CC BY
88
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ... 47
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616.34/.35-006.6-085.273:577.2.088
1 2 2 2 3 3 4
М.В. Антонов , АХ. Сабиров , ТМ. Сабиров , К.В. Уткин , В.В. Решетникова , А.Ю. Барышников , О.Д.Мустаев ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
ПРИ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ ТАРГЕТНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ
Салехардская окружная клиническая больница, Салехард 2ГОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития России, Тюмень 3РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
4Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова, Санкт-Петербург
Контактная информация
Антонов Максим Владимирович. врач-онколог отделения онкологии Адрес: 629001, Салехард, ул. Мира, 39; тел.: +7(3492)24-43-66 e-mail: [email protected]
Статья поступила 06.12.2010., подписана в печать 05.05.2011.
Резюме
В исследовании показано прогностическое значение таргетных препаратов в лечении больных КРР. Проведена оценка молекулярно-биологических маркеров и их значимость в оптимизации проводимой терапии.
Ключевые слова: колоректальный рак, цетуксимаб, бевацизумаб, FOLFIRI.
M.A. Antonov1, A.Kh. Sabirov2, T.M. Sabirov2, K.V. Utkin2, V.V Reshetnikova3, A.Yu. Barishnikov3 THE SIGNIFICANCE OF BIOMARKERS IDENTIFICATIONS FOR TREATMENT OF PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER
Clinical Hospital, Salekhard
2State Medical Academy, Tumen
3N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
4S.M. Kirov medical corps academy, Sankt-Peterburg
Abstract
The study shows the prognostic significance of targeted therapies in the treatment of patients with colo-rectal cancer. The estimation of molecular biological markers and their significance in the optimization of therapy.
Key words: colorectal cancer, biomarkers.
Введение Задачи исследования
В России ежегодно регистрируется 40 000 случаев рака толстой кишки. Умирает 31 000 больных. Средний показатель заболеваемости КЛРМ составляет примерно 13,1 на 100 тысяч населения. Прослеживается стойкая тенденция к росту частоты развития опухолей этой локализации во всех развитых станах, в том числе и России. При этом отмечается значительное число случаев с поздней стадией заболевания, когда существенно затрудняется возможность выполнения радикального хирургического вмешательства и оказания полноценной медицинской помощи. Ведущей причиной поздней диагностики новообразований кишечника является разнообразие клинических форм заболевания и скудность их появлений на ранних стадиях, а как следствие, несвоевременное обращение больных за медицинской помощью [1]. Таким образом, неуклонный рост заболеваемости и чрезвычайно низкая выявляемость ранних форм КРР, а также малоутешительные результаты хирургического вмешательства заставляют искать новые и совершенствовать традиционные методы комбинированного и комплексного лечения с включением в лечебный план ЛТ и ХТ. В столь сложной ситуации только успехи лекарственного лечения могут существенным образом улучшить отдаленные результаты и увеличить продолжительность жизни этой категории пациентов [2].
Изучение экспрессии молекулярно-биологических маркеров в опухолях и сыворотке крови больных КРР иммуногистохимическими, молекулярно-генетическими и биохимическими методами с учетом основных клинико-морфологических характеристик опухоли и возможности использования этих показателей для оценки клинического течения болезни и прогноза развития факторов риска КРР с использованием таргет-ной терапии препаратами бевацизумаб и цетуксимаб.
Материалы и методы
Работа основана на анализе клинических данных и результатов лабораторных методов диагностики 150 больных КРР, подвергшихся хирургическому лечению и получавших специальное противоопухолевое лечение в Салехардской окружной клинической больнице (главный врач Коган М.И). Данные пациенты были разделены на 3 равные группы, каждая по 50 человек. Предварительно на этапе лечения колоректального рака у всех больных проведен анализ статуса гена К^ав в образцах опухоли. Также проведено молекулярно-генетическое исследование плазмы крови, в результате которого у наблюдаемых больных определена гиперэкспрессия EGFR и УСГР.
С целью выявления возможной закономерности между агрессивностью течения заболевания и топографическими характеристиками онкологического процесса, в когорте исследуемых отдельно рассматривались пациенты с поражением ободочной кишки - 70% (105 из 150 человек) и больные с раком прямой кишки - 30% (45 из 100 человек). Кроме этого, анализировались симптомы болезни и наличие опухолевых осложнений (перфорация стенки органа, кишечная непроходимость).
Из общего числа рассматриваемых пациентов с КРР у 44% стадия заболевания согласно классификации Dukes соответствовала категории Dukes'C, а у 56% - Dukes'D. У большинства больных - 93,3% (140 из 150) при морфологическом исследовании операционного материала была обнаружена АТК. Минимальное число больных - 6,7% (10 из 150) имело неопла-зии кишечника со слизеобразованием. Опухоли по степени дифференцировки распределялись следующим образом: 15,3% (23 из 150) - низко, 76,7% (115 из 150) - умеренно и 8% (12 из 150) - высокодифференцированных новообразований.
Ни одному из больных, включенных в исследование, не проводилось специфическое лечение до операции. В послеоперационном периоде: 50 из 150 пациентов получали адъювантную химиотерапию, 50 пациентов получали адъювантную химиотерапию с таргетным препаратом по схеме - FOLFIRI + цетуксимаб и 50 пациентов - FOLFIRI + бевацизумаб.
Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия % и непараметрического точного критерия Фишера для малых выборок. Различия между показателями считались статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследований Иммуногистохимическое определение EGFR и VEGFR
Иммуногистохимическое исследование выполнено на парафиновых срезах опухолей с помощью биотинстрептавидинового иммуноперокси-дазного метода с моно- и поликлональными антителами. Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетке (цитоплазматический, мембранный, ядерный, смешанный).
У всех больных КРР, независимо от степени дифференцировки опухоли, наблюдаются повышенные значения EGFR и VEGFR. При этом, чем выше степень злокачественности, тем больше увеличены показатели факторов роста.
ИГХ определение экспрессии антигена KI-67 в опухолевых клетках
Уровень пролиферативной активности раковых клеток является ключевым фактором, определяющим потенциал злокачественности опухоли и агрессивность течения заболевания. В данном исследовании проведен анализ пролиферативной активности первичных АТК с помощью оценки индексов пролиферации KI-67 и сопоставления полученных данных с клинико-морфологическими факторами прогноза и показателями выживаемости
больных КРР. У большинства больных КРР выявлен высокий уровень пролиферативной активности К1-67, при этом большой процент К1-67+ клеток (>50%) отмечен в 33 случаях, умеренные индексы пролиферации (21-50%) - в 105 случаях и низкий уровень пролиферации (< 20%) - в 12 случаях.
Экспрессия маркера наблюдалась в опухолях с различной степенью гистологической дифферен-цировки и, как правило, в меньшей степени была выражена в участках с секреторной активностью (слизеобразованием). Средний уровень экспрессии антигена К1-67 прямо пропорционально коррелировал со степенью злокачественности КРР. В опухолях с более высоким уровнем злокачественности индекс К1-67 был выше, чем в опухолях с более низким уровнем злокачественности (табл. 3). При изучении связи экспрессии маркеров с показателями выживаемости больных КРР высокая пролиферативная активность клеток КРР, исследованная с помощью индексов К1-67, являлась одним из факторов неблагоприятного прогноза течения заболевания.
Изучение мутационного статуса больных с КРР
Следующим этапом исследования стало изучение молекулярно-генетических изменений в зависимости от гистологического варианта опухоли и пролиферативной активности (табл. 4). Из таблиц 4-7 видно, что на фоне ПХТ происходят изменения молекулярногенетического статуса больных КРР, а именно: уменьшается количество мутаций и снижается уровень EGFR и VEGFR. Наиболее выраженные изменения происходят у больных КРР с высокодифференцированной АТК (более благоприятный фенотип). При анализе изменений, произошедших после проведения 6 курсов ПХТ, наблюдается уменьшение количества мутаций в генах, а также снижение уровня EGFR, VEGFR у всех больных.
При анализе молекулярно-генетического статуса больных КРР, которые получали лечение по схеме РОЬР1Ю + цетуксимаб и РОЬР1Ю + бевацизумаб, видно, что выраженность его изменений (нарушений) меньше, чем у больных, получавших просто ПХТ по схеме РОЬР1Ш. При этом наблюдается не только качественно-количественное улучшение молекулярно-генетического статуса больных КРР (в виде уменьшения количества мутаций), но и снижение уровня экспрессии ростовых факторов, что также является признаком улучшения состояния клеток.
Установлено, что на фоне специального лечения количество мутаций уменьшается. В группе пациентов, получавших ХТ по схеме РОЬР1Ш, частота объективных ответов составила 54%, время до прогрессирования - 10,9 мес. и продолжительность жизни - 20,6 мес.
В группе пациентов, получавших ХТ по схеме РОЬР1Ш + цетуксимаб, частота объективных ответов составила 57%, время до прогрессирования - 11,4 месяцев и продолжительность жизни - 26,1 месяцев.
В группе пациентов, получавших ХТ по схеме РОЬИШ + бевацизумаб, частота объективных ответов - 57,9%, время до прогрессирования - 13,5 месяцев и продолжительность жизни - 27,7 меся.
При анализе данных по общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования выявлено, что схемы лечения больных КРР РОЬИШ + цетуксимаб и РОЬР1Ш + бевацизумаб увеличивают медиану времени до прогрессирования с 10,9 до 11,4 мес.в и с 10,9 до 13,5 мес., медиану общей выживаемости с 20,6 до 26,1 мес. и с 20,6 до 27,7 мес. по сравнению со схемой РОЬР1Ш без добавления таргетных препаратов.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ... 49
Таблица 1
Распределение больных КРР в зависимости от степени дифференцировки опухоли и значения индекса EGFR
Степень дифференцировки опухоли (n пациентов) Уровень экспрессии антигена EGFR
Q 1 + 2+ 3+
Низкая (n=23) - - 4 19
Умеренная (n=115) - 29 B8 18
Высокая (n=12) 4 8 - -
Таблица 2
Распределение больных КРР в зависимости от степени дифференцировки опухоли и значения индекса VEGFR
Степень дифференцировки опухоли (п - кол-во пациентов) Уровень экспрессии антигена VEGFR
Q 1 + 2+ 3+
Низкая (п=23) - 1 3 19
Умеренная (п=115) 2 25 B4 24
Высокая (п=12) 2 9 1 -
Таблица 3
Распределение больных КРР в зависимости от степени дифференцировки опухоли и значения индекса К1-67
Степень дифференцировки опухоли (п - кол-во пациентов) Уровень экспрессии антигена KI-67
низкая пролиферативная активность < 20% (n=12) умеренная пролиферативная активность 21-5Q% (n=1Q5) высокая пролиферативная активность > 50% (n=33)
Высокая (п=12) 12 (100%) - -
Умеренная (п=115) - 1Q5 (91,3%) 10 (8,7%)
Низкая (п=23) - - 23 (100%)
Добавление бевацизумаба, цетуксимаба к химиотерапии достоверно улучшает время до прогрессирования, и увеличивает продолжительность жизни больных. Терапия моноклональными антителами должна проводиться максимально долго, до прогрессирования. Не определены клинические и молекулярные факторы, позволяющие прогнозировать успех терапии бевацизумабом. В то же время, эффективность антиЕСРК антител реализуется только у пациентов без мутации гена К-газ.
При изучении результатов мы выявили, что наибольшее количество мутаций наблюдается у больных КРР с умеренно-дифференцированными, активно пролиферирующими (К1-67 > 50 %) опухолями.
При этом преобладают мутации р53 в 7 экзоне. Существенной зависимости от гистологической формы опухоли и возраста больных выявлено не было.
Как маркер клеточной пролиферации антиген К1-67 является важным критерием прогноза клинического течения КРР. Уровень клеточной пролиферации (индекс К1-67) коррелирует с ответом опухоли на предоперационную химиотерапию и исход КРР, доказано, что уровень экспрессии антигена К1-67 значительно снижается с возрастом пациентов[3].
Результаты исследования позволяют предположить, что, несмотря на то, что апоптоз и клеточная пролиферация являются взаимосвязанными процессами, оказывающими сильное влияние на биологическое поведение опухолей, при оценке риска метастазирования КРР экспрессия этих факторов должна учитываться в комплексе с маркерами, более тесно связанными с инвазивным потенциалом раковых клеток.
Вместе с тем, полученные в исследовании результаты подтверждают, что важными факторами прогноза течения КРР являются следующие биологические параметры пролиферации и апоптоза: индекс пролиферации К1-67, ядерная аккумуляция
р53 и соотношение уровней экспрессии p53/EGFR и VEGFR в опухоли.
Таким образом, при однофакторном анализе показано, что содержание большинства изученных белков в опухолях обладает определенной прогностической ценностью. При многофакторном анализе комплексного содержания белков с учетом клинико-морфологических признаков были определены наиболее значимые независимые показатели.
Следует отметить, что такие морфологические характеристики, как низкая степень гистологической дифференцировки и наличие инвазии опухолью сосудов снижали прогностическую значимость большинства маркеров.
Подводя итог проведенного исследования можно заключить, что изучение особенностей экспрессии молекулярных маркеров при КРР, а также сопоставление собственных результатов и литературных данных показало, что процессы инвазии и мета-стазирования сопровождаются значительными изменениями иммунофенотипа клеток первичных опухолей и затрагивают многие биохимические процессы. Прекращение экспрессии одних и гиперэкспрессия других факторов влияет на целый ряд клеточных характеристик и приводит к возникновению злокачественного фенотипа, что в последствии способствует прогрессии опухолей, развитию отдаленных метастазов и снижению выживаемости больных КРР.
Клинико-морфологические, иммуногисто -
химические, биохимические сопоставления могут способствовать определению более точных критериев для совершенствования методов диагностики и определения показаний к дополнительным методам терапии.
Дальнейшее изучение и проверка выявленных закономерностей в клинике будут полезны для прогнозирования и улучшения результатов лечения опухолей данной локализации.
Таблица 4
Молекулярно-генетический статус больных КРР в зависимости от экспрессии ростовых факторов EGFR, hVEGFR-165до лечения (п= 150)
Степень дифференцировки опухолевых клеток (п пациентов) EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) Исследуемый ген Кол во мутации
р53, экзон C-kit, кодон B-raf, кодон АРС K-ras; кодоны E-cadherin р16
5 6 7 8 12 15 - 12; 13 - -
Высокая (п 12) 10,8 130,0 4 4 9 8 2 - 3 - 4 1 35
Умеренная (п-115) 36,7 168,0 27 54 79 42 12 - 18 - 32 26 290
Низкая (п 23) 15,4 174,7 11 10 21 9 7 1 14 - 11 8 92
Таблица 5
Молекулярно-генетический статус больных КРР после 6 курсов FOLFIRI (п=50)
Степень дифференцировки опухолевых клеток (п пациентов) EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) Исследуемый ген
р53, экзон C-kit, кодон B-raf, кодон АРС K-ras; кодоны E-cadherin р16
5 6 7 8 12 15 - 12; 13
Высокая (п=4) 9,8 128,0 1 1 3 2 - - 1 - 2 -
Умеренная (п=38) 34,9 165,0 9 21 32 15 4 - 8 - 12 10
Низкая (п=8) 13,8 143,9 5 4 8 4 3 1 4 - 4 4
Таблица 6
Молекулярно-генетический статус больных КРР после 6 курсов FOLFIRI + цетуксимаб (п=50)
Степень дифференцировки опухолевых клеток (п пациентов) EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) Исследуемый ген
р53, экзон C-kit, кодон B-raf кодон АРС K-ras, кодоны E-cadherin р16
5 6 7 8 12 15 - 12; 13 - -
Высокая (п=4) 9,8 128,0 1 - 3 2 - - 1 - 1 -
Умеренная (п=39) 34,9 165,0 7 16 16 12 3 - 3 - 8 7
Низкая (п=7) 13,8 143,9 3 3 5 3 3 - 4 - 3 2
Таблица 7
Молекулярно-генетический статус больных КРР после 6 курсов FOLFIRI + бевацизумаб (п=50)
Степень дифференцировки опухолевых клеток (п пациентов) EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml) Исследуемый ген
р53, экзон C-kit, кодон B-raf, кодон АРС K-ras кодоны E-cadherin р16
5 6 7 8 12 15 - 12; 13
Высокая (п=4) 9,3 125,9 - - 3 2 - - - - 1 -
Умеренная (п=38) 34,3 161,3 5 10 13 9 2 - 3 - 6 4
Низкая (п=8) 13,3 139,2 2 2 5 2 1 - 3 - 2 1
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ... S1
Выводы
Многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клинико-морфологических признаков с учетом экспрессии молекулярно-биологических маркеров позволил выявить тесную связь между EGFR и VEGFR и молекулярно-генетическим статусом больных КРР.
На основании полученных результатов установлено, что изменения их экспрессии рассматривается как общий независимый фактор прогноза безрецидивной выживаемости больных КРР.
Молекулярно-генетическое исследование выявило выраженные изменения: в большинстве наблюдений встречаются мутации генов р53 в 6; 7 экзонах, APC, C-kit, E-cadherin.
Полученные результаты позволяют рассматривать иммуногистохимический анализ EGFR и VEGFR в опухоли как метод прогнозирования развития отдаленных метастазов у больных КРР после операции. У всех больных выявлено превышение нормальных значений EGFR и VEGFRs.
Высокая пролиферативная активность клеток АТК, исследованная с помощью индекса KI-67, является достоверным фактором неблагоприятного прогноза общей выживаемости, но не связана с БРВ больных РТК. На фоне проводимого комплексного лечения в группах больных наблюдалась положительная динамика изменения молекулярно-генетического статуса: уменьшилось число мутаций у больных с заранее благоприятным фенотипом. Уровень EGFR и VEGFRs на фоне применения схем FOLFIRI + бевацизумаб и FOLFIRI + цетуксимаб достоверно снижался по сравнению с FOLFIRI без добавления таргетных препаратов.
У больных, проходивших лечение по схеме FOLFIRI + бевацизумаб и FOLFIRI + цетуксимаб наблюдается значительное улучшение молекулярногенетического статуса (число мутаций сократилось) по сравнению с группой FOLFIRI без добавления таргетных препаратов. У групп больных проходивших лечение с добавлением таргетных препаратов наблюдалось увеличение показателей общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования.
Литература
1. Базин И.С, Гарин АМ, Жарков СА., Нариманов М.Н. Рак толстой кишки состояние проблемы. // Российский медицинский журнал. 2003, Т. 11. C. 674-79
2. Имянитов E.H. Клинико-молекулярные аспекты колоректального рака: этиопатогенез, профилактика, индивидуализация лечения. // Практ. онкол. — 2005. - Т. 6, N2. С. 65-70.
3. Oesterreich S., Deng W, Jiang S., Cui X, Inanova M, Schiff R, Kaiyan K, Kang K, Hadsell D.L., Behrens J. & Lee A.V Estrogenmediated down-regulation of E-cadherin in breast cancer cells. // Cancer Res. 63. P. 5203-8.
