CC BY
113
16. Wang H., Fu Z.M., Han C.C. The potential application of marine bioactives against diabetes and obesity. American Journal of Marine Science 2014; 2(1): 1-8. doi.org/ 10.12691/marine-2-1-1.
17. Yang C.H., Tsao S.F., Ko W.S., Chiou Y.L. The oligo fUcoidan inhibits platelet-derived growth factor-stimulated proliferation of airway smooth muscle
cells. Marine drugs 2016; 14(1): 15. doi.org/ 10.3390/ md 14010015.
18. Zaporozhets T., Besednova N. Prospects for the therapeutic application of sulfated polysaccharides of brown algae in diseases of the cardiovascular system: review. Pharm Biol. 2016; 1: 1-10. doi.org/10.1080/138 80209.2016.1185444 .
Сведения об авторах
Крыжановский Сергей Петрович, д.м.н., главный врач ФГБУЗ «Медицинское объединение ДВО РАН» 90022, г. Владивосток, Кирова, 95.
Гельцер Борис Изралиевич, д.м.н, чл.-корр. РАН. Директор Департамента фундаментальной и клинической медицины ДВФУ, Школа Биомедицины, г. Владивосток, о. Русский, кампус ДВФУ, корп. М25, каб. М522.
Иванушко Людмила Александровна, к.м.н., с.н.с. лаб. иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова. 690087, г. Владивосток, ул. Сельская 1.
Кузнецова Татьяна Алексеевна, д.м.н., зав. лаб. иммунологии НИИ зпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, 690087, г. Владивосток, ул. Сельская 1.
Ермакова Светлана Петровна д.х.н., зав. лаб. химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, 690022, Владивосток, Проспект 100 лет Владивостоку, 159.
Беседнова Наталья Николаевна, д.м.н., академик РАН, гл. науч. сотр. лаборатории иммунологии НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П.Сомова, 690087, г. Владивосток, ул. Сельская 1. тел.: +79147922110; е-mail: besednoff_lev@mail.ru.
© Г.Н. Леонова, 2017 doi: 10.5281/zenodo.345610
Удк: 616.988.25-002
Г.Н. Леонова
влияние специфических антител на процесс элиминации вируса клещевого энцефалита
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», Владивосток.
Известно, что у лиц, вакцинированных против вируса клещевого энцефалита (КЭ), формируется разный уровень специфического иммунного ответа.
Цель работы: показать в динамике экспериментальной инфекции противовирусную активность специфических антител по отношению к вирусу клещевого энцефалита (КЭ).
Материалы и методы: эксперименты проведены in vitro (на модели клеточной культуры СПЭВ) и in vivo - на модели белых мышей 12-14 г. В работе был использован высоковирулентный штамм Dalnegorsk (Dal) вируса КЭ и иммуноглобулин против КЭ производства «НПО «Микроген».
Результаты. Показана разная степень ингибирующего действия специфических антител против вируса клещевого энцефалита в титрах 1:100, 1:400 и 1:3200. Антитела с титром 1:400, обладая прямым противовирусным действием по отношению к эпидемически значимой дозе (3 lg ТЦД50) вируса КЭ, могут быть эффективны только на ранних стадиях инфекционного процесса; антитела с титром 1:3200 защищают от вируса во все сроки наблюдения (3-72 часа).
Сделано заключение: у лиц, получивших курс специфической вакцинации, имеющих титр антител к вирусу КЭ 1:800 и выше, очередную ревакцинацию можно перенести на следующий год. В предэпидеми-ческий сезон этим лицам рекомендовано исследовать кровь на напряженность иммунитета к вирусу КЭ для решения вопроса о сроках ревакцинации.
Ключевые слова: клещевой энцефалит (КЭ), вирус клещевого энцефалита, антитела, противовирусное действие.
Для цитирования: Леонова Г.Н. Влияние специфических антител на процесс элиминации вируса клещевого энцефалита// Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2017. № 1(68). С. 43-47. doi: 10.5281/zenodo.345610
Для корреспонденции: Леонова Г.Н., д.м.н., профессор, e-mail: galinaleon41@gmail.com.
Поступила 30.01.17
G.N. Leonova
influence of specific antibodies on the tick-borne encephalitis virus elimination process
Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after G.P.Somov; Vladivоstok, Russia.
Well known that persons vaccinated against tick-borne encephalitis (TBE) virus, formed by different levels of a specific immune response.
The aim of the study is to show the antiviral activity of specific antibodies against the TBE virus in experimental infection dynamics.
Materials and Methods: experiments were carried out in vitro in cell culture models (PK cell) and in vivo in the white mouse models of 12-14 g. A highly virulent Dal'negorsk (Dal) strain of TBE virus and TBE immunoglobulin produced by «NPO» Microgen» were used in the study.
Results: The inhibitory effect of different degree of specific antibodies on tick-borne encephalitis virus has been shown. Antibody titer of 1: 400, possessing a direct antiviral activity against epidemiologically meaningful dose (3 lg TCD50) of TBE virus, has demonstrated to be effective only at the early stage of infection. Specific antibodies at a titer of 1:3200 have found to possess a protective effect during the whole observation period (3-72 h).
We concluded that in patients received specific vaccine courses having antibody titer of 1: 800 or higher, the next revaccination can be received in a year. It is recommended to these patients to examine blood samples for intensity of immunity to TBE virus during the pre-epidemic season to determine the revaccination period.
Keywords: tick-borne encephalitis virus, antibodies, antiviral activity
For citation: Leonova G.N. Influence of specific antibodies on the tick-borne encephalitis virus elimination process. Health. Medical ecology. Science. 2017; 1(68): 43-47. doi: 10.5281/zenodo.345610
For correspondence: Leonova G.N., MD, professor, e-mail: galinaleon41@gmail.com. Conflict of interests. The author is declaring absence of conflict of interests. Financing. The study had no sponsor support.
Received 30.01.17 Accepted 18.02.17
Введение. В Российской Федерации проблема клещевого энцефалита (КЭ) актуальна до настоящего времени. Самая надежная защита от этого заболевания остается специфическая вакцинопрофилактика, при которой у вакцинированных лиц формируется разный уровень специфического иммунного ответа. Этим можно объяснить единичные случаи КЭ даже при полном курсе вакцинации. У заболевших лиц, привитых разными вакцинами против КЭ, регистрируют не только лихорадочные формы, но и в редких случаях тяжелые формы инфекции с возможными летальными исходами [2-5]. При изучении вопросов эффективности вакцинопрофилактики врачей здравоохранения интересуют практические вопросы, какой титр антител может определить степень надежной защиты от заболевания, при каком уровне антител следует проводить ревакцинацию или перенести ее на другой срок.
Цель исследований - показать в динамике экспериментальной инфекции противовирусную активность специфических антител с разными титрами по отношению к высоковирулентному дальневосточному штамму вируса КЭ.
Материалы и методы. Эксперименты проведены in vitro (на модели клеточной культуры СПЭВ) и in vivo - на модели белых мышей 12-14 г. В работе был использован штамм Dal'negorsk
фа1) вируса КЭ, который был выделен в 1973 году из мозга умершего больного очаговой формой КЭ. В экспериментах использован иммуноглобулин (ИГ) против КЭ производства «НПО «Микроген», титр в РТГА - 1:160 и в ИФА - 1:6400. В опытах использовали ИГ в разведениях (титры 1:100, 1:400 и 1:3200), 0,9 мл которых соединяли с 0,1 мл вируса КЭ (4,0 ^ ТЦД50), после чего рабочая доза вируса в опыте составляла 3,0 ^ ТЦД50. Смесь помещали на 2 часа в холодильник +4°С, затем этими пробами заражали монослой клеток СПЭВ выращенный на пробирках, после 1 часа контакта в термостате монослой зараженных клеток трижды промывали средой и заливали средой поддержки. Через 3, 24, 48 и 72 часа собирали куль-туральную жидкость и клетки СПЭВ, зараженные экспериментальными пробами.
Из клеток в разные сроки наблюдения готовили слайды для подсчета процента зараженности клеток вирусом в непрямом методе иммунофлюо-ресценции (НМФА). Титр вируса в пробах надоса-дочной культуральной жидкости определяли путем нанесения 10-кратных разведений надосадочной жидкости этих проб на монослой клеток СПЭВ, выращенных на 96 луночных планшетах. Учет проводили по цитопатическому действию на 5-6 сутки после заражения.
Кроме того, культуральную жидкость на 3 сут после заражения пробами исследовали in vivo на модели неинбредных мышей весом 12-14 г. Мышей по 6 экз. заражали подкожно по 0,2 мл, срок наблюдения составил 21 сутки. Остаточный вирус в экспериментальных пробах определяли по проценту выживших животных и средней продолжительности жизни (СПЖ). Животных содержали в условиях вивария регламентируемых приказом Минздрава СССР №1179 от 10.10.1983 г. Опыты проводили в соответствии с приказами Минздрава СССР №755 от 12.09.1977 г. и №701 от 27.07.1978 г. об обеспечении принципов гуманного обращения с животными.
Все эксперименты повторяли трехкратно.
Результаты и обсуждение. Случаи заболевания КЭ могут возникнуть при укусе клеща с вирусом. Дозы вируса 2-3 и более log LD50 принято считать эпидемически значимыми. В этой связи ранее мы определили минимальную концентрацию специфических антител (титр 1:400), способную нейтрализовать 3 lg ТЦД50 вируса КЭ [5]. Для получения более убедительных результатов противовирусной активности ИГ в титрах 1:400 и 1: 3200 по отношению к разным титрам вируса от 1 до 8 lg ТЦД50 были проведены эксперименты in vitro и in vivo.
Полученные результаты, представленные на рис. 1, убедили нас еще раз в том, что прямое ин-гибирующее действие ИГ с титром 1:400 in vitro определяется при дозе вируса 3 lg ТЦД50 и in vivo - при дозе 4 lg ТЦД50. ИГ в титр 1:3200 обладает ингибирующим действием при дозе вируса 4 ^ТЦД50 in vitro (рис. 1А) и при дозе 6 ^ТВД50 in vivo (рис. 1В).
Полученные результаты ингибирующего действия ИГ непосредственно на вирус КЭ могут отражать лишь ситуацию взаимодействия вируса с антителами на ранних стадиях инфицирования пациентов после укуса клеща с вирусом. Как развивается процесс после взаимодействия вируса с антителами в более поздние сроки, помогают нам понять эксперименты по выявлению остаточного вируса в динамике наблюдения от 3-х до 72 часов после заражения культуры клеток СПЭВ пробами (ИГ + вирус КЭ).
Влияние ИГ на вирус было показано путем изучения внутриклеточного накопления антигена с помощью НМФА, а также внеклеточного определения титра вируса в культуральной среде клеток СПЭВ, зараженных пробами вируса с разными титрами ИГ (1:100, 1:400, 1:3200) в сравнении с показателями контроля вируса.
Как видно на рис. 2 под действием ИГ появление остаточного вируса было определено только спустя 48 часов после заражения клеток. Накопление ан-
А
Исходный титр вируса fig ! ЦД50) — ■*— ИГ 1:400 Ш ИГ 1:3200 В
Искомый титр вируса (lgТЦД50)
«.ИГ 1-400 —1:3200
Рис. 1. Влияние антител класса IgG с титрами 1:400 и 1:3200 на разные дозы вируса КЭ (от 1 до 8 lg LD50). А - опыт на культуре клеток СПЭВ; В - опыт на белых мышах
тигена вируса КЭ происходило более активно при титре ИГ 1:100, замедленно - при титре 1:400, а при титре антител 1:3200 антиген не выявляли (рис. 2 А). В культуральной среде клеток СПЭВ (рис. 2 В) реплицированный вирус КЭ появляется при заражении пробами ИГ (1:100 и 1:400) также через 48 часа, а через 72 часа (проба 1:100) достигает контрольного уровня вируса 3 lg ТЦД50. Проба ИГ (1:3200) демонстрирует полноценное вирулицид-ное действие по отношению к высоковирулентному штамму Dal' вируса КЭ в дозе 3 lg ТЦД50, во все сроки наблюдения ни антиген, ни вирус не были выявлены.
Полученные данные in vitro следовало подтвердить in vivo путем подкожного заражения белых мышей культуральной жидкостью опытных проб. Решение вопроса репликативной активности остаточного вируса после взаимодействия его с разными дозами ИГ целесообразно изучать в более поздние сроки наблюдения. Для этого были использованы культуральные жидкости, собранные спустя 72 часа после заражения клеток СПЭВ экспериментальными пробами.
ИГ 100
ИГ 400
ИГ 3200
Титр вируса (1йТЦД50)
3
час
ИГ 1CÜ
ИГ4СС!
ИГ32С0
Рис. 2. Выявление антигена в клетках (А) и вируса в культураль-ной среде (В) клеток СПЭВ, зараженных штаммом Dal'negorsk вируса КЭ (3 lg ТЦД50) и пробами вируса с иммуноглобулином (1:100, 1:400, 1:3200), в динамике наблюдения (3, 24, 48 и 72 часа)
Таблица
Показатели активности вируса КЭ in vivo, поступившего в культуральную жидкость на третьи сутки после заражения клеток СПЭВ опытными пробами (вирус КЭ - 3 lg ТЦД50 + ИГ -1:100, 1:400, 1:3200)
Показатели вируса Контроль Титр иммуноглобулина в опыте
1:100 1:400 1:3200
Количество мышей зараженных/выживших 6/0 6/0 6/0 6/6
Средняя продолжительность жизни мышей (СПЖ) 7,3 7,5 8,3 21
Результаты, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что на 3 сутки взаимодействия вируса в дозе 3 ^ ТЦД50 с иммуноглобулином в титрах 1:100 и 1:400 количество остаточного вируса восстановилось почти до контрольного уровня, вызывая в 100% гибель животных. И только ИГ с высоким титром (1:3200) способен полностью ингибировать эпидемически значимую дозу вируса (3 ^ ТЦД50), о чем свидетельствовали также данные по внутриклеточному накоплению специфического антигена (рис. 2 А) и внеклеточному накоплению реплициро-
ванного вируса клетками СПЭВ, зараженными экспериментальными пробами (рис. 2 В).
Заключение. Таким образом, представленные результаты помогают понять причины разных исходов инфекции у лиц, вакцинированных против КЭ, после укуса клеща, зараженного вирусом. В литературе используют понятие о защитном титре антител, которое возникло в работах по оценке иммунологической активности вакцин. Считается, что если известен порог защитного уровня иммунологических показателей, то можно судить о профилактической эффективности вакцин при той или иной инфекции [1]. Понятие о защитном титре антител у лиц, вакцинированных против КЭ, в литературных источниках практически не встречается. Ранее на примере экспериментов по прямому противовирусному действию антител класса на вирус КЭ мы определили минимальный защитный титр специфических антител равный 1:400 [4, 6]. Однако такой уровень специфических антител способен защитить только на ранних стадиях инфицированности лиц после укуса клеща, который содержит вирус КЭ с низкими титрами.
Показатели взаимодействия антител класса в титре 1:3200 с эпидемически значимой дозой вируса КЭ (3 ^ ТЦД50) указывают на высокий уровень защитного действия специфических антител, способных полностью ингибировать вирус не только на ранних стадиях, но и в отдаленные сроки. Полученные данные можно использовать при решении вопросов лечения КЭ, а также при индивидуальном определении сроков ревакцинации против КЭ. Если в сыворотке крови уровень антител класса IgG составляет 1:400 и ниже, следует рекомендовать продолжить курс вакцинации. У лиц, получивших курс специфической вакцинации против вируса КЭ и имеющих титр антител 1:800 и выше, очередную ревакцинацию можно перенести на следующий год. В предэпидемический сезон у этих лиц первоначально рекомендуется исследовать кровь на напряженность иммунитета к вирусу КЭ с тем, чтобы принять правильное решение о сроках ревакцинации.
Работа поддержана научным проектом (05452014-0011) Федерального агентства научных организаций.
Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование проводилось без привлечения спонсорских средств.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брико Н.И. Критерии оценки эффективности вакцинации // Вакцинация, 2000; 5(11) http://medi.ru/ doc/15b1101.htm.
2. Захарычева Т.А. Клещевой энцефалит в Хабаровском крае: вчера, сегодня, завтра. - Хабаровск, 2014. 248 с.
3. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит: актуальные аспекты. - М.: Изд. В.И.Балабанов, 2009; 168 с.
4. Леонова Г.Н., Беседнова Н.Н. Вакцины против клещевого энцефалита. Национальное руководство «Вакцины и вакцинация» / Под редакцией В.В.Зверева и Р.М. Хаитова. М., 2014. 400 с.
5. Погодина В.В., Левина Л.С., Скрынник С.М., Травина Н.С., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Кар-мышева В.Я., Герасимов С.Г., Маленко Г.В., Пер-минов Л.В., Попов М.А., Бочкова Н.Г. Клещевой энцефалит с молниеносным течением и летальным исходом у многократно вакцинированного пациента // Вопросы вирусологии. 2013; 2: 33-37.
6. Leonova G.N. Pavlenko E.V., Maystrovskaya O.S., Chausov E.V. Protective antibody titer for patients vaccinated against Tick-borne Encephalitis. Procedia in Vaccinology. 2011; 4: 84-91.
REFERENCES
1. Briko N.I. Evaluation criteria of efficiency of vaccination. Vaccination, 2000; 5(11). http://medi.ru/ doc/15b1101.htm (in Russia).
2. Zaharycheva TA Tick-borne encephalitis in the Khabarovsk Territory: yesterday, today and tomorrow. - Khabarovsk, 2014. 248.
3. Leonova G.N. Tick-borne encephalitis: actual aspects. M., 2009; 168.
4. Leonova G.N., Besednova N.N. Vaccines against tickborne encephalitis. National guideline «Vaccines and vaccination» edited VV Zverev, RM Haitov. M., 2014. 400.
5. Pogodina V.V. Levina L.S. et al. Tick-borne encephalitis with Fulminant course and Lethal Outcome in Patients after Plural Vaccination. Vopr. virol. 2013; 2:33-37 (in Russia).
6. Leonova G.N. Pavlenko E.V., Maystrovskaya O.S., Chausov E.V. Protective antibody titer for patients vaccinated against Tick-borne Encephalitis. Procedia in Vaccinology, 2011: 4; 84-91.
Сведения об авторе
Леонова Галина Николаевна - главный научный сотрудник лаборатории флавивирусных инфекций, доктор медицинских наук, профессор НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова; Владивосток, ул. Сельская 1, 690087; раб. тел. 8(423)244-07-12; е-тай: galinaleon41@gmail.com
