CC BY
154
нять высокий процент сопутствующей инфекционной патологии и гнойно-воспалительных осложнений в послеродовом периоде.
Список литературы
1. Елисеева, И. В. Клинико-функциональные особенности соматического состояния и течения родов у женщин с пролапсом митрального клапана / И. В. Елисеева // Клиническая медицина. - 2003.
- Т. 81, № 3. - С. 22-24.
2. Маколкин, В. И. Полиморфизм клинических проявлений синдрома соединительнотканной дисплазии / В. И. Маколкин, В. И. Подзолков, А. В. Родионов и др. // Терапевтический архив. - 2004.
- № 11. - С. 77-80.
3. Трисветова, К. В. Малые аномалии сердца / К. В. Трисветова, А. А. Бова // Клиническая медицина. - 2002. - Т. 80, № 1. - С. 9-15.
4. Шехтман, М. М. Руководство по экстрагенитальной патологии у беременных / М. М. Шехт-ман. - М. : Триада-Х, 1999. - 816 с.
5. Ягода, А. В. Малые аномалии сердца / А. В. Ягода, Н. Н. Гладких. - Ставрополь : Изд-во СтГМА, 2005. - 248 с.
6. Smulian, J. C. Appropriateness of antibiotic use in the postpartum period / J. C. Smulian, S. K. Potash, Y. L. Lai, W. E. Scorza // J. Matern. Fetal. Med. - 2001. - Vol. 10, № 5. - P. 312-317.
7. Gowda, R. M. Cardiac arrhythmias in pregnancy: clinical and therapeutic considerations / R. M. Gowda, I. A. Khan, N. J. Mehta et al. // Int. J. Cardiol. - 2003. - Vol. 88, № 2-3. - P. 129-133.
8. Schmeisser A. Mitral valve prolapse / А. Schmeisser, F. A. Flachskampf // Z. Kardiol. - 2000. -Vol. 89, № 4. - P. 349-353.
Аксененко Виктор Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 355017, г. Ставрополь, ул. Мира, д. 310, тел.: 8-8652-71-65-36, e-mail: postmaster@stgma.ru.
Бабенко Татьяна Игоревна, ассистент кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «Ставропольская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 355017, г. Ставрополь, ул. Мира, д. 310, тел.: 8-962-446-35-29, e-mail: postmaster@stgma.ru.
УДК 578.81:579.67
© А.В. Алешкин, Н.В. Воложанцев, Э.А. Светоч, В.А. Алешкин, С.С. Афанасьев, А.И. Борзилов, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, А.В. Караулов, Х.М. Галимзянов, И.А. Киселева, М.С. Афанасьев, Е.О. Рубальский, М.О. Рубальский, 2012
А.В. Алешкин1, Н.В. Воложанцев2, Э.А. Светоч2, В.А. Алешкин1, С.С. Афанасьев1, А.И. Борзилов2, Д.А. Васильев3, С.Н. Золотухин3, А.В. Караулов4, Х.М. Галимзянов5, Ю.Ф. Космачев6, И.А. Киселева1, М.С. Афанасьев4, Е.О. Рубальский1, М.О. Рубальский5
БАКТЕРИОФАГИ КАК ПРОБИОТИКИ И СРЕДСТВА ДЕКОНТАМИНАЦИИ
ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
:ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии
им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора 2ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»
Роспотребнадзора
3ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» 4ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России 5ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России ^Управление Федеральной службы безопасности Российской Федерации по Астраханской области
Опасность инфицирования людей пищевой продукцией, контаминированной листериями, эшерихиями, сальмонеллами, стафилококками и другими патогенными микроорганизмами, остается чрезвычайно высокой, особенно при употреблении продуктов быстрого приготовления. Осуществлен поиск и выделение бактериофагов, активных против данных бактерий, изучен спектр их литической активности, урожайность, стабильность свойств при хране-
31
нии, чувствительность к неблагоприятным факторам, а также безопасность для лабораторных животных и человека. Применение пероральных жидкой и таблетированной форм биологически активных добавок к пище позволят снизить риск развития спорадических случаев и эпидемических вспышек пищевых инфекций. Аэрозольную форму пищевой добавки (зарегистрированную как вспомогательное технологическое средство) предполагается внедрить на заводы для обработки мясных и рыбных полуфабрикатов и деликатесов перед их заморозкой и вакуумной упаковкой.
Ключевые слова: бактериофаги, биоконтроль, пищевые инфекции, фагосодержащие пробиотические пищевые добавки.
A.V. Aleshkin, N.V. Volozhantsev, E.A. Svetoch, V.A. Aleshkin, S.S. Afanasyev, A.I. Borzilov, D.A. Vasilyev, S.N. Zolotukhin, A.V. Karaulov, H.M. Galimzyanov, Yu.F. Kosmachev, I.A. Kiseleva, M.S. Afanasyev, E.O. Rubalsky, M.O. Rubalsky
BACTERIOPHAGES AS PROBIOTICS AND DECONTAMINATING AGENTS
FOR FOOD PRODUCTS
The risk of infection caused by food products contaminated with Listeria, Escherichia, Salmonella, Staphylococci is very high. Bacteriophages, active against the above mentioned bacteria, were discharged and singled out, focusing close attention to their lytic value, productivity, ability to retain their characteristics in storage, their sensitivity of adverse factors as well as safety for lab animals and humans. Peroral, liquid and tablet forms of the phage-based probiotic dietary supplement may allow to reduce the risks of outbreaks and sporadic cases of foodborne infections. An aerosol form of the phage cocktail (registered as processing aid) has been suggested for use at plants producing pre-packed meat and fish delicacies before freezing and vacuum-packing.
Key words: bacteriophages, biocontrol, foodborne infections, phage-based probiotic dietary supplement.
Введение. Появление новых технологий хранения на холоде, упаковки в пленку, минимальной переработки охлажденного сырья, длительная транспортировка увеличивают возможность накопления в пище возбудителей, вызывающих острые инфекционные заболевания. Не в последнюю очередь это относится к листериям. Подавляющее большинство заболеваний у людей (98%) и животных (87%) вызывается видом Listeria monocytogenes. У человека оно проявляется общей интоксикацией организма, лихорадкой, полиморфизмом клинических признаков с преимущественным поражением лимфоидных органов, центральной нервной системы. Основной причиной заражения при эпидемических вспышках последнего десятилетия в США, Канаде и Западной Европе служили салаты из сырой капусты, пастеризованное молоко, мягкие сыры, паштеты, холодные закуски из свинины; причиной спорадических случаев - недожаренная или не проваренная курятина, непрогретые сосиски, мясные нарезки и другая гастрономия [19].
Сальмонеллы также занимают одно из ведущих мест среди микроорганизмов-возбудителей пищевых инфекций в мире. Так, в 2010 году в ЕЭС было зарегистрировано более 100 тыс. случаев сальмонеллеза. При этом основными источниками инфицирования служили контаминированные сальмонеллами пищевые продукты животного происхождения (мясо, молоко, яйца, особенно утиные и гусиные), реже - больные животные или человек (в том числе бактерионосители). Наиболее значимыми в эпидемиологическом отношении являются несколько серотипов вида Salmonella enterica: S. typhimurium, S. enteritidis и S. infantis. Все большее распространение получают штаммы с повышенной термоустойчивостью, резистентные ко многим современным антибиотикам и дезинфицирующим средствам, способные вызывать внутрибольничные вспышки инфекции с высоким уровнем смертности детей младенческого возраста [15].
Первичным резервуаром эширихий серовара Escherichia coli O157:H7 и других сероваров, не относящихся к O157:H7, синтезирующих шигаподобные токсины, нередко вызывающие тяжелые осложнения у больных в виде гемолитикоуремического синдрома, является мясной и молочный скот, который может выделять эти бактерии с фекалиями. Пищевые эшерихиозы обычно обусловлены употреблением в пищу контаминированных возбудителем овощей, фруктов, специй, не прошедших достаточную термическую обработку мясных полуфабрикатов, не пастеризованных молочных продуктов [15].
Продукты, контаминированные кампилобактером, стафилококком, шигеллами, также могут провоцировать развитие пищевой инфекции у людей. Кроме продуктов питания источниками алиментарного заражения служат контаминированная вода, технологическое оборудование пищевых производств и посуда комбинатов общественного питания, а также бактерионосители вышеперечисленных инфекций, задействованные в пищевой и медицинской отраслях. Применение антибиотиков и
химических дезинфектантов не решают эту проблему, снижая уровень экологической чистоты продукции и провоцируя появление новой категории патогенов - штаммов условно-патогенных бактерий, резистентных к антибиотикам. В тоже время бактериофаги, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода, используются в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур длительное время не вызывая формирования фагорезистентных штаммов [10, 11, 14]. Весь спектр лечебных мероприятий обозначается исследователями как фаготерапия [20]. Возможно также санитарно-гигиеническое применение бактериофагов в пищевой промышленности, сфере общественного питания, в детских и воинских коллективах, а также лечебно-профилактических учреждениях [1, 2, 4, 16, 18]. Под термином «биоконтроль» подразумевается использование бактериофагов как непосредственно человеком в виде пероральных (пищевой добавки) или иных форм фагокомпозиций (зубная паста, крем, дезодорант и т.д.), так и для обработки сельскохозяйственных культур и животных (до сбора урожая и забоя), инструментария и оборудования больниц и предприятий пищевой промышленности, полуфабрикатов или готовых продуктов питания с целью сокращения количества присутствующих на этих объектах определенных штаммов патогенных бактерий, в том числе вызывающих пищевые инфекции, а также для фагодиагностики потенциально опасных микроорганизмов [3, 17].
Felix d'Herelle 95 лет назад впервые продемонстрировал присутствие фагов в нормальной микрофлоре людей и у животных [10]. Выявлено выделение фагов из организма человека и животных с калом, мочой, слюной и мокротой в норме и при патологии в концентрациях достигающих 106 бляш-кообразующих единиц на мл субстрата (БОЕ/мл) [6, 13, 21]. Вирусы бактерий выявляются повсеместно на объектах окружающей среды в воде, почве, на растениях и т.д. в количествах, превышающих миллиарды частиц на единицу субстрата (например, в капле морской воды) [12]. Таким образом, вопрос об использовании бактериофагов как части пищевого рациона может носить скорее количественный (исходя из содержания вирусных частиц в продукте), а не качественный характер, как это рассматривается в случае с химическими антибактериальными средствами. Ряд авторов относят бактериофаги к разряду пробиотиков, подчеркивая, что по своей биологической природе они полностью подходят под определение ВОЗ: «Пробиотики - живые микроорганизмы, которые при применении в адекватных количествах полезны для организма хозяина» [9, 22, 23].
Целью исследования стала разработка пробиотической биологически активной добавки к пище (БАД) на основе поливалентного коктейля, содержащего эффективные концентрации стафилококкового, эшерихиозного, сальмонеллезного и листериозного бактериофагов, использование которой позволит снизить риск развития спорадических случаев и эпидемических вспышек пищевых инфекций.
Материалы и методы. Используя банк патогенных микроорганизмов, а также штаммы бактерий, выделенные от пациентов Клинико-диагностического центра, отобраны 7 производственно-перспективных бактериофагов. С помощью микробиологических, биохимических, биотехнологических и молекулярно-генетических методов исследованы их биологические свойства, отработана технология культивирования, подтверждена безопасность и эффективность полученной БАД на лабораторных животных и в программе медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения.
Результаты и их обсуждение. В состав пищевой добавки и БАД вошли следующие штаммы бактериофагов, депонированные в коллекциях ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора и ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (табл. 1).
Таблица 1
Характеристика штаммов бактериофагов, входящих в БАД
Наименование СШ ECD7 V32 SE40 ST0 SI3 Lm1
фага
1 2 3 4 5 6 7 8
Бактериальный S. aureus E. coli E. coli S. enteritidis S. typhi- S. infantis L. monocy-
штамм-хозяин 0104:Н4 O157:H7 murium togenes
Источник Клини- Фекалии Сточные Окружаю- Фекалии Фекалии Фекалии
выделения ческий ма- кт воды щая среда, кур, крупного овец, Аст-
фага териал, Московская коровника, Московская Калужская рогатого раханская
Челябинск область Московская область область скота, область
область Московская
область
1 2 3 4 5 6 7 8
Спектр литиче- 92/MRSA 100/ E. coli E. coli 85/ S. ente- 100/S. ty- 64/ S. infan- 92/ L. mo-
ской активности 0104:H4 0157:H7 ritidis phimurium tis nocytogenes
(% лизиса/ 0104:H4 0157:H-
штамм бактерий) 0157:H7 и др., 70/Sh. sonnei и flexneri
ПЦР- Нет Нет rfb, Нет rfb, Нет stxA Нет stxA Нет stxA Нет LL0-
типирование из- а-токсина stx1, stx2, stx1, stx2, токсина
вестных токсин- eae и fliC eae и fliC
кодирующих
генов
Максимальный
титр на штамме-хозяине 109 5 x 109 5 x 109 1011 1010 1010-1011 1010
(БОЕ/мл)
1. Фаг CH1, вирулентный для клинически значимых штаммов Staphylococcus aureus, в том числе митициллинрезистентных (MRSA)-штаммов. Выделен в 2011 оду из гнойного содержимого раны больного пациента. Фаг CH1 лизирует 98 % культур госпитальных штаммов S. aureus (44 из 45). Он хорошо культивируется, достигая при определенных условиях репродукции 1010 БОЕ/мл фага. При титровании СН1 по методу Аппельмана через сутки пробирки остаются прозрачными до 3 разведения. Фаг стабильно сохраняется в фаголизатах при 4 °С и после лиофильного высушивания.
2. Эшерихиозные бактериофаги.
Фаг EcD7 выделен из фекалий кур в 2012 г. на культуре штамма E. coli 0104:Н4, вызвавшего вспышку геморрагического колита у людей в Германии весной-летом 2011 г. Титр фага по Аппель-ману достигает 8 разведения. EcD7 обладает литической активностью по отношению к шига-токсин продуцирующим штаммам E. coli 0104:Н4, O157:H7, а также к клинически значимым E. coli других серогрупп. Кроме того он лизирует бактерии Shigella sonnei и Shigella flexneri. Не подавляет рост бактерий непатогенного для человека штамма E. coli М-17, используемого для приготовления пробиоти-ческого препарата «Колибактерин». EcD7 не содержит генов синтеза шига-подобных токсинов. Нами не выявлено клонов штамма E. coli 0104:Н4 №112027, устойчивых к бактериофагу E. coli EcD7. Фаг способен размножаться на бактериях непатогенного лабораторного штамма E. coli К12, что значительно облегчает его наработку в промышленных масштабах. В наших экспериментах удалось получить препарат бактериофага EcD7 с концентрацией около 1012 БОЕ/мл. Фаг легко разрушается 3 % перекисью водорода.
Фаг V32 выделен из стоков коровника, расположенного в Московской области. Специфичен для бактерий E. coli О157:Н7 - лизирует 100 % штаммов, выделенных от людей, животных и из окружающей среды. Не активен в отношении других эшерихий, шигелл и иерсиний. V32 не содержит факторов патогенности E. coli О157:Н7 (rfb, stx1, stx2, eae и fliC). Фаг не формирует устойчивых ли-зогенов. Устойчив при длительном хранении.
3. Сальмонеллезные фаги: SE40 эффективный против S. enteritidis, ST0 - против S. typhimurium и SI3 - против S. infantis выделены из фекалий кур. Они имеют различную литическую активность против штаммов этих сероваров сальмонелл, лизируя от 64 % до 100 % штаммов, выделенных от людей и животных. Фаги стабильны при хранении, а бактериофаг Si3 устойчив к низким значениям pH (3,6).
4. Листериозный бактериофаг Lm1 выделен из фекалий овец в Астраханской области. Вирулентен в отношении 93% клинически значимых штаммов L. monocytogenes (28 из 3). Lm1 хорошо культивируется, достигая при определенных условиях репродукции 1010 БОЕ/мл фага. Фаг стабильно сохраняется в фаголизатах при 4оС и после лиофильного высушивания.
Бактериофаги, входящие в разработанную рецептуру, специфичны, т.е. лизируют исключительно индикаторные культуры патогенных бактерий (эшерихии энтерогеморрагической группы, сальмонеллы инфантис, тифимуриум и энтеритидис, шигеллы Флекснера и Зонне, золотистый стафилококк и листерии моноцитогенес). Сравнение литической активности разработанной БАД с коммерческим бактериофагом «Интести» (ФГУП «Микроген») в отношении представителей нормальной
микрофлоры человека, выделенной в процессе проведения анализа кала на дисбактериоз кишечника у 100 пациентов (без создания специальной выборки и отсева пациентов по каким-либо признакам с 14 мая по 1 июня 2012 года) в клинико-диагностическом центре ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотреб-надзора, показало следующее: БАД не лизирует нормальную кишечную палочку и не угнетает рост бифидобактерий и лактобацилл, в то время как бактериофаг «Интести» лизирует нормальную кишечную палочку в 30 % случаев.
Внесение бактериофагов, входящих в разработанную рецептуру, в растущие культуры производственных штаммов бифидобактерий и лактобацилл: Lactobacillus acidophilus NKb L. acidophilus 100аш, L. acidophilus К3Ш24, L. plantarum 8P-A3, Bifidobacterium adolescentis MC-42, B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. bifidum ЛВА-3, B. longum Я-3, B. breve 79-119, B. infantis 73-15, не выявило морфологических и количественных различий культур в образцах после 17-ти часового термостатирования при 37 °С по сравнению с контролем.
Острую (аномальную) токсичность фагового коктейля оценивали в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации с использованием двух видов лабораторных животных -мышей и морских свинок [5].
Здоровые белые мыши массой 17-20 г были разделены на три группы по 15 животных в каждой. Мышам из первой группы препарат вводили по 1,0 мл внутрибрюшинно, животным из второй группы - по 1,0 мл подкожно в область спины, из третьей - 0,5 мл per os. Токсическое действие препарата оценивали по появлению признаков интоксикации, снижению массы и их гибели в течение 7 суток. При всех способах введения исследуемого препарата у мышей не появлялись признаки интоксикации.
Испытание препарата также было проведено на 10 здоровых морских свинках с массой тела 280-300 г. Каждому животному вводили внутрибрюшинно одну максимальную разовую дозу испытуемого средства (5,0 мл) и наблюдали в течение семи суток после инъекции. В конце срока наблюдения животные были взвешены. Введение исследуемого БАД не сопровождалось снижением массы животных, что свидетельствовало о его нетоксичности.
Оценку хронической токсичности БАД на основе бактериофага проводили согласно «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» на 30 здоровых белых мышах массой 20-24 г [8]. Препарат вводили животным внутрижелудочно один раз в день по 0,5 мл в течение 14 дней. 16 мышей из контрольной группы получали внутрижелудочно по 0,5 мл физиологического раствора в том же режиме. У экспериментальных животных ежедневно регистрировали массу, наличие клинических симптомов общей интоксикации. На 15 и 21 сутки после введения препарата проводили макроскопическое и микроскопическое исследование органов (печень, легкие, сердце, тимус, селезенка, корень языка, желудок, тонкий и толстый кишечник, брыжейка, головной мозг) предварительно эфтаназированных углекислым газом мышей. Введение препарата не сопровождалось гибелью животных, не влияло на их состояние и морфологию внутренних органов, не сопровождалось нарушением поведенческих реакций и внешнего вида. Достоверных изменений в динамике массы животных не наблюдалось (рис. 1).
- Средняя масса мышей в опытной группе
—•— Средняя масса мышей в контрольной группе
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Дни
Рис. 1. Изменение массы мышей в опыте по изучению хронической токсичности
Фармакокинетику БАД на основе бактериофага изучали на модели беспородных мышей (10 особей) после однократного внутрижелудочного введения комбинированного фагового препарата. Цель исследования заключалась в определении количества специфических фаговых частиц в фекалиях животных в различные промежутки времени после введения препарата. Каждая мышь содержалась в отдельной клетке. Вводимая доза препарата составила 0,5 мл. Через 0, 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов после введения у экспериментальных животных собирали фекалии и анализировали на наличии фагов входящих в состав препарата. Титр бактериофагов в экскрементах определяли по методу Грациа. Основные показатели фармакокинетики фагов, входящих в состав БАД представлены в таблице 2.
Таблица 2
Динамика персистенции фагов в кишечнике мышей после однократного внутрижелудочного введения фагового коктейля, ^ (БОЕ/г)
Название фага Титр фага в препарате, БОЕ/мл Титр фагов в экскрементах, lg (БОЕ/г) С БОЕ/г T А max? ч Тс, ч
0 3 ч 6 ч 9 ч 12 ч 24 ч 48 ч
Lm1 0,5 х 1010 0 0 4,0 4,5 3,8 0 0 4,5 9 < 24
ЕсD7 1,1 х 1010 0 1,6 5,7 5,9 5,3 3,0 0 5,9 9 < 48
SI3 0,3 х 1010 0 2,9 7,7 8,1 6,2 4,1 2,3 8,1 9 > 48
ST0 1,0 х 1010 0 2,9 7,2 8,0 6,4 5,3 2,8 8,0 9 > 48
SE40 9,6 х 106 0 0 2,8 7,6 7,1 5,0 3,1 7,6 9 > 48
V32 1,0 х 10' 0 0 3,7 4,1 3,0 1,6 0 4,1 9 > 24
СН1 1,3 х 1010 0 н.д. 5,8 5,6 5,1 0 0 5,8 6 > 24
Специфическая эффективности фагового коктейля была изучена в экспериментальной сальмо-неллезной инфекции у 20 беспородных белых мышей (самок) массой 20-24 г. Использовали устойчивый к рифампицину штамм S. enteritidis 92 Rif r. Среднесмертельная доза (ЛД50) этого штамма для мышей при внутрибрюшинном заражении составляет 50 КОЕ, при внутрижелудочном - около 107 КОЕ. Экспериментальный сальмонеллез вызывали внутрижелудочным введением ночной агаровой культуры в дозе 1 х 109 КОЕ (100 ЛД50). БАД вводили внутрижелудочно за 24 часа до заражения и далее в течение 5 дней в дозе 0,5 мл/сутки. Эффективность применения препарата оценивали по количеству выживших животных в группе и по остаточной обсемененности внутренних органов, крови и фекалий бактериями S. enteritidis 92 Rif r. Выживших мышей эвтаназировали методом СО2 ингаляции. Печень, селезенку, кровь из сердца и суспензию фекалий животных высевали на пластинки ГРМ агара с добавлением рифампицина (100 мкг/мл). Посевы инкубировали в течение 48 часов при температуре 37 °С. Контрольная группа (10 самок мышей) после заражения получала физиологический раствор в объеме 0,5 мл внутрижелудочно. Наблюдали за животными в течение 14 суток после окончания применения препарата.
Выбранная экспериментальная модель сальмонеллеза оказалась адекватной. Мыши заболевали и погибали в течение 6-12 суток (средний срок гибели особей в контрольной группе - 8 суток) после внутрижелудочного заражения. У погибших животных из всех групп культура S. enteritidis 92 Rif r высевается из печени, селезенки и крови, что говорит о генерализации инфекции. При применении БАД выжило 70% мышей, средний срок гибели павших мышей составил 11,4 дня. Бактериологический анализ органов и фекалий выживших животных на 14 сутки после окончания терапии подтвердил 100% санацию.
Комплексная оценка безопасности и эффективности пробиотической БАД на основе бактериофагов проводилась в рамках программы медицинской реабилитации лиц с хроническими заболеваниями органов пищеварения. Типовая программа реабилитации включала: дието-, фито-, бальнео-, кинезотерапия, тренинги, гастрошколы и т.д. В исследование были включены 36 пациентов (мужчин) в возрасте 18-65 лет со следующей патологией (по МКБ-10): XIK58.0 Синдром раздраженного кишечника с диареей - 8 пациентов; XIK58.9 Синдром раздраженного кишечника без диареи - 20 пациентов; Х1К59.0 Запор - 8 пациентов. При бактериологическом исследовании фекалий у пациентов были выявлены Staphylococcus aureus (14 случаев), энтеропатогенная Escherichia coli (4 случая), грибы рода Candida (6 случаев) и другие представители условно-патогенной микрофлоры (18), типичные для дисбиотического состояния кишечника. Все пациенты были разделены случайным образом на две
группы: в основной группе пациентов (20 человек) в типовую программу реабилитации был дополнительно включен фаговый коктейль, который назначался по 50 мл 3 раза в день во время еды, курсом 10 дней. 16 пациентам группы сравнения реабилитация осуществлялась в рамках типовой программы.
Оценка эффективности проведенной медицинской реабилитации в сравниваемых группах осуществлялась по динамике клинических проявлений, степени изменения микробиологических показателей, а также метаболической активности толстокишечной микрофлоры методом газожидкостной хроматографии. Анализ клинических симптомов показал, что у пациентов основной группы достоверно раньше (р<0,05), чем в группе сравнения, купировались жалобы на боли в животе (на 4 день и 6 день, соответственно), диспепсические проявления (3 и 6 сутки, соответственно), очистился язык (3 и 5 день, соответственно), появился ежедневный самостоятельный стул (на 5 и 8 день, соответственно). Эффективность применения БАД подтверждалась элиминацией Staphylococcus aureus, энтеропато-генной Escherichia coli, грибов рода Candida у всех пациентов основной группы, в то время как после проведения типовой программы реабилитации лишь у двух пациентов не высевался Staphylococcus aureus. Элиминация грибов рода Candida также может быть отнесена к эффектам БАД в связи с установленной ранее стимуляцией роста этих грибов в результате их симбиоза со Staphylococcus aureus [7]. В результате проведенного фагирования за счет элиминации условно-патогенной микрофлоры (УПМ) на 30% снизилось количество пациентов с дисбактериозом кишечника второй и третьей степени, а у 35% больных удалось добиться полной нормализации показателей микробиоценоза (рис. 2).
Рис. 2. Динамика микробиологических показателей содержимого толстой кишки у пациентов с синдромом раздраженного кишечника и запором на фоне медицинской программы реабилитации
Таким образом, проведенные in vitro и in vivo исследования полностью подтвердили пробиоти-ческую природу, а также безопасность и специфическую эффективность разработанной БАД и пищевой добавки на основе бактериофагов.
Выводы. Внедрение в российскую практику нового класса пробиотических пищевых добавок и БАД на основе бактериофагов, с одной стороны, позволит предприятиям пищевой отрасли выпускать экологически чистую продукцию, не содержащую средств химической деконтаминации, а с другой -снизить риск возникновения острых инфекционных заболеваний передающихся алиментарно.
Список литературы
1. Акимкин, В. Г. Бактериофаги: исторические и современные аспекты их применение: опыт и перспективы / В. Г. Акимкин, О. С. Дарбеева, В. Ф. Колков // Клиническая практика - 2010. - № 4. -С.48-54.
2. Анпилов, Л. И. Профилактическая эффективность сухого поливалентного дизентерийного бактериофага в организованных коллективах / Л. И. Анпилов, А. А. Прокудин // Военно-медицинский журнал. - 1984. - № 5. - С. 39-40.
3. Бондаренко, В. М. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике / В. М. Бондаренко // Приложение к «Журналу инфектоло-гии». - 2011. - Том 3, № 3. - С. 15-19.
4. Брусина, Е. Б. Принципы профилактики внутрибольничных гнойно-септических инфекций в хирургических стационарах / Е. Б. Брусина // Главная медицинская сестра. - 2002. - № 11. -С.113-115.
5. Государственная Фармакопея Российской Федерации. 12-ое издание. Часть 1. - М. : Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 696 с.
6. Куликов, Е. Е. Разнообразие и динамика бактериофагов в фекалиях лошадей / Е. Е. Куликов, А. С. Исаева, А. С. Роткина, А. А. Маныкин, А. В. Летаров // Микробиология. - 2007. -Т. 76, № 2. - С. 271-278.
7. Несвижский, Ю. В. Пат. 2377006 Рос. Федерация, МПК A61K35/76, A61P31/10 Препарат, содержащий стафилококковый бактериофаг в качестве препарата для лечения кандидоза / Ю. В. Несвижский, В. А. Алешкин, С. С. Афанасьев и др. ; заявители и патентообладатели ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова Росздрава, ГОУ ВПО АГМА Росздрава, ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора. - № 2008118996/15; заявл. 15.05.2008; опубл. 27.12.2009. Бюл. № 36.
8. Руководство по экспериментальным (доклиническим) исследованиям новых фармакологических веществ / под ред. Р. У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М. : ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с.
9. Abedon, S. T. Phage treatment of human infections / S. T. Abedon, S. J. Kuhl, B. G. Blasdel, E. M. Kutter // Bacteriophage. - 2011. - Vol. 1, № 2. - P. 66-85.
10. Adams, H. M. Bacteriophages / H. M. Adams. - New York : Interscience Publishers, Inc., London : Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.
11. Alisky, J. Bacteriophages show promise as antimicrobial agents / J. Alisky, K. Iczkowski, A. Rapoport, N. Troitsky // J. Infect. - 1998. - Vol. 36, № 1. - P. 5-15.
12. Bacteriophages / Edited by I. Kurtboke. - Rijeka : InTech, 2012. - 256 p.
13. Breitbart, M. Viral diversity and dynamics in an infant gut / M. Breitbart, M. Haynes, S. Kelley et al. // Research in Microbiology. - 2008. - Vol. 159, № 5. - P. 367-373.
14. Brussow, H. Phage therapy: the Escherichia coli experience / H. Brussow // Microbiology. - 2005. - Vol. 151, № 7. - P. 2133-2140.
15. European Food Safety Authority, European Centre for Disease Prevention and Control // EFSA Journal. - 2012. - Vol. 10, Issue 3: 2597. - 442 p.
16. Goodridge, L. Bacteriophage control and bioprocessing: Application of phage therapy to industry / L. Goodridge, S T. Abedon // SIM News. - 2003. - Vol. 53, № 6. - P 254-262.
17. Goodridge, L. D. Phage-based biocontrol strategies to reduce foodborne pathogens in foods / L. D. Goodridge, B. Bisha // Bacteriophage. - 2011. - Vol. 1, № 3. - P. 130-137.
18. Greer, G. G. Bacteriophage control of foodborne bacteria / G. G. Greer // Journal of Food Protection. - 2005. - Vol. 68, № 5. - P. 1102-1111.
19. Guenther, S. Virulent bacteriophage for efficient biocontrol of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods / S. Guenther, D. Huwyler, S. Richard, M. J. Loessner // Appl. Environ. Microbiol. - 2009. - Vol. 75, № 1. - P. 93-100.
20. Letarov, A. V. Ecological basis for rational phage therapy / A. V. Letarov, A. K. Golomidova, K. K. Tarasyan / Acta Naturae. - 2010. - Vol. 2, № 1. - P. 60-72.
21. Lusiak-Szelachowska, M. Escherichia coli bacteriophages in human stool of patients with gastrointestinal tract diseases / M. Lusiak-Szelachowska, A. Annabhani, B. Weber-Dabrowska et al. // Gastroen-terologia Polska. 2008. - Vol. 15, № 2. - P. 87-90.
22. Mai, V. Bacteriophage administration reduces the concentration of Listeria monocytogenes in the gastrointestinal tract and its translocation to spleen and liver in experimentally infected mice / V. Mai, M. Ukhanova, L. Visone, T. Abuladze, A. Sulakvelidze // International Journal of Microbiology. - 2010. - Vol. 2010, ID 624234 - 6 p.
23. Sulakvelidze A. Bacteriophage: A new journal for the most ubiquitous organisms on Earth / A. Sulakvelidze // Bacteriophage. - 2011. - Vol. 1, № 1. - P. 1-2.
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук, МВА, руководитель лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212,
г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: ava@gabri.ru.
Воложанцев Николай Валентинович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 142279, п. Оболенск, Серпуховский район, Московская область, тел.: (4967) 36-00-79, e-mail: nikvol@obolensk.org.
Светоч Эдуард Арсеньевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий отделом молекулярной микробиологии ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия, 142279, п. Оболенск, Серпуховский район, Московская область, тел.: (4967) 36-00-79, e-mail: svetoch@obolensk.org.
Алешкин Владимир Андрианович, заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор биологических наук, директор ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: info@gabrich.com.
Афанасьев Станислав Степанович, заслуженный деятель науки РФ, профессор, доктор медицинских наук, заместитель директора ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова,
д. 10, тел.: (495) 708-02-62, e-mail: info@gabrich.com.
Борзилов Александр Иосифович, кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией биологических испытаний микробиологии ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, Россия, 142279, п. Оболенск, Серпуховский район, Московская область, тел.: (4967) 36-00-79, e-mail: info@obolensk.org.
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия», Россия, 432063, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, д. 1, тел.: (84231) 5-12-68, e-mail: dav_ul@mail.ru.
Золотухин Сергей Николаевич, доктор биологических наук, декан ветеринарного факультета экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия», Россия, 432063, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, д. 1, тел.: (84231) 5-12-68, e-mail: fvm.zol@yandex.ru.
Караулов Александр Викторович, член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой клинической аллергологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России, Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел.: (495) 708-02-62, e-mail: info@gabrich.com.
Галимзянов Халил Мингалиевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней, ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 52-41-43, e-mail: innoagma@gmail.com.
Космачев Юрий Федорович, начальник военно-медицинской службы Управления Федеральной службы безопасности Российской Федерации по Астраханской области, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Молодой Гвардии, д. 19 / ул. Михаила Аладьина, д. 7а, тел.: (8512) 40-38-33.
Киселева Ирина Анатольевна, научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: irina6804@mail.ru.
Афанасьев Максим Станиславович, доктор медицинских наук, профессор кафедры клинической аллергологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России, Россия, 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2, тел.: (495) 708-02-62, e-mail: info@gabrich.com.
Рубальский Евгений Олегович, аспирант ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел. (495) 708-02-62, e-mail: e.o.rubalsky@gmail.com.
Рубальский Максим Олегович, студент ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 52-41-43, e-mail: innoagma@gmail.com.
