CC BY
56
Значение уровня концентрации специфических антител в элиминации разных штаммов вируса клещевого энцефалита
Г.Н. Леонова (galinaleon41@gmail.com), В.А. Лубова, А.В. Калинин
ФГБНУ«Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», Владивосток
Резюме
Показана способность различных титров специфических антител нейтрализовать отличающиеся по вирулентности штаммы вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). В работе использовался специфический иммуноглобулин с титрами 1:100,1:400 и 1:3200 и два штамма ВКЭ с дозой 3 lg ТЦД50/мл (Dal negorsk - высоко патогенный и Primorye-437 - не патогенный для человека). Активность не нейтрализованного вируса изучалась in vitro и in vivo спустя 3, 24, 48, 72 ч после заражения культуры клеток СПЭВ. Иммуноглобулин в титре 1:100 не обладал защитным действием, в титре 1:400 ингибировал слабовирулентный штамм (Р-437), но не штамм Dal negorsk, в титре 1:3200 ингибировал полностью оба штамма. На модели разных штаммов вируса КЭ предложены новые подходы для изучения эффективности специфической вакцинопрофилактики, индивидуальном назначении количества и сроков ревакцинации при КЭ.
Ключевые слова: штаммы вируса клещевого энцефалита, антитела, защитные титры
The Value of the Effect of the Level of Specific Antibodeis on Elimination Different Tick-Borne Encephalitis Virus Strains
G.N. Leonova (galinaleon41@gmail.com), V.A. Lubova, A.V. Kalinin
Federal State Budgetary Scientific Institution «G.P. Somov Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology», Vladivostok Abstract
We have shown the levels of specific antibodies that can neutralize different strains on the virulence of the virus of tick-borne encephalitis (TBE). Specific immunoglobulin with its titers of 1:100, 1:400 и 1:3200 and two TBEV strains with its doses 3 lg TCID50/ ml (Dal negorsk - highly pathogenic, Primorye-437 - not pathogenic for humans). Evidential basis of the activity of residual virus has been obtained in vitro and in vivo in 3, 24, 48 and 72 hours after infection cells of culture PK and mice neinbrednyh by the test samples. Immunoglobulin does not have a protective effect, if its titer is 1:100; inhibits low virulent strain (P-437), but not Dal negorsk one, if its titer is 1:400; and inhibits both strains, it its titer is 1:3200. Regarding the models of different TBE virus strains, this article suggests new approaches to studying the efficacy of specific vaccine prophylaxis and individual prescription of the amount and terms of revaccination for tick-borne encephalitis.
Key words: tick-borne encephalitis virus strain's, antibodies, protective titer
Введение
Клещевой энцефалит (КЭ) впервые был открыт и описан на Дальнем Востоке в 1937 году учеными двух экспедиций под руководством Л.А. Зильбера. К настоящему времени известны тысячи штаммов и изолятов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), выделенные на обширной территории Евразийского континента. На основе биологических и молекулярно-генетических особенностей штаммы ВКЭ были подразделены на три субтипа: дальневосточный (I), европейский (II) и сибирский (III) [1]. Нами установлено, что штаммы ВКЭ, изолированные от умерших и больных КЭ людей в Приморском крае, принадлежат к одному дальневосточному субтипу и составляют три кластера. Причем, штаммы ВКЭ, вызвавшие манифестные формы инфекции, входят в кластеры Sofjin- и Senzhang-подобных, а штаммы, не вызвавшие манифестные формы инфекции, - в кластер Oshima-подобных [2]. Были выявлены и описаны
особенности патогенного потенциала гетерогенной популяции штаммов дальневосточного ВКЭ [3].
К настоящему времени много публикаций об эффективности специфической профилактики [4 - 6]. При этом среди вакцинированных по полной схеме регистрируются редкие случаи заболевания КЭ [7]. В этой связи при изучении иммунологической эффективности вакцинопрофилактики против КЭ приобретает значение показатель уровня сероконвер-сии, при котором формируется защита людей, зараженных разными по вирулентности штаммами ВКЭ.
Цель настоящих исследований - получить новые данные in vitro и in vivo о противовирусной активности специфических антител с разными титрами по отношению к высоко и низко вирулентным штаммам вируса клещевого энцефалита.
Материалы и методы
Штаммы вируса КЭ. В работе были использованы 2 штамма ВКЭ: Dal negorsk (Dal) выделен
в 1973 году из мозга умершего больного очаговой формой КЭ; Primorye-437 (Р-437) выделен в 1999 году из крови человека с укусом клеща, не заболевшего манифестной формой инфекции. Исходные титры штаммов вируса составляли для Dal - 8,0 lg ТЦД50/мл, Р-437 - 5,0 lg ТЦД50/мл. Использован «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита» производства «НПО «Микро-ген», (серия П609), титры в РТГА - 1:160 и в ИФА -1:3200.
Описание опыта. Приготовлено три разведения иммуноглобулина (ИГ) с титрами в ИФА 1:100, 1:400 и 1:3200. Затем 0,9 мл ИГ каждого титра соединяли с 0,1 мл каждого штамма вируса КЭ содержащего 4,0 lg ТЦД50/мл, после чего рабочая доза вируса в опыте составила 3,0 lg ТЦД50/мл. В качестве контроля служили пробы штаммов вируса КЭ без иммуноглобулина. Приготовленные пробы помещали на 2 ч в холодильник +4 °С, которые наносили на монослой клеток СПЭВ на пробирках (по 3 пробирки). После 1 ч контакта в термостате монослой трижды промывали средой 199, заливали поддерживающей средой 199 с гентамицином и с 1% эмбриональной сыворотки коров и помещали в термостат для дальнейшего наблюдения за накоплением вируса в клетках и в культуральной жидкости спустя 3, 24, 48, 72 ч. Для учета усредненных показателей формировали из трех пробирок смесь для каждого срока наблюдения. Из клеток готовили слайды на предметных стеклах для подсчета процента зараженности клеток вирусом в непрямом методе иммунофлюоресценции (НМФА). Антиген ВКЭ внутри клеток выявляли с помощью нанесения иммунной сыворотки против ВКЭ и затем флуоресцирующих иммуноглобулинов (ФИТС) в рабочем разведении, указанном в инструкции изготовителя (Филиал «МЕДГАМАЛ», ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Просмотр слайдов проводили на микроскопе флуоресцентном MC-200 TF (MicroOptix, Австрия). Для вычисления процента антигенсодержащих клеток СПЭВ, инфицированных экспериментальными пробами, для каждого образца в пяти микроскопных полях (100 - 120 клеток на поле) подсчитывали общее количество клеток и иммунофлюоресцент-нопозитивных клеток. Процент вирус-положительных клеток определяли соотношением количества инфицированных вирусом клеток к общему количеству клеток.
Кроме того, интенсивность свечения антигена на 3-и сут. наблюдения визуализировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM710 (Carl Zeiss). В динамике опыта использовали контроли незараженных клеток СПЭВ и клетки, зараженные штаммами вируса КЭ.
Определяли титр вируса в надосадочной куль-туральной жидкости, которой после десятикратного разведения заражали односуточный монослой клеток СПЭВ, выращенных на 24-х луночных планшетах. После 1 ч контакта при температуре 37 °С зараженный монослой клеток промывали культуральной
средой 199, затем добавляли поддерживающую среду 199 с гентамицином и с 1% эмбриональной сывороткой коров и помещали в термостат. Наблюдения за цитопатическим действием штаммов проводили в течение 5 - 7 суток.
Кроме того, культуральной жидкостью экспериментальных проб, собранных спустя 72 часа, заражали подкожно по 0,2 мл не инбредных мышей весом 12 - 14 г (по 6 мышей на точку). Срок наблюдения составил 21 сут. О наличии вируса в экспериментальных пробах определяли по проценту павших животных и их средней продолжительности жизни (СПЖ). Животные содержались в условиях вивария, регламентируемых приказом Минздрава СССР №1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами Минздрава СССР №755 от 12.09.1977 г. и №701 от 27.07.1978 г. «Об обеспечении принципов гуманного обращения с животными».
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программ Statistica и Excel.
Результаты и обсуждение
В ранее опубликованных нами работах [8, 9] был определен титр антител, обеспечивающий уровень иммунологической памяти (1:100) и защитный титр (1:400) специфических антител при эпидемически значимой заражающей дозе ВКЭ, равной 3,0 lg ТЦД50/мл. В настоящей работе мы расширили рамки исследования, а именно: определяли остаточное количество вируса после взаимодействия разных по патогенности для человека штаммов ВКЭ со специфическими антителами (ИГ в титрах 1:100, 1:400 и 1:3200) в динамике (0, 3, 24, 48, 72 час) in vitro и in vivo. Мы полагали, что таким образом сможем дополнить и уточнить представление о защитном уровне специфических антител у лиц, привитых против КЭ. С этой целью одновременно были проведены сравнительные наблюдения за процессом внутриклеточного и внеклеточного накопления штаммов Dal и Р-437 вируса КЭ в пробах с разными титрами ИГ и без ИГ (контроль вируса).
Под действием ИГ внутриклеточное накопление антигена обоих штаммов ВКЭ более активно происходило при низком титре ИГ 1:100, замедленно - при титре 1:400 и отсутствие антигена зарегистрировано при титре ИГ 1:3200 (рис.1 А, В). Кроме того, интенсивность специфического свечения антигена штаммов ВКЭ, обработанных ИГ с разными титрами (1:100 и 1:400), спустя 72 ч после заражения клеток СПЭВ, наглядно показана с помощью конфокальной микроскопии. На рисунке 2 видно, что спустя 72 часа свечение антигена в пробах ИГ с титром 1:100 (слайды 3, 7) практически равноценно свечению антигена в контроле (слайды 2, 6). При титре ИГ 1:400 встречаются единично светящиеся клетки (слайды 4, 8).
Об уровне не нейтрализованного вируса специфическим ИГ с разными титрами можно судить
Рисунок 1.
Динамика накопления антигена в клетках СПЭВ, зараженных экспериментальными пробами (вирус КЭ + иммуноглобулин (ИГ) в титрах 1:100, 1:400 и 1:3200), в разные сроки наблюдения (А - опытные пробы со штаммом Dal negorsk; В - опытные пробы со штаммом Primorye-437).
80 —
70 —
60 —
50 —
40 —
30 —
20 —
10 —
КЭ + ИГ 3200 КЭ + ИГ 400 КЭ + ИГ 100 ВКЭ (Dal)
24
48
72
Часы наблюдений
80
70
60
50
40
30
20
10
КЭ + ИГ 3200 КЭ + ИГ 400 КЭ + ИГ 100 ВКЭ (Р-437)
24
48
72
Часы наблюдений
не только по количеству антигена в клетках, но и по накоплению полноценных вирионов в куль-туральной жидкости клеток СПЭВ, зараженных изучаемыми штаммами ВКЭ. На рисунке 3 видно, что ИГ в титре 1:100 во все сроки наблюдения оказывал слабое вирулицидное действие по отношению к обоим штаммам, накопление которых по сравнению с контролем вируса наблюдалось, но с запозданием на 1 сут. Иммуноглобулин в титре 1:400 спустя 72 ч после заражения клеток способен затормозить развитие штамма Dal на 2 lg ЦПД50/мл и штамма Р-437 - на 1,5 lg ЦПД50/мл. Причем, штамм Р-437 появился в культуральной жидкости спустя 72 ч. И только ИГ с титром 1:3200 во все сроки наблюдения задерживал размножение обоих штаммов вируса КЭ.
Полученные данные in vitro следовало подтвердить in vivo путем подкожного введения белым мышам культуральной жидкостью клеток СПЭВ, зара-
женных опытными пробами. Как видно в таблице 1, на 3 сут количество активного вируса в пробах штамма Dal> с ИГ (1:100 и 1:400) восстановилось до контрольного уровня, вызывая 100% гибель животных. В пробах со штаммом Р-437 иммуноглобулин в титре 1:100 защищал 33,2%, в титре 1:400 - 100% животных. Иммуноглобулин с высоким титром (1:3200) полностью ингибировал оба штамма, о чем свидетельствовали также данные по внутриклеточному накоплению специфического антигена (рис. 1) и внеклеточному накоплению реплициро-ванного вируса клетками СПЭВ, зараженными экспериментальными пробами (рис. 3).
Учитывая, что в настоящем эксперименте были взяты два разных по патогенности для человека штамма ВКЭ в титре 3 ^ ТЦД50/мл, можно предположить, что вакцинированные люди с титром антител 1:100 могут не заболеть только при условии, что доза вируса, проникшего в кровь, будет очень
А
0
3
В
0
3
Рисунок 2.
Интенсивность специфического свечения антигена штаммов (Dal>negorsk и Рптогуе-437) вируса КЭ, обработанных специфическим иммуноглобулином с титрами 1:100 и 1:400 спустя 72 ч после заражения клеток СПЭВ экспериментальными пробами
Примечание: Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия, изображения получены при проведении трех независимых экспериментов. Увеличение х 4000 раз. 1, 5 - контроль незараженных клеток СПЭВ; 2 - клетки, инфицированные штаммом Dal>negorsk; 3 - клетки, инфицированные штаммом Dal> + иммуноглобулин в титре 1:100; 4 - клетки, инфицированные штаммом Dal> + иммуноглобулин в титре 1:400; 6 - клетки, инфицированные штаммом Рг1тогуе-437; 7 - клетки, инфицированные штаммом Р-437+ иммуноглобулин в титре 1:100; 8 - клетки, инфицированные штаммом Р-437 + иммуноглобулин в титре 1:400.
Таблица 1.
Сравнительная активность in vivo вируса, реплицированного в клетках СПЭВ и поступившего в культуральную жидкость на 3 день наблюдения после заражения клеток штаммами Dalnegorsk и Primorye-437 вируса клещевого энцефалита
Штаммы вируса КЭ Показатели Контроль Вирус+иммуноглобулин с титрами:
1:100 1:400 1:3200
Dal>negorsk % павших мышей 100 100 100 0
СПЖ мышей 7,3 7,5 8,3 21
Primorye-437 % павших мышей 100 66,8 0 0
СПЖ мышей 12,3 15 21 21
низкой, или, естественно, если это будет невирулентный штамм ВКЭ. Однако даже при таких условиях вероятность заболеть КЭ остается все же высокой. Известно, что в группе вакцинированных лиц встречаются случаи с лихорадочной формой КЭ и иногда с менингиальной [7]. Такие случаи возможны у вакцинированных не только при уровне антител 1:100, но и при более высоких титрах специфических антител. Нельзя с уверенностью считать, что титр антител 1:400 является защитным, как было показано нами ранее [8, 9]. Тем более, что у некоторых лиц могут формироваться низкие показатели специфических антител при вакцинации даже высоко иммуногенными вакцинами против КЭ [8, 10]. В настоящих экспериментах установлено: остаточный вирус хоть и с запозданием
на 1 - 2 сут. способен реплицироваться, поступать в культуральную жидкость и вызывать цитопатиче-ский эффект зараженных клеток СПЭВ.
Ранее нами было показано, что штамм Р-437 обладает длительным периодом накопления вируса в мозге экспериментально зараженных белых мышей (7 - 14 сут), у которых была отмечена лишь незначительная реакция сосудов мягкой мозговой оболочки [11]. Выявленные нами [2] точечные мутации в активном центре вирусной сериновой протеазы (в комплексе NS2B/NS3) штамма Р-437, возможно, способствовали задержке накопления вируса в месте инокуляции, ограничивая распространение его в ЦНС. Вероятность выжить таким штаммам в организме даже у не вакцинированных лиц не высокая. Уже в начальном периоде инфек-
Рисунок 3.
Накопление вируса в культуральной жидкости клеток СПЭВ, зараженных экспериментальными пробами штаммов Dal' (А) и Р-437 (В) без иммуноглобулина (контроль вируса) и с иммуноглобулином в титрах 1:100, 1:400 и 1:3200
3,0 —
о ю
я £
2,0 —
1,5 —
1,0 —
0,5
0,0
КЭ+ИГ3200 КЭ+ИГ400 КЭ+ИГ 100 ВКЭ(Ра!)
24 48
Часы наблюдений
72
КЭ+ИГ3200 КЭ+ИГ400 КЭ+ИГ 100 ВКЭ (Р-437)
24 48
Часы наблюдений
72
ционного процесса, как правило, происходит элиминация их из организма. С более выраженным успехом элиминация вируса может происходить у вакцинированных лиц даже при низких титрах специфических антител.
Штаммы, вызвавшие манифестные формы инфекции, могут по-разному проявить себя в организме, в зависимости от исходного состояния иммунной системы, которая, как известно, может предопределить разное течение инфекционного процесса: либо элиминация вируса с последующим выздоровлением пациента, либо неблагоприятный исход. В этих случаях надежную защиту от заболевания у вакцинированных лиц может обеспечить только высокий титр специфических антител.
Длительное сохранение антител у некоторых привитых лиц, а также нарушение курса вакцинации
показывает на целесообразность индивидуального подхода к каждому пациенту перед проведением ревакцинации. Мы полагаем, если в сыворотке крови уровень ^ составляет 1:400 и ниже, следует продолжить курс вакцинации, при титре антител 1:800 и выше ревакцинацию можно отсрочить при условии ежегодного контроля показателей специфического иммунитета в предэпидемический сезон.
Представленные данные на модели разных штаммов вируса КЭ открывают новые возможности для изучения эффективности специфической вакцинопрофилактики, индивидуальном назначении количества и сроков ревакцинации не только при КЭ, но и при других инфекциях. Выводы
1. Показаны уровни специфических антител, способные нейтрализовать разные по вирулентности штаммы вируса клещевого энцефалита.
3
3
