CC BY
6растений в оранжереях крайнего севера России. // botanicus, 2010, http://hb.karelia.ru 7. Титок В.В., Решетников В.Н., Володько И.К. Коллекционный фонд растений мировой флоры -возобновляемый природный ресурс и основа инновационного развития. // Научно-практический журнал «Земледелие и защита растений», приложение к журналу № 4, август 2016, С. 8-11.
8. Хохряков М.К. Определитель болезней и вредителей. Санкт-Петербург-Москва, изд. «Лань». 2003, 592 с.
9. Bakhshaliyeva K.F., Cabrayilzada S.M., islamova Z.B., Namazov N.R., Hasanova A.R. The General Characteristic of Anamorphic Fungi Spread In Azerbaiyan // International Journal of Reccent Technology and Engineering (IJRTE) SSN: 2277-3878,vol-ume - 8,Issue-3,September 2019
ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ДЕТОКСИКАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В БИОТРАНСФОРМАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
Кадырова Д.А.
Доктор биологических наук, профессор Институт биофизики и биохимии при Национальном Университете РУз
Далимова Д.А.
Кандидат биологических наук, Центр передовых технологий при Министерстве инновационного развития РУз,
Абдурахимов А.А.
Доктор философии
Институт биофизики и биохимии при Национальном Университете РУз,
Турдикулова Ш. У.
Доктор биологических наук, профессор Министерство инновационного развития РУз
SIGNIFICANCE OF GENE POLYMORPHISMS OF THE XENOBIOTIC DETOXIFICATION SYSTEM IN DRUG BIOTRANSFORMATION
Kadirova D.,
Doctor of Biological Sciences, Professor, Institute of Biophysics and Biochemistry at the National University of the Republic of Uzbekistan
Dalimova D.,
PhD in Biology, Center for Advanced Technologies at the Ministry ofInnovative Development of the Republic of Uzbekistan
Abdurahimov A.,
PhD in Biology, Institute of Biophysics and Biochemistry at the National University of the Republic of Uzbekistan Turdikulova Sh.
Doctor of Biological Sciences, Professor Ministry of Innovative Development of the Republic of Uzbekistan DOI: 10.5281/zenodo.6575744
Аннотация
Биотрансформация и детоксикация ксенобиотиков, в том числе лекарственных препаратов, попадающих в организм, обеспечивается метаболической системой, представленной множеством специализированных ферментов, функционирующих по каскадному принципу. Гены, контролирующие синтез соответствующих ферментов называются генами метаболизма. Ассоциация полиморфных вариантов генов с различной индивидуальной чувствительностью к лекарственным препаратам приводит к определению патогенеза самого заболевания и разработке оптимальной, эффективной схемы терапии с учетом биохимической индивидуальности пациента, что является основной концепцией персонализированной медицины (1).
Одной из задач персонализированной медицины (ПМ) является поиск биомаркеров, отражающих генные изменения, которыми могут быть белки, ферменты, генетические перестройки и другие субстраты. Знание молекулярного уровня развития патологии позволяет выяснить тонкие патогенетические механизмы заболевания и понять, что происходит в больной клетке, какие в ней работают механизмы и что может быть мишенью, а также биомаркером заболевания (2). Определение генетических особенностей у пациентов позволяет прогнозировать характер фармакологического ответа, что дает возможность повысить эффективность и безопасность применения лекарственных средств (3)
Целью данной работы является анализ генетических полиморфизмов генов GSTM1, GSTT1, MDR1, оценка их значимости в индивидуальном ответе организма на лекарственные препараты.
Abstract
Biotransformation and detoxification of xenobiotics, including drugs that enter the body, is provided by a metabolic system represented by a variety of specialized enzymes functioning according to the cascade principle. Genes that control the synthesis of the corresponding enzymes are called metabolism genes. The association of polymorphic gene variants with different individual sensitivity to drugs leads to the determination of the patho-genesis of the disease itself and the development of an optimal, effective treatment regimen, taking into account the biochemical individuality of the patient, which is the main concept of personalized medicine (1).
One of the tasks of personalized medicine (PM) is the search for biomarkers that reflect gene changes, which can be proteins, enzymes, genetic rearrangements, and other substrates. Knowledge of the molecular level of the development of pathology allows finding out the subtle pathogenetic mechanisms of the disease and understanding what happens in a diseased cell, what mechanisms work in it and what can be a target, as well as a biomarker of the disease (2). Determining the genetic characteristics of patients makes it possible to predict the nature of the pharmacological response, which makes it possible to improve the efficacy and safety of the use of drugs (3).
Ключевые слова: ДНК, гены детоксикации, полиморфизмы генов, лекарственные препараты, мутации, генотип, ПЦР-амплификация.
Keywords: DNA, detoxification genes, gene polymorphisms, drugs, mutations, genotype, PCR amplification.
Методы исследования
Для выполнения исследований были использованы образцы ДНК, полученные из венозной крови относительно здоровых женщин и мужчин в возрасте от 18 до 54 лет. Биологический материал собирали согласно правилам этического кодекса. Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности
Выделение ДНК
Выделение ДНК из цельной крови проводили при использовании набора реагентов АмплиПрайм Рибо Преп и Рибо Сорб АМ (ИнтерЛабСервис, Россия,) по стандартному протоколу. Метод был модифицирован. Лизис биологических образцов проводили в течение 30-40 минут при температуре 650С. Центрифугировали при 11тыс. об/мин. Экстракция ДНК была проведена при скорости 13тыс. об/мин.
Определение концентрации и чистоты нуклеиновых кислот
Определение концентрации полученного препарата нуклеиновых кислот в пробах проводили спектрофотометрическим методом на приборе BioSpec-nano спектрофотометр (Shimadzu Biotech, Japan). Оптическую плотность (Е) препарата ДНК измеряли при трех длинах волн: 230 нм, 260 нм и 280 нм, против ТЕ-буфера. Чистоту образца определяли исходя из соотношения Е260/Е280. Значение Е260/Е280 >1.8, показывало, что препарат ДНК чист и не содержит примеси белков. Значение Е260/Е230 составляло 1.8.
Специфическая амплификация генов проводилась с использованием набора реагентов IsogeneGenPak®PCR-Core для ПЦР амплификации ДНК. Для проведения ПЦР использовали GeneAmp® ПЦР систему 9700 с золотым 96-ячееч-ным блоком (Applied Biosystems). Электрофорети-ческий анализ ПЦР - продуктов проводили в 2 % и 3 %ном агарозном геле, хранили при +4 оС. Элек-трофоретический анализ продуктов ПЦР показал, что их длина соответствует ожидаемой 114, 131, 548, 485 и 558 п.н., соответственно
Гель-элекрофорез
Качество выделенных образцов ДНК проверяли методом электрофореза в 0,8-1 %ном агарозном геле. Для электрофоретического анализа ампликонов генов GSTM1, GSTT1 и MDR1 использован 2% ный агарозный гель. Для продуктов мультиплексной ПЦР (ампликон продуктов GSTM1, GSTT1) используется 8%ный полиакриламидный гель. В связи с этим, для проверки наличия ПЦР- продукта проводился акрила-мидный элетрофорез в 1х ТВЕ буфере в течении 180-240 минут при 200В. Для окрашивания используется 1% раствор этидиум бромида...
Генетические исследования проводились согласно этическим принципам медицинской генетики, в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека»
Результаты и обсуждение
Наибольшее клиническое значение имеют полиморфизмы генов, контролирующих синтез и работу ферментов биотрансформации лекарственных средств. К этим ферментам относится глутатион-S-трансфераза (GST), который выполняет как антиок-сидантную функцию, так и детоксикационную, участвуя в метаболизме ксенобиотиков и лекарственных препаратов. (4). Известно, что «работа» системы детоксикации ксенобиотиков, в которую входят ферменты биотрансформации (GSTT1 и GSTM1) и транспортеры лекарственных средств (ЛС), продукты экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1) определяет уровень концентрации ЛС в плазме крови (5,6). Из образцов венозной крови 121 добровольца молодого возраста (от 18 до 34 лет) и 96 добровольцев среднего возраста были выделены молекулы ДНК.
Метод дифференциальной полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован для одновременной характеристики мутаций, ответственных за аллели генов GSTT1 и GSTM1. Продукты мульти-
плексной ПЦР детектировали методом электрофореза в 2% полиакриламидном геле в 1х ТВЕ буфере в течение 180-240 минут при 200В.
При проведении ПЦР-амплификации были получены продукты ПЦР, представленные на рисунке 1. Длины фрагментов генов GSTT1 и GSTM1 анализировали путем сравнения со стандартным маркером, размером 100 bp. Идентификацию генотипов генов GSTT1 и GSTM1 проводили на основании наличия и/или отсутствия ПЦР - продуктов. Наличие в геле продуктов ПЦР размерами 131 п.н. и/или 114 п.н. свидетельствовало о присутствии активных (инсерция) аллелей генов GSTT1 и GSTM1. Гомозиготы по «нулевым» аллелям генов GSTT1
(del/del, -/-) и GSTM1 (del/del, -/-) идентифицировали при отсутствии в геле фрагментов соответствующих размеров.
В таблице 1 представлены результаты геноти-пирования генов GSTT1 и GSTM1 по инсерци-онно/делеционным вариантам у 217 клинически здоровых людей молодого и среднего возраста узбекской популяции. Нулевой генотип гена GSTT1 (гомозиготная делеция гена) выявлен у 6 человек (3%), инсерция гена GSTT1 (+/+ или +/- , соответствует норме) выявлена у 211 человек (97%), что соответствует равновесию Харди-Вайнберга, р <0,00001.
9 X 13 14 15 X - X 16 17 18 10 17 21 24 25
Рисунок 1. Электрофорез продуктов амплификации генов GSTM1 и GSTT1 в 8% акриламидном геле. Отсутствие продукта мультиплексной ПЦР указывает на нулевой генотип. М- маркер молекулярного
веса 100 - 1500 п.н.
В группе людей от 18 до 35 лет (п=121) частота гомозиготного нулевого генотипа в8ТТ1 (-/-) составила 5%, частота функционального генотипа гена GSTT1 (+/+, +/-) составила 95%. В группе добровольцев от 31 до 54 лет (п=96) нулевой гомозиготный генотип GSTT1 (-/-) не был выявлен.
Гомозиготный нулевой генотип гена GSTМ1 среди добровольцев молодого и среднего возраста (208 человек) выявлен у 11 человек (5%), инсерция гена GSTМ1 определена у 197 человек (95%).. Такое распределение согласуется с равновесием
Таблица 1.
Распределение генотипов по делеционному варианту гена GSTT1 в группах молодого и среднего воз-
Харди-Вайнберга, р <0,00001. Частота нулевого генотипа GSTM1 (-/-) среди людей от 18 до 35 лет (п=116) составила - 9%, генотипа GSTM1 (+/+, +/-) - 91%. В группе от 31 до 54 лет (п=92), генотип GSTМ1 (-/-) не был выявлен. Наиболее значимыми полиморфными вариантами генов GSTT1 и GSTM1 являются гомозиготные делеции, которые приводят к полной потере активности фермента и повышенной уязвимости к цитогенетическому повреждению.
Генотипы Количество (п) Частота встречаемости % х2 Р
ins/ins, ins/del 211 97 194.27 <0.00001
del/del 6 3
Проведен анализ частоты нулевых генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у 217 клинически здоровых добровольцев молодого и среднего возраста узбекской национальности. Гомозиготный нулевой генотип гена GSTT1 выявлен у 3% добровольцев молодого и среднего возраста, что в 6,5 раз меньше, чем частота делеционного генотипа гена GSTT1 в старшей возрастной группе. Частота встречаемости гомозиготного нулевого генотипа гена GSTМ1 клинически здоровых добровольцев молодого и среднего возраста составила 5%, что в 4 раза меньше, чем в старшей возрастной группе.
Следует отметить, что «нулевой» вариант GSTM1 является наиболее клинически значимым.
Нулевой генотип GSTM1 образуется в результате делеции, вследствие неравного кроссинговера между гомологичными последовательностями, фланкирующими ген GSTM1. В результате делеции белковый продукт не синтезируется. Такой генетический вариант снижает чувствительность индивидов к канцерогенам, токсинам и некоторым лекарственным препаратам (7). Гомозиготный генотип по делеции гена GSTM1 можно считать маркером повышенного риска развития различных заболеваний, включая онкологические.
Функционирование ферментов первой и второй фаз биотрансформации ксенобиотиков и выве-
дение чужеродных соединений из клеток с помощью АТФ-зависимых транспортных белков - это основные механизмы метаболизма ксенобиотиков и различных лекарственных препаратов.
Ген MDR1 - это высокополиморфный ген. Имеет 4 полиморфных маркера. Белок, который экспрессируется данным геном Р-гликопротеин относится к трансмембранным АТФ-зависимым белкам, имеет молекулярную массу 170 кДа и обладает способностью выводить лекарственные препараты из организма за счет энергии гидролиза АТФ (8,9,10). Понятно, что транспорт веществ из клетки ограничивает эффективность терапии: концентрация лекарств в клетке снижается. В настоящее время активно изучается клиническое значение двух полиморфных маркеров (С3435Т и С1236Т гена MDR1), представляющих собой замену в нук-леотидной последовательности ДНК одного нук-леотида на другой - так называемые полиморфизмы одного нуклеотида (цитозина на тимин). Наиболее клинически значимым является полиморфный маркер С3435Т (11). Исходя из вышесказанного, проводили исследования по полиморфному маркеру С3435Т.
Методом ПЦР была проведена амплификация ДНК, в присутствии полиморфного маркера С3435Т гена MDR1. Генотипирование проводили на основе анализа полиморфизма длины рестрикци-онных фрагментов. На рисунке 1 представлена электрофореграмма генотипов по полиморфному маркеру С3435Т. Были получены фрагменты различной длины, соответствующие трем возможным генотипам. ПЦР-амплификация последовательностей полиморфного маркера С3435Т гена MDR1 выявила продукты ожидаемой длины (408 п.н.). В результате проведения рестрикционного анализа продуктов ПЦР были получены фрагменты различной длины, соответствующие трем возможным генотипам: СС, СТ, ТТ
Распределение генотипов варианта С3435Т гена MDR1 в группе молодого, среднего и старшего возраста представлено в таблице 2. Анализ распределения частот генотипов показал, отклонение от равновесия Харди-Вайнберга, (Р >0.005). Индивидуумы, имеющие генотипы СТ и ТТ, являются устойчивыми к действию многих лекарственных препаратов, в результате больные плохо отвечают на лечение, появляются побочные реакции, связанные с приемом лекарственных препаратов
Анализ ПДРФ гена С3435Т СС wild - 236/172/103 bp CT get - 408/236/172/103 bp
>M"fi
cc
Щ -1
CT
Рисунок 1.
ПДРФ анализ определения полиморфизма С3435Т гена MDR1. СС wild- норма, CT get- гетерозигота, TT mut - мутантный генотип, bp- base pair (пар нуклеотидов), М-маркер шага - 100-1500 п.н.
Таблица 2
Частота встречаемости генотипов по полиморфному маркеру C3435T, n= 342
Генотипы Количество Частота, % X2 p
CC 48 14 0.06 0.806496
CT 174 51
TT 120 35
Таким образом, выявление ассоциаций полиморфных вариантов генов с различной индивидуальной чувствительностью к лекарственным препаратам позволит в дальнейшем формировать новые экономически обоснованные методы диагностики и лечения на основе генетических маркеров, что приведет к повышению эффективности терапии, улучшению качества и продолжительности жизни больных.
Список литературы
1. Olivier, C., Williams-Jones, B., Godard, B., Mikalson B., Ozdemir V. Personalized medicine, bio-ethics and social responsibilities: re-thinking the pharmaceutical industry to remedy inequities in patient care and international health // Current pharmacogenomics and personalized medicine, 2008. Vol 6. №2. P. 113.
2. Olivier, C., Williams-Jones, B., Godard, B., Mikalson B., Ozdemir V. Personalized medicine, bio-ethics and social responsibilities: re-thinking the pharmaceutical industry to remedy inequities in patient care and international health // Current pharmacogenomics and personalized medicine. - 2008. -Vol. 6. № 2. P. 117-124.
3. Мусин А.Г., Хазиева А.В., Нигматуллина А.Э. Полиморфизм генов системы детоксикации ксенобиотиков, его роль в биотрансформации лекарственных препаратов // Медицинский вестник Башкортостана. - 2014. - Т. 9, № 2. - C. 211-216.
4. Ishii T, Matsuse T, Teramoto S. Glutathione S-transferase P1 (GSTP1) polymorphism in patients with
chronic obstructive pulmonary disease. - 2000.-Thorax, (54), 693-696.
5. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клиникофармакологические аспекты. М.: Реафарм, 2004, с. 113-120.
6. Жарин В.А. Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков// Военная медицина - №3
- 2013 - С. 122-124.
7. Ueda K., Pastan I., Gottesman M.M. Isolation and sequence of the promoter region of the human mul-tidrug-resistance (P-glycoprotein) gene // Journal of Biological Chemistry. - 2007. - V. 262, N 36. - P. 1743217436.
8. Szakacs G., Wah K.K., Polgar O., Robey R.W., Bates S.E. Multidrug resistance mediated by MDR-ABC transporters // Drug Resistance in Cancer Cells. -2009. - P. 1-20.
9. Hitzl M, Drescher S, van der Kuip H, Schaffeler E, Fischer J, Schwab M, Eichelbaum M, Fromm MF. The C3435T mutation in the human MDR1 gene is associated with altered efflux of the P-glycoprotein substrate rhodamine 123 from CD56+ natural killer cells// Pharmacogenetics- 2001 V. - 11(4). - Р. 293-298.
10. Trock B.J., Leonessa F., Clarke R. Multidrug resistance in breast cancer: a meta-analysis of MDR1/gp170 expression and its possible functional significance // J Natl Cancer Inst. - 1997.-V. 89, N 13.
- P. 917-931
11. Driscoll L., Clynes M. Molecular markers of multiple drug resistance in breast cancer // Chemotherapy. - 2006. - V. 52, N 3. - P. 125-129.
