CC BY
7С.Ю.Никулина, А.А.Чернова, В.А.Шульман, Т.С.Кукушкина, М.И.Воевода, В.Н.Максимов
ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КОННЕКСИНА-40 В ГЕНЕЗЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА СЛАБОСТИ СИНУСОВОГО УЗЛА
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого,
ГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск
C целью изучения полиморфизма генов, кодирующих белки, определяющие структурное и функциональное состояние проводящей системы, и его связи с различными нарушениями ритма сердца обследованы 29 семей, имеющих первичный, наследственный синдром слабости синусового узла, в том числе пробанды (20 женщин и 9 мужчин, средний возраст 58±0,15 лет) и родственники I, II и III степени родства (65 мужчин и 68 женщин, средний возраст 39±0,13 лет).
Ключевые слова: проводящая система сердца, синдром слабости синусового узла, молекулярно-генетическое исследование, полиморфизм генов, коннексины
To study polymorphism of genes coding proteins which determine the structural and functional states of the cardiac conduction system, and its correlation with different cardiac arrhythmias, 29 families with primary hereditary sick sinus syndrome were examined including probands aged 58±0.15 years (20 females and 9 males) and their I, II, and III degree relatives (65 men and 68 women aged 39±0.13 years).
Key words: cardiac conduction system, sick sinus syndrome, molecular genetic test, gene polymorphism, connexins.
Патология проводящей системы сердца (ПСС) привлекает внимание исследователей на протяжении столетия. За столь длительный период сформировались устоявшиеся представления об этиологии различных вариантов поражения ПСС, в частности известно, что практически любое заболевание сердца может служить причиной поражения ПСС. В связи с этим среди практических врачей сложилось стойкое убеждение, что патология ПСС почти всегда вторична. Это является частой причиной диагностических ошибок, когда само наличие патологии ПСС служит основанием для постановки какого-либо кардиологического диагноза, чаще всего атеросклеротического или миокардитического кардиосклероза, в зависимости от возраста пациента.
В то же время за последние два десятилетия накопилось достаточное количество публикаций, в которых рассматриваются различные варианты изолированного поражения ПСС без связи с какими-либо сердечно-сосудистыми заболеваниями. Такие случаи патологии ПСС рассматриваются как идиопатичес-кие. В связи с этим произошла определенная эволюция в представлениях об этиологической структуре рассматриваемой патологии.
Электрофизиологические свойства проводящей системы сердца обуславливаются функцией ионных каналов кардиомиоцитов и их gap-соединений. Строение, форма и белковый состав этих соединений определяются генами, изменения структуры которых могут приводить к структурным и функциональным нарушениям клеточных мембран и межклеточных соединений. Нарушения функционирования ионных каналов и межклеточных взаимоотношений при соответствующих условиях, например при избыточном влиянии катехоламинов, могут быть пусковым элементом аритмий. В плане генов, влияющих на структурные особенности проводящей системы сердца, в настоящее вре-
мя имеются данные о связи у мышей вариабельности структуры гена транскрипционного фактора ОТ1Ь, контролирующего экспрессию коннексина-40, одного из белков межклеточных gap-соединений, с фатальными аритмиями при отсутствии макроскопических структурных аномалий проводящей системы [1].
При частичном снижении экспрессии гена структурных аномалий сердца не определяется, но сохраняется высокая частота внезапной смерти за счет развития фатальных желудочковых аритмий и нарушений атриовентрикулярной проводимости [2]. Этот эффект также объясняется и тем, что при отсутствии фактора ОТШ в эмбриональном периоде возникает дефицит рецептора нейротропина йгсС, определяющего специализацию миокардиоцитов атриовентрикулярного соединения [3].
Патогенетическим звеном нарушения внутриклеточной проводимости является снижение количества или изменение структуры белков коннексинов - специализированных мембранных структур, осуществляющих прямую связь с соседними клетками. В человеческом геноме идентифицировано 20 видов коннексинов, в миокарде предсердий преобладающим является кон-нексин-40 (Сх40) [4]. Таким образом, многобразие кон-нексинов придает специфические свойства межклеточным контактам для контроля потока молекулярной информации и определяет свойства проводящей системы сердца в норме и в патологии.
У мышей с дефицитом гена Сх40 наблюдается замедление межпредсердного проведения, увеличивался риск развития предсердных аритмий и дисфункции синусового узла [5]. У человека, мутации в области промотора гена Сх40 (-44в->А), снижающие его активность, приводят к аномальному распределению gap-каналов, и, как следствие, к электрофизиологической гетерогенности. Этот эффект наблюдается у лиц с пароксизмами фибрилляции предсердий на фоне фун-
© С.Ю.Никулина, А.А.Чернова, В.А.Шульман, Т.С.Кукушкина, М.И.Воевода, В.Н.Максимов
кционирования дополнительный путей проводящей системы, где миокард предсердий более уязвим к возникновению micro re-entry [6]. В связи с приведенными данными целью исследования явилось изучение полиморфизма генов, кодирующих белки, определяющие структурное и функциональное состояние проводящей системы, и его связи с различными нарушениями ритма сердца.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Настоящее исследование было проспективным. Из базы данных кафедры терапии №1 Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В.Ф.Войно-Ясенецкого были отобраны 29 семей, имеющих первичный, наследственный синдром слабости синусового узла (СССУ). Среди пробандов было 20 женщин и 9 мужчин, средний возраст составил 58±0,15 лет. Среди родственников I, II и III степени родства было 65 мужчин и 68 женщин, средний возраст 39±0,13 лет.
Всем пробандам и их родственникам I, II, III степени родства было проведено клинико-инструменталь-ное исследование: клинический осмотр, электрокардиография, велоэргометрия, холтеровское мониторирование ЭКГ, атропиновая проба, электрофизиологическое исследование (чреспищеводная стимуляция левого предсердия до и после медикаментозной вегетативной блокады), эхокардиоскопия, кардиоритмография.
Молекулярно-генетическое исследование больных СССУ и их родственников I, II и III степени родства проводилось в лаборатории медицинской генетики ГУ НИИ терапии СО РАМН города Новосибирска. Для определения полиморфизма гена Cx40 были взяты образцы крови 312 человек, из которых 71 - больные с диагнозом СССУ, 44 их здоровых родственников I, II, III степени родства и 197 человек контрольной группы. Экстракция ДНК из крови осуществлялась фенол-хлороформным методом [7, 8].
Для детекции ОНП маркера гена Сх40, локализованного в промоторе (замена G на A в позиции -44) выполнялась аллель-специфическая полимеразная цепная реакция (ПЦР) по методике Firouzi M [6]. Для детекции ОНП -44G>A гена Cx40 использовали следующие праймеры: 5'- CCCTCTTTTTAATCGTATCTGTGGC-3' (прямой) и 5'- GGTGGAGGGAAGAAGACTTTTAG-3' (обратный). После ПЦР продукт длиной 150 нуклео-тидных пар обрабатывается рестриктазой HaeIII. При наличии G аллеля продукт разрезается на фрагменты 126 и 24 нуклеотидных пары [9].
Частота встречаемости генотипов гена Cx40 у болi контрольной группы
Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере типа «IBM PC» с использованием пакета программ «Statistica 7.0». Первым этапом определяли частоты аллелей и генотипов изучаемых генов-кандидатов. Соответствие распределения аллелей и генотипов равновесию Харди-Вайнберга, сравнительный анализ частот генотипов вышеперечисленных генов с контрольной группой выполнялось с использованием критерия х2, двустороннего критерия Фишера.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
По полиморфизму 44G>A гена Cx40 было проге-нотипировано 71 больной с СССУ, 44 их здоровых родственника I, II и III степени родства и 197 лиц контрольной группы. По результатам аллель-специфической поли-меразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов ADRA2B у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы: II - гомозиготный дикий, ID - гетерозиготный, DD - гомозиготный мутантный. Установлено (табл. 1) достоверное преобладание гетерозиготного генотипа 44G>A у больных СССУ (45,07±5,9%) по сравнению c лицами контрольной группы (29,44±3,2%).
Согласно результатам M.Firouzi, была выявлена ассоциация гомозиготного полиморфизма с возникновением micro re-entry в предсердиях, как первичного электрофизиологического дефекта. Предположено, что при мутантном гомозиготном генотипе активность промотора гена снижается вдвое, что отражается на количестве белка, особенно, если учесть короткие сроки жизни коннексина-40 (приблизительно 2 часа). При гетерозиготном генотипе активность промотора гена носит усредненный характер. Возникающая анизотропия, вследствие неравномерности распределения межклеточных щелевых контактов, предрасполагает к появлению зон с однонаправленным блокированием импульса, гетерогенной рефрактерностью клеток и отсутствию зон с восстановленной возбудимостью в пределах миокарда предсердий. По-видимому, у обладателей гетерозиготного генотипа срабатывает фактор «усреднения» электрофизиологических параметров миокардиоцитов, определяя относительно благоприятный прогноз не только в плане развития micro re-entry, но и других аритмий. Так, в популяции Нидерландов, частота встречаемости гетерозогот составляет 31%, а гомозигот по мутантному аллелю - 6% [10].
В других работах по изучению полиморфизма -44G->A продемонстрировано, что в сочетании с мутациями в гене SCN5A, кодирующем натриевые ионные
Таблица 1.
,1х СССУ, их здоровых родственников и лиц
Генотипы Больные СССУ N=71 (1) Здоровые родственники N=44 (2) Контрольная группа N=197 (3) р1-2* Р1-3 р2-3
Абс. % Абс. % Абс. %
44GG 3 4,23 3 6,82 25 12,69 р>0,05 р>0,05 р>0,05
44GA 32 45,07 20 45,45 58 29,44 р>0,05 р<0,05 р>0,05
44AA 36 50,7 21 47,73 114 57,87 р>0,05 р>0,05 р>0,05
* - различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерия %2.
каналы, носительство редкого гомозиготного генотипа димому снижено «нейтрализующее» действие мутант-
предрасполагает к угнетению функции автоматизма в ного аллеля. Повышение концентрации катехоламинов
миокардиоцитах предсердий, «остановке предсердий» и ионов Ca при интактной проводимости щелевых кон-
[11]. У больных с синдромом слабости синусового узла, тактов, способно поддерживать анормальную автома-
в основе которого лежит снижение автоматизма, по-ви- тическую активность миокардиоцитов предсердий.
ЛИТЕРАТУРА
1. Hewett К, Norman L.W., Sedmera D. et al. Knockout of man Connexin40 Gene Polymorphisms With Atrial Vul-the neural and heart expressed gene HF-1b results in apical nerability as a Risk Factor for Idiopathic Atrial Fibrillation deficits of ventricular structure and activation // Cardiovas- // Circulation Research.- 2004.-Vol.95.-P.e29
cular research.-2005.-Vol.67.-P.548-560 7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генети-
2. Nguyen-Tran V.T.D., Kubalak S.W. Minamisawa S., Fi- ческой инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: set S. A noval genetic pathway for sudden cardiac death nia Мир. - 1984. - С. 357.
defects in the transition between ventricular and conduction 8. Смит К., Калко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и
system cell lineages // Cell. -2000. - Vol. 102. - P. 671-682. методы работы с большими молекулами ДНК. - /Ана-
3. Amand TR, Lu JT, Chien KR. Defects in cardiac con- лиз генома / Под ред. К. Дейвиса, пер. с англ. - М: Мир. duction system lineages and malignant arrhythmias: devel- - 1990. - С. 58-94.
opmental pathways and disease // Novartis Found Symp.- 9. Juang JM, Chern YR, Tsai CT et al. The association of
2003.- PMID: 12956335. human connexin 40 genetic polymorphisms with atrial fi-
4. Willecke K, Elberger J, Degen J et al. Structural and brillation. //Int J Cardiol. 2007 Mar 2;116(1):107-12.) functional diversity of connexin genes in the mouse and 10. Groenewegen W.A, Firouzi M, Bezzina C.R. et al. A human genome // Biol Chem.- 2002.-Vol.383.-P.725-737 Cardiac Sodium Chanall Mutation Cosegregates With a
5. Hagendorff A, Schumacher B, Kirchhoff S et al. Con- Rare Connexine40 Genotype in Familial Atrial Standstill.// duction disturbances and increased atrial vulnerability in Circ. Res.- 2003.-Vol. 92.-P.14-22.
Connexin 40-deficient mice analyzed by transesophageal 11. Gollob M.H., Jones D.L., Krahn A.D. et al. Somatic
stimulation // Circulation.- 1999.-Vol.99(11).-P. 1508-15 mutations in the connexin 40 gene (GJA5) in atrial fibrilla-
6. Firouzi M, Ramanna H, Kok B et al. Association of Hu- tion // New Eng. J. Med. 354: 2677-2688, 2006.
ЗНАЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА К0ННЕКСИНА-40 В ГЕНЕЗЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА
СЛАБОСТИ СИНУСОВОГО УЗЛА С.Ю.Никулина, А.А.Чернова, В.А.Шульман, Т.С.Кукушкина, М.И.Воевода, В.Н.Максимов
С целью изучения полиморфизма генов, кодирующих белки, определяющие структурное и функциональное состояние проводящей системы, и его связи с различными нарушениями ритма сердца обследованы 29 семей, имеющих первичный, наследственный синдром слабости синусового узла. Среди пробандов было 20 женщин и 9 мужчин, средний возраст составил 58±0,15 лет. Среди родственников I, II и III степени родства было 65 мужчин и 68 женщин, средний возраст 39±0,13 лет. Всем пробандам и их родственникам I, II, III степени родства было проведено клинико-инструментальное исследование: клинический осмотр, электрокардиография, велоэргометрия, хол-теровское мониторирование ЭКГ, атропиновая проба, электрофизиологическое исследование, эхокардиоскопия, кардиоритмография. По результатам аллель-специфической полимеразной цепной реакции выявлены 3 вида генотипов ADRA2B: II - гомозиготный дикий, ID - гетерозиготный, DD - гомозиготный мутантный. Таким образом, у больных с синдромом слабости синусового узла, в основе которого лежит снижение автоматизма, по-видимому снижено «нейтрализующее» действие мутантного аллеля. Повышение концентрации катехоламинов и ионов Ca при интактной проводимости щелевых контактов, способно поддерживать анормальную автоматическую активность миокардиоцитов предсердий.
ROLE OF POLYMORPHISM OF CONNEXIN 40 GENE IN PATHOGENY OF SICK SINUS SYNDROME S.Yu. Nikulina, A.A. Chernova, V.A. Shulman, T.S. Kukushkina, M.I. Voevoda, V.N. Maksimov
To study polymorphism of genes coding proteins which determine the structural and functional states of the cardiac conduction system, and its correlation with different cardiac arrhythmias, 29 families with primary hereditary sick sinus syndrome were examined. The probands aged 58±0.15 years included 20 females and 9 males. The relatives of degrees I, II, and III included 65 men and 68 women aged 39±0.13 years. In all probands and their relatives of degrees I, II, and III, the following assessments were performed: physical examination, electrocardiography, bicycle test, ECG Holter monitoring, Atropine test, electrophysiological study, echocardiography, and cardiorhythmography.
According to the results of allele-specific polymerase chain reaction, 3 following ADRA2B genotypes were revealed: wild-type homozygous (II), heterozygous (ID), and homozygous mutant (DD). Thus, in patients with sick sinus syndrome due to a decreased automatism, the "neutralizing" effect of the mutant allele is apparently low. An increased concentration of catecholamines and calcium ions associated with intact conduction of gap junctions is able to maintain the pathologic automaticity of atrial cardiomyocytes.
