CC BY
228
Инфекция и иммунитет 2012, Т. 2, № 4, с. 699-704
Оригинальные статьи
ЗНАЧИМОСТЬ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ОЦЕНКЕ ИХ ЭТИОЛОГИЧЕСКОЙ РОЛИ В РАЗВИТИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Е.С. Кунилова1, Л.А. Краева2, Г.Я. Ценева2, Г.Н. Хамдулаева2
1 Лабораторная служба «Хеликс», Санкт-Петербург
2 ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург
Резюме. Изучены следующие факторы патогенности у микроорганизмов, превалирующих при острых воспалительных процессах верхних дыхательных путей: адгезивные свойства, гемолитическая, гемаг-глютинирующая, нейраминидазная активность. Установлено, что наиболее выраженной адгезивностью обладают микроорганизмы рода Moraxella. Высокая гемолитическая и гемагглютинирующая активности присущи микроорганизмам родов Staphylococcus и Streptococcus. При выделении от больных микробных ассоциаций клинические проявления заболевания были более выраженными, так же как и факторы патогенности ассоциантов.
Ключевые слова: ^афилококки, стрептококки, моракселлы, факторы патогенности.
THE IMPORTANCE OF PATHOGENICITY FACTORS OF OPPORTUNISTIC MICROORGANISMS IN THE ASSESSMENT OF THEIR ROLE IN DISEASE DEVELOPMENT
Kunilova E.S., Kraeva L.A., Tseneva G.Y., Hamdulayeva G.N.
Absract. The following pathogenicity factors of microorganisms prevailed in case of acute inflammation of the upper respiratory tract were studied: adhesive characteristics, hemolytic, hemagglutination, neuraminidase activities. It was established that microorganisms of the Moraxella genius have strongest adhesive characteristic. The high hemolytic and hemagglutination activity is inherent in microorganisms of the Staphylococcus and Streptococcus genius. In the case of isolation from patients microbial associations the clinical symptoms and pathogenicity factors of microbes-associates were more apparent. (Infekc. immun., 2012, vol. 2, N 4, p. 699—704)
Key words: Staphylococcus, Streptococcus, Moraxella, factors of pathogenicity.
Введение
В настоящее время все большее значение в развитии острых воспалительных процессов бактериальной этиологии приобретают условно-патогенные микроорганизмы [6]. Реализация условной патогенности решается в индивидуальных системах «макромикроорганизм», так как зависит от резистентности хозяина и вирулентности микроба [4, 5].
Повышенная чувствительность характерна для лиц с ослабленным иммунитетом — местным или общим, специфическим или неспецифическим [4, 6].
Патогенность (болезнетворность) — видовой признак микроорганизма. Степень патогенности различна и определяет вирулентность внутри штаммов одного вида [9]. Благодаря генетическим изменениям болезнетворность штаммов может колебаться в довольно широ-
поступила в редакцию 29.07.2012 Адрес для переписки:
отправлена на доработку 21.08.2012 Кунилова Елена Сергеевна, 197022, Санкт-Петербург,
принята к печати 03.09.2012 врач-лаборант Лабораторной службы Каменноостровский пр., 42, литера А.
«Хеликс» Тел./факс: (812) 309-12-21.
© Кунилова Е.С. и соавт., 2012 E-mail: [email protected]
ких пределах: даже для возбудителей особо опасных инфекций могут быть получены ави-рулентные штаммы, и, наоборот, безвредные бактерии можно сделать носителями генов вирулентности [6]. При этом немаловажное значение имеют условия культивирования микроорганизмов (физические и химические факторы).
Как известно, основными факторами, определяющими болезнетворность микроорганизма, являются: способность к колонизации в зоне первичного инфицирования, инвазивные свойства, токсигенность, способность к персистенции [6]. Изучение перечисленных факторов патогенности особенно актуально при оценке этиологической значимости выделенных из клинического материала бактерий, особенно при обнаружении ассоциаций микроорганизмов [18]. Поэтому целью работы явилось обоснование необходимости изучения факторов патогенности у выделенных из клинического материала бактерий для оценки их роли в развитии заболевания.
Материалы и методы
Изучено 1878 образцов клинического материала от пациентов с острыми респираторными заболеваниями верхних и средних отделов дыхательных путей: соскобы со слизистых носоглотки, ротоглотки, мокроты. Взятие материала, его посев и идентификацию осуществляли согласно Приказу № 535 «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, используемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» (от 22.04.1985 г.). Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили, используя «Определитель бактерий Берджи» (1997), учебное пособие «Микробиология» под редакцией В.И. Покровского (1999) и Manual of Clinical Microbiology (2 Volume Set), PR. Murray (2007) [7, 24].
При изучении факторов патогенности у выделенных микроорганизмов были использованы следующие методики: гемолитическая активность исследовалась по В.М. Никитину (1986) в модификации Ж.Н. Маниной с использованием эритроцитов барана и человека 0(I) и А(П) групп крови. Культуры выращивались на мартеновском бульоне при 37°С в условиях относительного анаэробиоза в течение 4 суток. После центрифугирования при 5000 об./мин в течение 15 мин надосад очная жидкость использовалась для постановки реакции микрометодом (в планшетах). Учет осуществляли через 2 ч термостатирования при 37°С.
Гемагглютинирующая активность исследовалась подобным же образом, но с эритроцитами барана, а учет осуществлялся через 24 ч (2 ч термостатирования при 37°С, а остальное время — в холодильнике).
Адгезивная активность определялась по методике В.И. Брилиса и соавт. [1, 2, 3] с использованием эритроцитов человека 0(!) группы Rh(+), взятых в день исследования. Учет осуществлялся через 24 ч (2 ч термостатирования при 37°С, а остальное время — в холодильнике). Выраженность адгезии определялась количеством «крестов» (максимальная выраженность — эритроциты устилают дно лунки, 4+).
Нейраминидазная активность опеделялась по методике В.М. Никитина с использованием эритроцитов человека 0(!) группы и диагно-стикума вируса гриппа А2 микрометодом. Учет осуществляли через 2 ч инкубации при 37°С.
ТАБЛИЦА 1. МИКРООРГАНИЗМЫ, ВЫДЕЛЕННЫЕ ПРИ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ИЗ ВЕРХНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
Количество
Название микроорганизмов выделенных
штаммов
Staphylococcus всего: 712
S. aureus 441
S. delphini 43
S. intermedius 57
S. epidermidis 78
S. haemolyticus 64
S. hyicus 29
Streptococcus всего: 508
S. agalactiae 188
S. anginosus 41
S. equi 142
S. pneumoniae 71
S. pyogenes 66
Moraxella catarrhalis всего: 411
Corynebacterium всего: 153
C. auris 7
C. haemolyticum 4
C. pseudodiphtheriticum 66
C. pyogenes 1
C. striatum 6
C. xerosis 69
Klebsiella всего: 80
K. oxytoca 9
K. pneumoniae 71
Candida всего: 54
C. albicans 36
C. glabrata 3
C. krusei 13
C. tropicalis 2
Другие микроорганизмы 88
Математическую обработку полученных данных выполняли на персональном компьютере с использованием стандартного статистического пакета STATISTICA. Для первичной подготовки таблиц и промежуточных расчетов использовали пакет Excel.
Результаты
При исследовании 1878 образцов клинического материала было выделено 2006 штаммов этиологически значимых микроорганизмов. При этом все обследованные были направлены на бактериологическое исследование для установления причины воспалительного процесса в верхних и средних отделах респираторного тракта. Из них в 13% случаев соотношение бактериальной флоры находилось в норме, в то время, как в остальных 87% был
определен этиологически значимый микроорганизм. В 22% случаев отмечались ассоциации микроорганизмов: 346 ассоциаций по 2 микроорганизма и 13 ассоциаций по 3 микробных агента. При этом наиболее часто встречались стафилококки, стрептококки, моракселлы (табл. 1).
Наиболее часто выявлялись следующие ассоциации микроорганизмов: Streptococcus + Moraxella и Staphylococcus + Corynebacterium.
У наиболее часто встречаемых микроорганизмов были изучены следующие факторы патогенности: адгезивные свойства, гемолитическая, гемагглютинирующая, нейрамини-дазная активность (табл. 2, 3, 4, 5).
Как видно из таблиц, наиболее выраженными адгезивными свойствами обладают представители рода Moraxella, в то время как микро-
ТАБЛИЦА 2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ У МИКРООРГАНИЗМОВ РОДОВ STAPHYLOCOCCUS, STREPTOCOCCUS, MORAXELLA
Параметры Реакция позитивна в титрах
0 + ++ +++ ++++
Среднее значение удельного веса среди штаммов Staphylococcus 14,00 22,00 41,00 16,00 7,00
Streptococcus 42,00 31,00 14,00 12,00 1,00
Moraxella 6,00 13,00 37,00 33,00 11,00
ТАБЛИЦА 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ У МИКРООРГАНИЗМОВ РОДОВ STAPHYLOCOCCUS, STREPTOCOCCUS, MORAXELLA
Параметры Реакция позитивна в титрах
0 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
Среднее значение удельного веса среди штаммов Staphylococcus 0,30 7,00 28,00 36,00 26,70 2,00
Streptococcus 0,40 3,00 23,00 46,00 18,00 9,60
Moraxella 36,00 31,00 19,00 8,00 6,00 0,00
ТАБЛИЦА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМАГГЛЮТИНИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ У МИКРООРГАНИЗМОВ РОДОВ STAPHYLOCOCCUS, STREPTOCOCCUS, MORAXELLA
Параметры Реакция позитивна в титрах
0 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
Среднее значение удельного веса среди штаммов Staphylococcus 2,00 8,00 36,00 33,00 16,00 5,00
Streptococcus 5,00 14,00 27,00 26,00 25,00 3,00
Moraxella 21,00 33,00 19,00 14,00 8,00 5,00
ТАБЛИЦА 5. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙРАМИНИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У МИКРООРГАНИЗМОВ РОДОВ STAPHYLOCOCCUS, STREPTOCOCCUS, MORAXELLA
Параметры Реакция позитивна в титрах
0 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32
Среднее значение удельного веса среди штаммов Staphylococcus 6,00 8,00 14,00 33,00 20,00 19,00
Streptococcus 4,00 7,00 17,00 29,00 26,00 17,00
Moraxella 22,00 27,00 21,00 14,00 8,00 8,00
7G1
организмы родов Staphylococcus и Streptococcus имеют высокую нейраминидазную, гемолитическую и гемагглютинирующую активность. Однако среди представителей одного рода наблюдались неоднородные показатели, отличавшиеся не только между видами внутри рода, но и между штаммами одного вида.
При изучении указанных свойств у представителей микробных ассоциаций было выявлено, что адгезивная и нейраминидазная активность у ассоциантов в среднем в два раза выше, чем у представителей монокультур. В ассоциациях, состоящих из трех этиологически значимых микроорганизмов чаще всего присутствовали дрожжевые клетки рода Candida.
Обсуждение
Колонизация представляет собой прикрепление (адгезию) и дальнейшее размножение бактерий в зоне инфицирования. Этот процесс начинается с адгезии, в основе которой лежит избирательное взаимодействие с рецепторами эпителиоцитов и слизистым слоем [11, 13, 17]. У стафилококков и стрептококков большую роль в этом играет их гидро-фобность и наличие капсул, а также липотей-хоевых кислот в поверхностных фимбриях [8, 16]. Специфические белки фимбрий у представителей рода Moraxella обусловливают их высокую адгезивную активность несмотря на отсутствие у большинства штаммов капсулы [16, 17, 20, 23]. Наличие целого ряда белков наружной мембраны и липолисаха-ридных комплексов, участвующих в прикреплении к эпителиальным клеткам, у микроорганизмов родов Staphylococcus, Streptococcus и Moraxella обеспечивает пролонгацию первого этапа инфицирования и создает предпосылки для размножения бактерий (табл. 2). При этом прикрепившиеся микроорганизмы должны быть способны противостоять био-цидным и биостатическим факторам, которые в разных количествах и в разных соединениях представлены в секретах мукоидного тракта [9, 10]. Среди микроорганизмов, поражающих слизистые оболочки, способность к продукции ^А-протеаз, которые расщепляют ^А, тем самым лишая их антиадгезив-ного эффекта, в наибольшей мере присуща стафилококкам и стрептококкам. Однако наличие специфичных для грамотрицательных бактерий высокоактивных протеаз позволяет клеткам Moraxella преодолевать барьерные функции слизистых оболочек и колонизироваться в месте входных ворот [21, 26]. Отмечено, что у лиц, накануне перенесших ви-
русную инфекцию, превалировали штаммы, обладающие в среднем в 2 раза меньшей адгезивной активностью, чем у лиц с первичной бактериальной инфекцией. Это объясняется, по-видимому, тем, что поврежденный в результате жизнедеятельности вирусных частиц слизистый слой не может противостоять обитающим на нем бактериальным клеткам даже с незначительно выраженными факторами патогенности.
После успешной адгезии микроорганизмов начинается следующий этап — инвазия, то есть способность проникать в ткани, которые лежат за пределами входных ворот инфекции, и размножаться в них. Механизмы инвазии у трех представленных родов микроорганизмов могут быть как внутриэпителиальными и субэпителиальными, так и внутрисосуди-стыми, проявляющимися в виде бактериемии. Как видно из табл. 5, наибольшие значения нейраминидазной активности, определяющей инвазивные свойства микробов, выявлены у стафилококков и стрептококков. Однако отдельные штаммы представителей вида Moraxella catarrhalis имели высокие значения нейраминидазной активности. Эти культуры были выделены из мокроты и материала, взятого при бронхоальвеолярном лаваже, у больных с бронхитами и пневмониями, что указывает на связь выраженности инвазивных свойств микробов и генерализацией процесса при инфицировании ими [15, 30, 31].
Дальнейшему распространению микробов в организме человека способствуют различные токсины, которые вырабатываются микроорганизмами. Поскольку известно, что стафилококки и стрептококки обладают целым рядом подобных гемолизинов и гемагглютининов, то штаммы этих двух родов наряду с представителями рода Moraxella, были изучены с точки зрения количественной их оценки (табл. 3, 4). Наиболее выражены эти факторы у стафилококков и стрептококков; у микроорганизмов Moraxella catarrhalis они проявляются в меньшей степени, однако присущи практически всем штаммам [11, 19, 21, 27]. Причем, наибольшие значения гемолитической и гемагглюти-нирующей активностей у Moraxella catarrhalis были присущи штаммам, выделенным от пациентов с хронической инфекцией [25].
Выявленные свойства во многом объясняют возможность персистенции микроорганизмов, обусловленной их способностью длительное время циркулировать и выживать в патологическом очаге [10, 12, 29]. Этот процесс объясняется тем, что микроорганизм способен длительное время противостоять влиянию за-
щитных факторов макроорганизма. На фоне ослабленного иммунитета (общего и местного) этот процесс может значительно усугубляться. Поэтому своевременное выявление важных факторов патогенности у наиболее значимых микроорганизмов — возбудителей острых воспалительных процессов, может помочь прогнозировать течение инфекционного процесса и вовремя выбрать адекватную тактику лечения.
Список литературы
1. Карась С.Р. Адгезивные свойства дифтерийных бактерий, выделенных от различных источников: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — М., 1990. — 22 с.
2. Костюкова Н.Н. Значение адгезии C. diphtheriae в эпидемиологии дифтерии // Тез. докл. IV Все-рос. съезда микробиол., эпидемиол. и парази-тол. — Н. Новгород, 1991. — Т. 1. — С. 34-35.
3. Костюкова Н.Н. Начальный этап инфекционного процесса — колонизация и пути ее предотвращения // ЖМЭИ. — 1989. — № 9. — С. 103-110.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология. — СПб.: Специальная литература, 1998. — 580 с.
5. Маянский А.Н. Микробиология для врачей. — Н. Новгород: Изд-во НГМА, 1999. — 393 с.
6. Медицинская микробиология / Под ред. В.И. Покровского, О.К. Поздеева. — М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. — 1200 с.
7. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крита и др.; пер с англ. — М.: Мир, 1997. — 800 с.
8. Akgul G., Erturk A., Turkoz M., Turan T., Ichinose A., Nagatake T., Ahmed K. Role of lipooligosaccharide in the attachment of Moraxella catarrhalis to human pharyngeal epithelial cells // Microbiol. Immunol. — 2005. — N 49. — P. 931-935.
9. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity // Cell. — 2006. — N 124. — P. 783-801.
10. Attia A.S., Lafontaine E.R., Latimer J.L., Aebi C., Syrogiannopoulos G.A., Hansen E.J. The UspA2 protein of Moraxella catarrhalis is directly involved in the expression of serum resistance // Infect. Immun. — 2005. — N 73. — P. 2400-2410.
11. Balder R., Hassel J., Lipski S., Lafontaine E.R. Moraxella catarrhalis strain O35E expresses two filamentous hemagglutinin-like proteins that mediate adherence to human epithelial cells // Infect. Immun. — 2007. — N 75. — P. 2765-2775.
12. Bootsma J.H., van der Heide H.G., van de Pas S., Schouls L.M., Mooi F.R. Analysis of Moraxella catarrhalis by DNA typing: evidence for a distinct subpopulation associated with virulence traits // J. Infect. Dis. — 2000. — N 181. — P. 1376-1387.
13. Bullard B., Lipski S., Lafontaine E.R. Regions important for the adhesin activity of Moraxella catarrhalis Hag // BMC Microbiol. — 2007. — N 7. — P. 65.
14. Catlin B.W. Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen // Clin. Microbiol. Rev. — 1990. — N 3. — P. 293-320.
15. Cossart P., Sansonetti PJ. Bacterial invasion: the paradigms of enteroinvasive pathogens // Science. — 2004. — N 304. — P. 242-248.
16. Craig L., Pique M.E., Tainer J.A. Type IV pilus structure and bacterial pathogenicity // Nat. Rev. Microbiol. — 2004. — N 2. — P. 363-378.
17. Gorter A.D., Oostrik J., van der Ley P., Hiemstra P.S., Dankert J., van Alphen L. Involvement of lipooli-gosaccharides of Haemophilus influenzae and Neisseria meningitidis in defensin-enhanced bacterial adherence to epithelial cells // Microb. Pathog. — 2003. — N 34. — P. 121-130.
18. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases // Nat. Rev. Microbiol. — 2004. — N 2. — P. 95-108.
19. Hodak H., Clantin B., Willery E., Villeret V., Locht C., Jacob-Dubuisson F. Secretion signal of the filamentous haemagglutinin, a model two-partner secretion substrate // Mol. Microbiol. — 2006. — N 61. — P. 368-382.
20. Holm M.M., Vanlerberg S.L., Foley I.M., Sledje-ski D.D., Lafontaine E.R. The Moraxella catarrhalis porin-like outer membrane protein CD is an adhesin for human lung cells // Infect. Immun. — 2004. — N 72. — P. 1906-1913.
21. Holme T., Rahman M., Jansson P.E., Widmalm G. The lipopolysaccharide of Moraxella catarrhalis structural relationships and antigenic properties // Eur. J. Biochem. — 1999. — N 265. — P. 524-529.
22. Jacques M. Role of lipooligosaccharides and lipo-polysaccharides in bacterial adherence // Trends Microbiol. — 1996. — N 4. — P. 408-409.
23. Luke N.R., Jurcisek J.A., Bakaletz L.O., Campag-nari A.A. Contribution of Moraxella catarrhalis type IV pili to nasopharyngeal colonization and biofilm formation // Infect. Immun. — 2007. — N 75. — P. 5559-5564.
24. Microbiology Laboratory Manual / J. Harley, J.P. Harley; 7th Edition. — USA, 2007. — 2256 p.
25. Murphy T.F., Brauer A.L., Grant B.J., Sethi S. Mora-xella catarrhalis in chronic obstructive pulmonary disease: burden of disease and immune response // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2005. — N 172. — P. 195-199.
26. Nordstrom T., Blom A.M., Forsgren A., Ries-beck K. The emerging pathogen Moraxella catar-rhalis interacts with complement inhibitor C4b binding protein through ubiquitous surface proteins A1 and A2 // J. Immunol. — 2004. — N 173. — P. 4598-4606.
27. Pearson M.M., Laurence C.A., Guinn S.E., Hansen E.J. Biofilm formation by Moraxella catarrhalis in vitro: roles of the UspA1 adhesin and the Hag hemagglutinin // Infect. Immun. — 2006. — N 74. — P. 15881596.
28. Reddy M. S., Murphy T.F., Faden H.S., Bernstein J.M. Middle ear mucin glycoprotein: purification and interaction with nontypable Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis // Otolaryngol. Head Neck Surg. — 1997. — N 116. — P. 175-180.
29. Sethi S., Sethi R., Eschberger K., Lobbins P., Cai X., Grant B.J., Murphy T.F. Airway bacterial concentra-
tions and exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease // Am. J. Respir. Crit. Care Med. — 2007. — N 176. — P. 356-361.
30. Spaniol V., Heiniger N., Troller R., Aebi C. Outer membrane protein UspA1 and lipooligosaccharide are involved in invasion of human epithelial cells by Moraxella catarrhalis // Microbes Infect. — 2008. — N 10. — P. 3-11.
31. Vries S. P.W., B o otsma H. J., Hays J. P., Hermans P.W. M. Molecular aspects of Moraxella catarrhalis pathogenesis // Microbiol. Mol. Biol. Rev. — 2009. — Vol. 73, N 3. — P. 389-406.
