CC BY
37
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© ЧЕРНОВА А. А., НИКУЛИНА С. Ю., ШУЛЬМАН В. А. ,
КУКУШКИНА Т. С, ВОЕВОДА М. И., МАКСИМОВ В. Н.
УДК 616.125.4-056.7-092-037
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КОННЕКСИНА 40 В ГЕНЕЗЕ НАСЛЕДСТВЕННОГО СИНДРОМА СЛАБОСТИ СИНУСОВОГО
УЗЛА.
А. А. Чернова, С. Ю. Никулина , В. А. Шульман, Т. С. Кукушкина, М. И.
Воевода, В. Н. Максимов.
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В. Ф.
Войно-Ясенецкого, ректор - д. м. н., проф. И. П. Артюхов; НИИ терапии СО
РАМН г. Новосибирск, директор - член-корр. РАМН М. И. Воевода.
Резюме. В настоящей работе впервые на клинико-генетическом материале выявлена ассоциация наследственного синдрома слабости синусового узла с полиморфизмом гена коннексина 40 (Сх 40).
Ключевые слова: синдром слабости синусового узла, полиморфизм, ген Сх40.
Чернова Анна Александровна - к.м.н., асс. каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ; e-mail: [email protected].
Никулина Светлана Юрьевна - д. м. н., проф, зав. каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ, проректор по УР КрасГМУ; тел. 8(391)2200914.
Шульман Владимир Абрамович - д. м.н., проф. каф. внутренних болезней №1 КрасГМУ; тел. 8(391)2647909.
Формирование сердца в эмбриогенезе - сложный многостадийный процесс, в ходе которого отдельные структуры и камеры будущего сердца формируются со значительным временным промежутком. Последовательность миграции клеток обусловливает ряд врожденных дефектов, которые затрагивают только правые или только левые отделы сердца. В перспективе понимание этих механизмов и выявление конкретных мутаций, приводящих к развитию пороков сердца, открывает возможность диагностики различных патологий проводящей системы сердца у плода еще до формирования кардиальных структур.
Понимание механизмов формирования проводящей системы сердца в эмбриогенезе также может иметь практическое применение. Хотя клетки проводящей системы происходят из одного типа миокардиальных клеток-предшественниц, клетки синусового узла и атрио-вентрикулярного соединения развиваются по-разному и экспрессируют разные гены. Судя по предварительным данным, клетки синусового узла развиваются из миокардиальных клеток-предшественниц в области входящего тракта то есть миокарда, окружающего легочные вены.
На животной модели показано, что для дифференцировки и специализации миокардиоцитов проводящей системы необходима экспрессия транскрипционного фактора. К первому месяцу жизни у мышей с «выключенным» геном обнаруживаются нарушения распределения коннексинов 40, 43, снижение артериальной васкуляризации миокарда [8].
При частичном снижении экспрессии гена структурных аномалий сердца не определяется, но сохраняется высокая частота внезапной смерти за счет развития фатальных желудочковых аритмий и нарушений атриовентрикулярной проводимости [10]. Этот эффект также объясняется и
тем, что при отсутствии фактора БШВ в эмбриональном периоде возникает дефицит рецептора нейротропина 1хсС, определяющего специализацию миокардиоцитов атриовентрикулярного соединения [3].
Патогенетическим звеном нарушения внутриклеточной проводимости является снижение количества или изменение структуры белков коннексинов - специализированных мембранных структур, осуществляющих прямую связь с соседними клетками. В человеческом геноме идентифицировано 20 видов коннексинов, в миокарде предсердий преобладающим является Сх 40 [11]. Таким образом, многобразие коннексинов придает специфические свойства межклеточным контактам для контроля потока молекулярной информации и определяет свойства проводящей системы сердца в норме и в патологии. У мышей с дефицитом гена Сх40 наблюдается замедление межпредсердного проведения, увеличивался риск развития предсердных аритмий и дисфункции синусового узла [7]. У человека, мутации в области промотора гена Сх40 (-440->Л), снижающие его активность, приводят к аномальному распределению gap-каналов, и, как следствие, к электрофизиологической гетерогенности. Этот эффект наблюдается у лиц с пароксизмами фибрилляции предсердий на фоне функционирования дополнительный путей проводящей системы, где миокард предсердий более уязвим к возникновению микро-реентри [4].
В связи с приведенными данными, представляет значительный интерес исследование полиморфизма генов, кодирующих белки, определяющие структурное и функциональное состояние проводящей системы, и изучение его связи с различными нарушениями ритма.
Цель исследования: изучение частот аллелей гена Сх40 у больных наследственным синдромом слабости синусового узла и их родственников.
Материалы и методы Настоящее исследование было проспективным. Из базы данных кафедры терапии №1 Красноярского государственного медицинского университета им. проф. В. Ф. Войно-Ясенецкого были отобраны 29 семей, имеющих
первичный (наследственный) синдром слабости синусового узла (СССУ). Среди пробандов было 20 женщин и 9 мужчин, средний возраст составил 58 ± 0,15 лет. Среди родственников I, II и III степени родства было 65 мужчин и 68 женщин, средний возраст 39 ± 0,13 лет.
Всем пробандам и их родственникам I, II, III степени родства было проведено клинико-инструментальное исследование: клинический осмотр,
электрокардиография, велоэргометрия, холтеровское мониторирование ЭКГ, атропиновая проба, электрофизиологическое исследование (чреспищеводная стимуляция левого предсердия до и после медикаментозной вегетативной блокады), эхокардиоскопия.
Молекулярно-генетическое исследование больных СССУ и их родственников I, II и III степени родства проводилось в лаборатории медицинской генетики ГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск.
Для определения полиморфизмов гена Cx40 были взяты образцы крови 312 человек, из которых 71 - больные с диагнозом СССУ, 44 - их здоровые родственники I, II, III степени родства и 197 чел. - контрольная группа.
Экстракция ДНК из крови осуществлялась методом фенол-хлороформной экстракции [1, 2]. Для детекции однонуклеотидного полиморфного (ОНП) маркера гена Сх40, локализованного в промоторе (замена G на A в позиции -44) выполнялась аллель-специфическая ПЦР по методике M. Firouzi [4].
Для детекции ОНП -44G>A гена Cx40 использовали следующие праймеры 5- CCCTCTTTTTAATCGTATCTGTGGC-3' (прямой) и 5-
GGTGGAGGGAAGAAGACTTTTAG-3' (обратный). После ПЦР продукт длиной 150 нуклеотидных пар обрабатывается рестриктазой HaeIII. При наличии G аллеля продукт разрезался на фрагменты 126 и 24 нуклеотидных пары [9].
Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере типа "IBM PC" с использованием пакета программ "Stat Soft, USA". Первым этапом определяли частоты аллелей и генотипов изучаемых генов-кандидатов. Соответствие распределения аллелей и генотипов
равновесию Харди-Вайнберга, сравнительный анализ частот генотипов вышеперечисленных генов с контрольной группой выполнялось с использованием критерия % , двустороннего критерия Фишера.
Результаты и обсуждение По полиморфизму 440>Л гена Сх40 был прогенотипирован 71 больной с СССУ, 44 - здоровые родственники пробандов I, II и III степени родства и 197 - лиц контрольной группы.
По результатам аллель-специфической ПЦР выявлены 3 вида генотипов ЛОЯЛ2В у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы: II - гомозиготный дикий, ГО - гетерозиготный, ББ - гомозиготный мутантный.
Таблица 1
Частота встречаемости генотипов гена Сх40 у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы
Г енотипы Больные СССУ (П1= 71) Здоровые родственники (П2=44) Контрольная группа (П3=197) р 1-2 р1-3 р2-3
Абс. % Абс. % Абс. %
44GG 3 4,2 3 6,8 25 12,7 р>0,05 р>0,05 р>0,05
44GA 32 45,1 20 45,4 58 29,4 р>0,05 р<0,05 р>0,05
44AA 36 50,7 21 47,7 114 57,9 р>0,05 р>0,05 р>0,05
Примечание: различия по исследуемым показателям рассчитаны с использованием критерия х■
80
70
60
50
40
30
20
10
0
P 1-3 <0,05 57,9
44GG и СССУ (n=71)
44GA
□ - Родственники здоровые (n=44)
50,7 47,7
44AA Популяция (n=197)
Рис. 1. Частота встречаемости генотипов гена коннексина 40 у больных СССУ, их здоровых родственников и лиц контрольной группы.
Установлено достоверное преобладание гетерозиготного генотипа 440>Л у больных СССУ (45,1 ± 5,9%) по сравнению с лицами контрольной группы (29,4 ± 3,2%) (рис.1).
Согласно результатам М. Бию^, была выявлена ассоциация
гомозиготного полиморфизма с возникновением микро-реентри в
предсердиях, как первичного электрофизиологического дефекта. Предположено, что при мутантном гомозиготном генотипе активность промотора гена снижается вдвое, что отражается на количестве белка, особенно, если учесть короткие сроки жизни Сх 40 (приблизительно 2 часа). При гетерозиготном генотипе активность промотора гена носит усредненный характер. Возникающая анизотропия, вследствие неравномерности
распределения межклеточных щелевых контактов, предрасполагает к появлению зон с однонаправленным блокированием импульса, гетерогенной рефрактерностью клеток и отсутствию зон с восстановленной
возбудимостью в пределах миокарда предсердий. По-видимому, у обладателей гетерозиготного генотипа срабатывает фактор «усреднения» электрофизиологических параметров миокардиоцитов, определяя относительно благоприятный прогноз не только в плане развития микрориентри, но и других аритмий. Так, в популяции Нидерландов, частота встречаемости гетерозигот составляет 31%, а гомозигот по мутантному аллелю - 6% [6].
В других работах по изучению полиморфизма -44G->A продемонстрировано, что в сочетании с мутациями в гене SCN5A, кодирующем натриевые ионные каналы, носительство редкого гомозиготного генотипа предрасполагает к угнетению функции автоматизма в миокардиоцитах предсердий, «остановке предсердий» [5]. У больных с СССУ, в основе которого лежит снижение автоматизма, по-видимому снижено «нейтрализующее» действие мутантного аллеля. Повышение концентрации катехоламинов и ионов Ca + при интактной проводимости щелевых контактов, способно поддерживать анормальную автоматическую активность миокардиоцитов предсердий.
Таким образом, гетерозиготный генотип 44G>A гена Сх 40 является независимым маркером наследственного СССУ. Проведенное исследование свидетельствует о перспективности дальнейшего поиска генетических факторов, определяющих индивидуальные особенности возникновения СССУ.
CONNEXIN 40 GENE POLYMORPHISM IN THE GENESIS OF HEREDITARY SICK SINUS SYNDROME
A. A. Chernova, S.Yu. Niculina, V. A. Shulman, T. S. Kukushkina, M. I.
Voevoda, V. N. Maksimov
Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voino-Yasenetsky
Abstract. Basing on clinical and genetic material we first revealed association between hereditary sick sinus syndrome and polymorphismof connexin 40 gene (Cx40).
Key words: sick sinus syndrome, polymorphism, gene Cx40
Литература
1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир. - 1984. - С. 357.
2. Смит К., Калко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК, анализ генома / Под ред. К. Дейвиса, пер. с англ. - М. Мир. - 1990. - С. 58-94.
3. Amand T.R., Lu J.T., Chien K.R. Defects in cardiac conduction
system lineages and malignant arrhythmias: developmental pathways and disease // Novartis Found. Symp. - 2003. - PMID: 12956335 [PubMed -indexed for MEDLINE]
4. Firouzi M., Ramanna H., Kok B. Association of Human Connexin40 Gene Polymorphisms With Atrial Vulnerability as a Risk Factor for Idiopathic Atrial Fibrillation // Circulation Research. - 2004. - Vol.95. -P.29.
5. Gollob M.H., Jones D.L., Krahn A.D. Somatic mutations in the connexin 40 gene (GJA5) in atrial fibrillation// New Eng. J. Med. - 2006. -Vol. 354. - P. 2677-2688.
6. Groenewegen W.A, Firouzi M., Bezzina C.R. A Cardiac sodium chanall mutation cosegregates with a rare connexine40 genotype in familial atrial standstill // Circ. Res. - 2003. - Vol. 92. - P.14-22.
7. Hagendorff A., Schumacher B., Kirchhoff S. Conduction disturbances and increased atrial vulnerability in Connexin 40-deficient mice analyzed by
transesophageal stimulation// Circulation. - 1999. - Vol.996, №11. -P. 1508-1515.
8. Hewett K., Norman L.W., Sedmera D. Knockout of the neural and heart expressed gene HF-1b results in apical deficits of ventricular structure and activation // Cardiovascular research. - 2005. - Vol.67. - P.548-560.
9. Juang J.M., Chern Y.R., Tsai C.T. The association of human connexin 40 genetic polymorphisms with atrial fibrillation// Int. J. Cardiol. - 2007. -Vol. 116, №1. - P.107-112.
10. Nguyen-Tran V.T.D., Kubalak S.W., Minamisawa S. A noval genetic pathway for sudden cardiac death nia defects in the transition between ventricular and conduction system cell lineages // Cell. - 2000. - Vol.102. -P. 671-682.
11. Willecke K., Elberger J., Degen J. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome // Biol. Chem. - 2002. -Vol.383. - P.725-737.
