 mm 58,0 ± 4,0 5,2-8,0
Примечание: * - указана максимальная температура, в пределах которой титр бактериофага остается неизменным; ** - указан диапазон рН, в пределах которого титр бактериофага остается неизменным
После космического полета и хранения на Земле все ампулы с бактериофагами оставались герметичными. Посторонняя микрофлора до и после полета на МКС и хранения на Земле в образцах не обнаруживалась.
Результаты определения титра бактериофагов после 1,5 и 3 месяцев хранения на МКС представлены в таблице 2.
После 1,5 месяцев хранения на МКС титр бактериофагов, входящих в состав «ФудФага», в жидкой и лиофилизированной форме снижался в среднем на один порядок, максимальное снижение было зафиксировано у бактериофага сальмонелла инфантис из жидкого образца коктейля «ФудФаг» и достигало двух порядков. Титр отдельных бактериофагов в лиофилизированной форме St. aureus, Str. pyogenes и Ps. aeruginosa падал менее чем на порядок. Штаммы бактериофагов, синхронно хранившиеся в ампулах на Земле при температуре 21-22° С, продемонстрировали стабильность как в
жидкой, так и в сухой форме, невзирая на высокую для иммунобиологических препаратов температуру хранения.
Таблица 2
Штамм бактериофага Титр до космического полета, БОЕ/мл Титр после полуторамесячного космического полета, БОЕ/мл Титр после полуторамесячного хранения на Земле, БОЕ/мл Титр после трехмесячного космического полета, БОЕ/мл Титр после трехмесячного хранения на Земле, БОЕ/мл
Специализи рованный продукт профилактического питания «ФудФаг»
жидкий сухой жидкий сухой жидкий сухой жидкий сухой жидкий сухой
St. aureus CHI 9,0х1010 9,0х109 3,0х109 1,0х109 9,0х1010 9,0х109 1,0х109 2,0х108 9,0х1010 6,0х109
S. typhimuri-um ST11 3,0х1010 3,0х1010 6,0х109 1,0х109 2,0х1010 5,9х109 2,0х109 1,0х108 9,0х109 1,0х109
S. enteritidis SE40 2,0х1010 2,0х1010 1,0х109 2,0х109 1,0х1010 9,0х109 1,0х109 1,0х109 9,0х109 7,0х109
S. infantis SI3 3,0х1010 6,0х109 2,0х108 1,0х109 3,0х1010 4,0х109 2,0х108 1,0х108 2,8х1010 3,0х109
E. coli ECD7 2,0х108 2,0х108 2,0х108 1,7х107 2,0х108 2,0х108 2,0х108 1,0х105 2,0х108 1,0х108
E. coli V18 1,0х108 1,0х108 1,0х107 1,0х107 8,0х107 1,0х108 1,0х107 1,0х105 8,0х107 1,0х108
L. monocytogenes Lm1 1,0х108 1,0х108 1,0х107 1,0х107 1,2х107 1,2х107 1,0х106 7,0х106 1,0х107 1,0х107
Лиофилизированные штаммы бактериофагов
St. aureus StaK 1,0х109 5,0х108 1,0х109 6,5х107 1,3х108
Str. pyogenes SpK1 6,5х109 4,0х109 4,0х109 2,1х109 2,5х109
Ps. aeruginosa PaK 3,0х108 1,0х108 2.4х108 1,2х108 1,4х108
Образцы, вернувшиеся с МКС на транспортном грузовом космическом корабле «Прогресс» после трехмесячного хранения, также тестировались по методу Грациа. В среднем титр штаммов из лиофилизированной формы коктейля «ФудФаг» падал на 2 порядка, жидкой - на один. Титр стафилококкового бактериофага StaK также уменьшался на 2 порядка после трехмесячного хранения на МКС. Половина из образцов, хранившихся на Земле при тех же температурных условиях, которые постоянно поддерживаются на МКС, сохранили титр бактериофагов в пределах одного порядка исходной концентрации вирусных частиц.
Одновременно с определением количества негативных колоний методом агаровых слоев проводили визуальное сравнение их морфологии до и после космического полета и синхронного хранения на Земле. Не удалось отметить существенных различий в морфологии бляшек ни у одного из бактериофагов, включенных в эксперимент.
Спектр литической активности всех образцов бактериофагов как после полутора-, так и после трехмесячного хранения на МКС оставался неизменным. Синхронно хранившиеся на Земле при тех же температурных условиях штаммы бактериофагов ожидаемо лизировали лишь штаммы гомологичного вида бактерий в таком же проценте случаев, как и до закладки на хранение.
Достоверного изменения данного биологического свойства не было обнаружено ни у одного из фагов, участвовавших в эксперименте.
Интервалы значений pH, при которых образцы бактериофагов стабильно сохраняли исходный титр вирусных частиц после полутора- и трехмесячного хранения на МКС, оставались неизменными.
ДНК всех бактериофагов, включенных в эксперимент, были отсеквенированы до и после трехмесячного хранения на МКС при помощи полупроводникового секвенатора второго поколения Ion Torrent PGM. Результаты выравнивания собранных полногеномных последовательностей представлены на рисунках 1-10.
2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 16,000
2,000 4,000 6,000 0,000 10,000 12,000 14,000 16,000
2,000 4,000 6,000 0,000 10,000 12,000 14,000 16,000
Рис. 1. Выравнивание геномов фага St. aureus StaK до и после трехмесячного космического полета
5,000 10,000 15.000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000 50,000
5,000 10,000 15,000 20,000 15,000 30,000 35,000 40,000 45,000 50,000
5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000 40,000 45,000 50,000
Str. pyogenes SpK1 до и после трехмесячного космического полета
25,000 50,000 "5,000 100,000 125,000 150,000 175.000 200,000 225,000 250,000
Consensus identity Ps. aeruginosa PAK Ps. aeruginosa PAK после полета
1 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 1; ¡0,000 175,000 200,000 225,000 250,000
1 25,000 50,000 75,000 100,000 125,000 1; ¡0,000 175,000 200,000 225,000 250,000
Рис. 3. Выравнивание геномов фага Ps. aeruginosa PAK до и после трехмесячного космического полета
Рис. 4. Выравнивание геномов фага St. aureus CH1 до и после трехмесячного космического полета
10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000
10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000
10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000
Рис. 5. Выравнивание геномов фага Б. typhimurium ST11 до и после трехмесячного космического полета
Consensus identity
St. aureus StaK
St. aureus StaK после полета
Consensus identity
Str. pyogenes SpK1
Str. pyogenes SpK1 после полета
Рис. 2. Выравнивание геномов фага
Consensus identity
S. typhimurium ST11 S. typhimurium ST11 после полета
10,000 :о,ооо 30,000 tooo 50.000 eo.ooo 70.000
10,000 20.000 30,000 40,000 50,000 00,000 70,000 10,000 10,000 30,000 40,000 50,000 00,000 70,000
Рис. 6. Выравнивание геномов фага S. infantis SI3 до и после трехмесячного космического полета
2,000 5,000 7,500 10,000 11,500 15,000 17,500 20.000 22.000 25,000
2,500 5,000 7,500 10,000 12,500 15,000 17,500 20,000 22,500 25,000 2,500 5,000 7,500 10,000 12,500 15,000 17,500 20,000 22,500 25,000
Рис. 7. Выравнивание геномов фага S. enteritidis SE40 до и после трехмесячного космического полета
10,000 40,000 00,000 80,000 100,000 110,000 140,000
Consensus identity
I 20,000 40,000 00,000 80,000 100,000 120,000 140,000
E. coli ECD7
I 20,000 40,000 00,000 80,000 100,000 120,000 140,000
E. coli ECD7 после полета
Рис. 8. Выравнивание геномов фага E. coli ECD7 до и после трехмесячного космического полета
10,010 21,000 50,™ 40,010 5),ООО 60(100 70,010 SJ.MC OOjOOO 100,[00 I 0,00) 121,000
10,010 11,000 30.300 40,010 5),000 00,000 70,010 8),00[ 00,000 100,000 10,00) 10,010 21,000 30.300 40,010 53,000 00(100 70,010 83,00[ 00(100 100,(00 10,003
Рис. 9. Выравнивание геномов фага E. coli V18 до и после трехмесячного космического полета
5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
Рис. 10. Выравнивание геномов фага L. monocytogenes Lm1 до и после трехмесячного космического полета
В результате была подтверждена идентичность ДНК всех штаммов бактериофагов до и после хранения на МКС.
Заключение. Полученные данные подтвердили неизменность фенотипических свойств (за исключением концентрации вирусных частиц) у всех штаммов бактериофагов в жидкой и лиофилизи-рованной формах после полутора- и трехмесячного хранения на МКС. Кроме того, не обнаружено
Consensus identity S. infantis SI3
S. infantis SI3 после полета
Consensus identity
S. enteritidis SE40 S. enteritidis SE40 после полета
Consensus identity E. coli V18
E. coli V18 после полета
Consensus identity
L. monocytogenes Lm1 L. monocytogenes Lm1 после полета
вставок и делеций в ДНК бактериофагов после их возвращения из космоса. В процессе исследования отмечена большая стабильность титра жидкой формы по сравнению с лиофилизированной при хранении в условиях орбитальной космической станции. В целях получения экспериментальных данных на временных промежутках, соизмеримых со сроком годности специализированного продукта профилактического питания «ФудФаг», нами в сотрудничестве с ОАО «Биопрепарат» на 2015 год запланировано увеличение срока пребывания фагов в космосе до одного года. Предварительные результаты, полученные в ходе данного этапа исследования, открывают возможность безопасного и эффективного использования бактериофагов для нормализации дисбиотических состояний у космонавтов в условиях МКС.
Список литературы
1. Алешкин, А. В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств декон-таминации в области питания / А. В. Алешкин, М. В. Зейгарник // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, № 4. - С. 24-34.
2. Гольдфарб, Д. М. Бактериофагия / Д. М. Гольдфарб. - М. : Медгиз, 1961. - 298 с.
3. Ильин, В. К. Колонизационная резистентность организма в измененных условиях обитания / В. К. Ильин, А. И. Воложин, Г. В. Виха. - М. : Наука, 2005. - 280 с.
4. Крюков, А. И. Экспериментальное обоснование применения пробиотических препаратов в условиях гидроневесомости / А. И. Крюков, В. К. Ильин, А. И. Воложин, Л. П. Истранов, Н. В. Кирюхина, Л. В. Старкова, Ю. А. Морозова, Н. А. Усанова // Вестник оториноларингологии. - 2007. - № 5. - C. 30-33.
5. Каттер, Э. Бактериофаги : биология и практическое применение / под ред. Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ. - М. : Научный мир, 2012. - 636 с.
6. Abedon, S. T. Phage treatment of human infections / S. T. Abedon, S. J. Kuhl, B. G. Blasdel, E. M. Kutter // Bacteriophage. - 2011. - Vol. 1, № 2. - P. 66-85.
7. Adams, M. H. Bacteriophages / M. H. Adams. - New York - London : Inerscience Publishers Inc., 1959. -
592 p.
8. Aleshkin, A. V. Bacteriophage cocktail in prophylaxis against food-borne infections / A. V. Aleshkin, N. V. Volozhantsev, E. A. Svetoch, V. V. Verevkin, V. M. Krasilnikova,V. A. Bannov, A. I. Borzilov, O. V. Korobova, S. S. Afanas'ev, V. A. Aleshkin // Worldwide research efforts in the fighting against microbial pathogens: from basic research to technological developments / ed. A. Mendez-Vilas. - Boca Raton : Brown Walker Press, 2013. -P. 100-104.
9. Borysowski, J. The response of the immune system to phage : potential associations with phage therapy / J. Borysowski, K. D^browska, M. Ohams, P. Wierzbicki, G. Rokczak-Kowalska, M. Lusiak-Szelachowska, R. Miezybrodzki, A. Gorski // Bacteriophages and probiotics - alternatives to antibiotics : аbstract book, conference dedicated to the 120 th birth anniversary of Professor George Eliava (Tbilisi, Georgia, 1-4 July 2012). - 2012. - P. 31.
10. Gratia, A. Des relations numeriques entre bacteries lysogene set particules de bacteriophage / A. Gratia // Annales de l'Institut Pasteur. - 1936. - Vol. 57. - P. 652-676.
11. Mai, V. Bacteriophage administration reduces the concentration of Listeria monocytogenes in the gastrointestinal tract and its translocation to spleen and liver in experimentally infected mice / V. Mai, M. Ukhanova, L. Visone, T. Abuladze, A. Sulakvelidze // International Journal of Microbiology. - 2010. - Vol. 2010. - Available at: http://dx.doi.org/10.1155/2010/624234 (free, accessed 01.09.2014).
12. Thurber, R. V. Laboratory procedures to generate viral metagenomes / R. V. Thurber, M. Haynes, M. Breitbart, L. Wegley, F. Rohwer // Nature protocols. - 2009. - Vol. 4, № 4. - P. 470-483.
References
1. Aleshkin A. V., Zejgarnik M. V. Vozmozhnosti primenenija bakteriofagov v kachestve probioticheskih sredstv dekontaminacii v oblasti pitanija [Possibilities of using bacteriophages as probiotic medications for decontamination in nutrition]. Voprosy dietologii [Dietology Issues], 2012, vol. 2, no. 4, pp. 24-34.
2. Gol'dfarb D. M. Bakteriofagija [Bacteriophagy]. Moscow, Medgiz, 1961, 298 p.
3. Ilin V. K., Volozhin A. I., Viha G. V. Kolonizacionnaja rezistentnost organizma v izmenennyh uslovijah obitanija [Colonization resistance of the organism in the altered habitat], Moscow, Nauka, 2005, 280 p.
4. Krjukov A. I., Ilin V. K., Volozhin A. I., Istranov L. P., Kirjuhina N. V., Starkova L. V., Morozova Ju. A., Usanova N. A. Jeksperimentalnoe obosnovanie primenenija probioticheskih preparatov v uslovijah gidronevesomosti [Experimental substantiation of probiotics application in hydroweightlessness]. Vestnik otorinolaringologii [Otorhino-laryngology Bulletin], 2007, no. 5, рр. 30-33.
5. Kutter E., Sulakvelidze A. Bakteriofagi: biologija i prakticheskoe primenenie [Bacteriophages: biology and applications]. Moscow, Nauchnyj mir., 2012, 636 p.
6. Abedon S. T., Kuhl S. J., Blasdel B. G., Kutter E. M. Phage treatment of human infections. Bacteriophage, 2011, vol. 1, no. 2, pp. 66-85.
7. Adams M. H. Bacteriophages. New York - London, Inerscience Publishers Inc., 1959, 592 p.
8. Aleshkin A. V., Volozhantsev N. V., Svetoch E. A., Verevkin V. V., Krasilnikova V. M., Bannov V. A., Borzilov A. I., Korobova O. V., Afanas'ev S. S., Aleshkin V. A. Bacteriophage cocktail in prophylaxis against food-borne infections. Worldwide research efforts in the fighting against microbial pathogens: from basic research to technological developments. ed. A. Mendez-Vilas. Boca Raton, BrownWalker Press, 2013, pp. 100-104.
9. Borysowski J., D^browska K., Ohams M., Wierzbicki P., Rokczak-Kowalska G., Lusiak-Szelachowska M., Miezybrodzki R., Gorski A. The response of the immune system to phage: potential associations with phage therapy. Abstract book, conference: «Bacteriophages andprobiotics - alternatives to antibiotics» dedicated to the 120 th birth anniversary of Professor George Eliava, Tbilisi, Georgia, 2012, p. 31.
10. Gratia A. Des relations numeriques entre bacteries lysogene set particules de bacteriophage. Annales de l'Institut Pasteur, 1936, vol. 57, pp. 652-676.
11. Mai V., Ukhanova M., Visone L., Abuladze T., Sulakvelidze A. Bacteriophage administration reduces the concentration of Listeria monocytogenes in the gastrointestinal tract and its translocation to spleen and liver in experimentally infected mice. International Journal of Microbiology, 2010, vol. 2010. Available at: http://dx.doi.org/10.1155/2010/624234 (accessed 01 September 2014).
12. Thurber R. V., Haynes M., Breitbart M., Wegley L., Rohwer F. Laboratory procedures to generate viral met-agenomes. Nature protocols, 2009, vol. 4, no. 4, pp. 470-483.
