CC BY
59
Онкология
es of medical care in the diagnosis and treatment of colorectal cancer.
Keywords: colonoscopy, colorectal cancer, screening, endoscopy.
ОЦЕНКА МОЛЕКУЛЯРНОБИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА
А.А. Налётов1, Т.А. Нелюбова2,
Ю.В. Солнцева2, Н.М. Карпова2
Тюменский ГМУ, г. Тюмень, Россия
2МКМЦ «Медицинский город», г. Тюмень, Россия
В статье представлены результаты изучения частоты встречаемости молекулярно-генетических маркеров при раке желудка, частоту экспрессии общебиологических маркеров, характеризующих «поведение» опухолевой клетки, их корреляцию с агрессивностью опухоли и прогнозом. Изучены материалы 54 первичных больных раком желудка. По результатам исследования следует, что мутационный статус по парафиновым образцам опухоли и плазме крови, уровень EGFRs и VEGFRs, индекс пролиферативной активности Ki -67 могут являться маркерами для оценки эффективности проводимой терапии и определения полноты излеченности больных раком желудка после специальных методов противоопухолевого лечения.
Ключевые слова: рак желудка, общебиологические маркеры, мутационный статус, EGFR, VEGFR, Ki -67.
Несмотря на стабильное снижение заболеваемости, рак желудка (РЖ), по-прежнему, остается актуальной проблемой современной онкологии [2]. Длительное время РЖ остается ведущей причиной в структуре смертности от онкологической патологии [2, 6, 9].
В России ежегодно регистрируется около 38 тыс. новых случаев рака желудка, причем более 54% из них погибают в течение первого года [1, 10]. В Тюменской области заболеваемость РЖ за последние 10 лет снизилась с 20,3 до 17,5 на 100 тыс. населения и в 2012 году выявлены 574 случая [2, 6, 8]. Особое значение в настоящее время придается ранней диагностике и лечению рака желудка, возможности предупредить прогрессирование заболевания [7, 9]. При этом даже при наличии признаков метастазирования в регионарных лимфатических узлах показано радикальное оперативное вмешательство, в то время как при отдаленных метастазах оправданы лишь паллиативные операции, позволяющие улучшить качество жизни пациентов [2, 3, 4]. Современные методы позволяют с высокой точностью определить наличие и степень распространения и уровень дифференцировки первичной опухоли, однако в настоящее время отсутствуют достаточное количество методов для оценки полноты излеченности, раннего выявления отдаленных метастазов [1, 5]. Таким образом, в ряду наиболее важных проблем онкологии - задача изучения диагно-
стической и прогностической значимости некоторых маркеров канцерогенеза: частоты выявления и определения уровней рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР), антигена Ki-67, определяемых иммуногистохимически и иммуносорбентным методом, и мутаций в некоторых онкогенах при развитии рака желудка у человека представляется весьма актуальной. Последние, наряду с другими онкогенами, супрессорными генами и секреторными белками, рассматриваются в качестве одних из перспективных маркеров, характеризующих биологическое поведение опухоли, и позволяющие индивидуализировать подходы к назначению терапии больным раком желудка [3, 5].
Однако, несмотря на довольно значительное количество исследований EGFR, VEGFR, антигена Ki-67 и мутаций в некоторых онкогенах однозначного ответа на вопрос о значении этих онкомаркеров при развитии рака желудка у человека до настоящего времени пока не получено [3].
В литературе практически не описана роль и значение свободнорастворимых в сыворотке крови форм рецепторов ростовых факторов в канцерогенезе рака желудка.
Исследование молекулярных механизмов пролиферативных (гиперпластических) процессов и поиск путей их фармакологической коррекции является одной из самых динамично развивающихся областей современной молекулярной медицины [1,
3, 5].
Понимание базисных основ индукции клеточного роста, особенно в условиях опухолевой трансформации клеток, является неотъемлемой частью грамотного подхода к управлению и мониторирова-нию пролиферативной активностью.
Цель исследования: изучение частоты
встречаемости молекулярно-генетических маркеров при раке желудка, частоту экспрессии общебиологических маркеров, характеризующих «поведение» опухолевой клетки, их корреляцию с агрессивностью опухоли и прогнозом.
Материал и методы. В исследование включены 54 первичных больных раком желудка, проходивших обследование и лечение на базе ГАУЗ ТО МКМЦ «Медицинский город». Всем больным проведено оперативное лечение и проведена полихимиотерапия. Среди больных женщин - 7 (13%), мужчин 47 (87%). По стадиям заболевания больные распределились: !в - 4, II - 10, Ша - 19, Шв стадия - 8 и IV стадия - 13. По гистологической структуре опухоли - у всех пациентов выявлена аденокарцинома различной степени дифференцировки. Причем, высокодифференцированная аденокарцинома (ВДА) выявлена у - 10 (18,5%), умереннодифференцированная (УДА) у - 11 (20,4%) и низкодифференцированная (НДА) у 33 (61,1%).
Определение уровня экспрессии свободнорастворимых форм EGFR и VEGFR в сыворотке крови
Том 17, № 3, 2015 Тюменский медицинский журнал
25
Онкология
проводили с помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации ELISA с использованием тест-наборов BioSource International, Inc, кат. №№ KHG0111, KHG0061. Уровень экспрессии антигена Ki-67 определяли в клетках опухоли с помощью метода иммуногистохимического анализа (ИГХ) с использованием тест наборов фирмы «Daco». Материалом для молекулярно - генетического исследования послужили клетки опухоли и плазма крови этих больных. Выделение ДНК проводили с помощью метода фенол-хлороформной экстракции. Наличие мутаций определяли в онкогенах р53 (5,6,7,8 экзоны), C-kit, B-raf, APC, K-ras, E-cadherin и р16 с использованием специально подобранных праймеров. Результаты анализа верифицировали прямым секвенированием полученных фрагментов ПЦР. Исследование проводилось непосредственно после выполнения оперативного вмешательства а также после окончания полного курса лечения (операция + адъювантная химиотерапия полихимиотерапия по стандартным схемам).
Результаты и обсуждение. В ДНК, выделенной из парафиновых образцов опухолевой ткани, выявлены многочисленные мутации в различных онкогенах [р-53 (ex 5,6,7,8), C-kit, B-raf (15 кодон), APC, K-ras (12 кодон), E-kadcherin, p-16]. Наибольшее количество мутаций выявлено в гене р-53, особенно в 7 экзоне (табл. 1).
Таблица 1
Распределение больных с выявленными мутациями в различных генах в зависимости от степени дифференцировки опухоли в парафиновых образцах
ДНК ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33 Всего n=54
р53 5 экзон 2 3 6 11
6 экзон 3 1 15 19
7 экзон 6 7 26 39
8 экзон 5 4 11 20
C-kit - 1 6 7
B-raf 1 4 5 10
APC 5 9 24 38
K-ras - 4 16 20
E-cadherin - 2 - 2
р16 - 3 8 11
Ki -67 >35% 8 1 - 9
>50% 1 8 5 14
>70% 1 2 28 31
Индекс пролиферативной активности Ki-67 имеет наибольшее значение у пациентов с низкой степенью дифференцировки опухолевых клеток, что коррелирует с литературными данными.
Свободнорастворимая фракция эпидермального фактора роста и сосудистого эндотелиального фактора роста, выделенная из сыворотки крови, наиболее выражена у пациентов с низкодифференцированной аденокарциномой, высоким индексом пролиферативной активности и у больных имеющих
мутацию в 7 экзоне гена р53, что также является маркером агрессивности и метастатической активности этих клеток (табл. 2).
Таблица 2
Распределение больных в зависимости от экспрессии ростовых факторов EGFR и VEGFR и степени дифференцировки опухоли в сыворотке крови
Маркер нг\мл ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33 Всего n=54
EGFR (n=0- 9,5) >9,5 8 9 - 17
>15 2 2 1 5
>20 - - 32 32
VEGFR (n=0-120) >120 - 1 - 1
>140 - 9 3 12
>160 - 1 29 30
Мутации в генах определялись в ДНК, выделенной из парафиновых образцов опухоли и плазме крови. Следует отметить, что генетическая картина, полученная из ДНК парафиновых образцов опухоли, коррелировала с генетической картиной выделенной в плазме крови (табл. 3).
Таблица 3
Распределение больных с выявленными мутациями в различных генах в зависимости от степени дифференцировки опухоли в плазме крови
ДНК экзон ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33 Всего n=54
5 2 2 4 8
р53 6 3 - 15 18
7 6 7 26 39
8 4 4 8 16
C-kit - 1 6 7
B-raf 1 4 5 10
APC 4 7 19 32
K-ras - 3 11 14
E-cadherin - 2 - 2
р16 - 2 5 5
По представленным в таблице данным видно, что максимальное количество мутаций в ДНК определено у больных с низкодифференцированной аденокарциномой.
С целью определения наличия изменений в генетическом статусе, нами проведено молекулярно генетическое исследование плазмы крови больных раком желудка после комбинированного лечения. Результаты молекулярно-генетического исследования после окончания лечения показали достоверное снижение количества мутаций (табл. 4).
По представленным данным в таблице следует, что количество мутаций в генах определенных до лечения снизились во всех группах исследования больных. Такая же тенденция отмечена при определении экспрессии рецепторов ростовых факторов в сыворотке крови (табл. 5).
26
Тюменский медицинский журнал Том 17, № 3, 2015
Онкология
Таблица 4
Динамика количества мутаций в плазме крови при молекулярно-генетическом исследовании
До лечения После лечения
ДНК экзон ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33 ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33
5 2 2 4 - - 2
р53 6 3 - 15 - - 7
7 6 7 26 - 1 11
8 4 4 8 - 1 5
C-kit - 1 6 - - 3
B-raf 1 4 5 - 1 2
APC 4 7 19 - - 2
K-ras - 3 11 - - 4
E-cadherin - 2 - - - -
р16 - 2 5 - - -
Таблица 5
Динамика экспрессии рецепторов ростовых факторов (EGFR и VEGFR) в сыворотке крови
До лечения После лечения
Маркер нг\мл ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33 ВДА n=10 УДА n=11 НДА n=33
EGFR n=0-9,5 >9,5 8 9 - - - -
>15 2 2 1 - 2 -
>20 - - 32 - - 11
VEGFR n=0-120 >120 - 1 - - - -
>140 - 9 3 - 2 1
>160 - 1 29 - - 11
Выводы:
1. Низкая степень дифференцировки опухолевой клетки коррелирует с высоким индексом пролиферативной активности Ki-67.
2. Низкая степень дифференцировки опухолевой клетки коррелирует с высоким уровнем EGFRs.
3. Низкая степень дифференцировки опухолевой клетки коррелирует с высоким уровнем VEGFRs.
4. В результате лечения происходит снижение количества мутаций и уровней EGFRs и VEGFRs.
5. Мутация гена р53 в 7 экзоне выявлена в большинстве случаев у больных с низкодифференцированной аденокарциномой, высоким уровнем EGFR и VEGFR и высоким индексом пролиферативной активности клеток, что является маркером высокой агрессивности опухоли и плохого ответа опухоли на проводимое лечение.
6. Мутационный статус по парафиновым образцам опухоли и плазме крови, уровень EGFRs и VEGFRs, индекс пролиферативной активности Ki-67 могут являться маркерами для оценки эффективности проводимой терапии и определения полноты излеченности больных раком желудка после специальных методов противоопухолевого лечения.
Литература:
1. Белявская В.А., Вардосанидзе В.К., Смирнова О.Ю. и др. Генетический статус р53 при раке желудка: соматические мутации и
полиморфизм кодона 72 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Том 141, № 2. - С. 202-204.
2. Гарин А.М., Базин И.С. Десять наиболее распространенных злокачественных опухолей. - М. 2006.
3. Заридзе Д.Г. Канцерогенез. - М.: М, 2004. - 575 с.
4. Зотов П.Б., Прохорченко А.В., Филоненко Е.В. К вопросу оптимизации специального лечения больных раком желудка // Академический журнал Западной Сибири. - 2005. - № 4. - С. 13-14.
5. Киселев В.И., Муйжнек Е.Л. «Общие принципы профилактики метастатической болезни и сенсибилизации опухолей». - М.: Димитрейд График Групп, 2007. - 125 с.
6. Кудряков А.Ю., Зуев В.Ю., Гайсин Т.А., Зырянов А.В., Федоров Н.М., Подгальняя Е.Б., Сюбаев В.А. О состоянии онкологической помощи в Тюменской области за 2014 год. Информационный бюллетень. - Тюмень, 2015. - 46 с.
7. Петросян А.М., Харченко В.З. Изменения протеиназ ингибиторной системы у больных раком желудка // Онкология. - 2007. -Том 9, № 4. - С. 303-306.
8. Прохорченко А.В. Злокачественные новообразования в Тюменской области // Академический журнал Западной Сибири. - 2005. - № 3. -С. 45-46.
9. Синяков А.Г., Зотов Б.П., Гайсин Т.А., Вшивков В.В., Никитина М.В. Онкологическая ситуация в Тюменской области в 20052011 гг. и факторы, влияющие на её улучшение // Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - № 3. - С. 72-74.
10. Состояние онкологической помощи населению России в 2008 году / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - Москва, 2009. - 192 с.
EVALUATION OF MOLECULAR BIOLOGICAL MARKERS IN THE TREATMENT OF PATIENTS WITH GASTRIC CANCER
A.A. Naletov, N.M. Fedorov, T.A. Nelubova,
YU.V. Solntseva, N.M. Karpova
The article presents the results of studying the frequency of molecular genetic markers in gastric cancer, the frequency of expression of general biological markers that characterize the "behavior" of tumor cells correlates with the aggressiveness of the tumor and the prognosis. After reviewing the 54 primary gastric cancer patients. The study implies that the mutation status of paraffin tumor samples and blood plasma level EGFRs and VEGFRs, the index of the proliferative activity of Ki -67 may be markers for assessing the effectiveness of the therapy and to determine the completeness of cure gastric cancer patients after special methods of cancer treatment.
Keywords: gastric cancer, general biological markers, mutation status, EGFR, VEGFR, Ki -67.
КТ ДИАГНОСТИКА РАКА ЖЕЛУДКА И КИШЕЧНИКА В МКМЦ «МЕДИЦИНСКИЙ ГОРОД»
Н.В. Рудаков, В.В. Кузнецов
МКМЦ «Медицинский город», г. Тюмень, Россия
Е-mail авторов: [email protected]
Обсуждаются вопросы КТ-диагностики при злокачественных новообразованиях органов желудочно - кишечного тракта. Приводятся результаты собственных исследований.
Ключевые слова: компьютерная томография, рак, желудок.
Согласно докладу о раковых заболеваниях, выпущенному институтом по исследованию рака Все-
Том 17, № 3, 2015 Тюменский медицинский журнал
27
