CC BY
46
Значение исследования частоты мутантных клеток по локусам Т-клеточного рецептора у детей ликвидаторов аварии на чАЭС для формирования групп высокого канцерогенного риска
Балева Л.С., Сипягина А.Е., С Смирнова С.Г., Селиванова Е.И., Кузьмина Т.Б., Орлова Н.В., Ткаченко Н.П., Буянкин В.М.
Value of studying the frequency of mutant cells from T-cell receptor loci in chernobyl accident liquidators' children in forming high carcinogenic risk groups
Baleva L.S., SipyaginaA.E., Smirnova S.G., Selivanova E.I., Kuzmina T.B., Orlova N.V., Tkachenko N.P., Buyankin V.M.
Московский НИИ педиатрии и детской хирургии»; Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
В работе приведены результаты исследования частоты TCR-мутаций лимфоцитов у детей (рожденных через 1—17 лет после облучения родителей вследствие аварии на ЧАЭС) и их родителей—ликвидаторов аварии на ЧАЭС (средняя накопленная доза 10,0 рад/Р). Проведен анализ закономерностей изменения частоты TCR-мутаций лимфоцитов как показателя соматического мутагенеза, важного для формирования группы высокого канцерогенного риска. У 13±3% обследованных ликвидаторов частота TCR-мутантных клеток превышает норму (верхнюю границу 95% доверительного интервала в группе возрастного контроля). Размер группы канцерогенного риска не зависит от дозы воздействия в диапазоне до 20 рад/Р, но обратно пропорционален возрасту ликвидаторов в момент облучения. Размер группы повышенного канцерогенного риска (по критерию частоты TCR-мутантных клеток) в группе детей ликвидаторов не превышает контрольные величины. Анализ индивидуальных особенностей организма имеет более важное значение.
Ключевые слова: дети ликвидаторов, ликвидаторы, радиация, соматический мутагенез, генные мутации, Т-клеточный рецептор, канцерогенный риск.
The signs of radiation-induced genetic instability in lymphocytes were revealed in the liquidators and their children, which characterized a possibility of using the index somatic mutagenesis to form high carcinogenic risk groups among the irradiated individuals for a further follow-up and a prospective evaluation of the developed approach. The paper provides the results of a study of the frequency of T-cell receptor (TCR)-mutant cells in 256 Chernobyl accident liquidators (mean accumulated dose 10,0 Gy) and their children born 1—17 years after the parents' irradiation. The mechanisms responsible for the change of this indicator of somatic mutagenesis, which is important in forming a high carcinogenic risk group, have been analyzed. In 13±3% of the liquidators examined, the frequency of TCR-mutant cells exceeded the normal values (the upper bound of a 95% confidence interval in the age-matched control group). The size of a carcinogenic risk group was not found to be related to the radiation dose of up to 20 Gy, but inversely related to liquidators' age at exposure. According to the TCR-mutant cell frequency, the size of higher carcinogenic risk group in the liquidators' children did not exceed the control values.
Key words: liquidators' children, liquidators, radiation, somatic mutagenesis, gene mutations, T-cell receptor, carcinogenic risk.
© Коллектив авторов, 2010
Ros Vestn Perinatol Pediat 2010; 4:102-109
Адрес для корреспонденции: Балева Лариса Степановна — д.м.н., проф.,
руководитель отдела радиационной экопатологии детского возраста
МНИИ педиатрии и детской хирургии
Сипягина Алла Евгеньевна — д.м.н., г.н.с. того же отдела
Кузьмина Татьяна Будажаповна — к.м.н., в.н.с. того же отдела
125412 Москва, ул. Талдомская, д. 2
Смирнова Светлана Гурьевна — к.б.н., с.н.с. лаборатории пострадиационного восстановления Медицинского радиологического научного центра РАМН 249036 Обнинск,ул. Королева, д. 4
Селиванова Елена Ивановна — к.б.н., с.н.с. лаборатории пострадиационного восстановления
Орлова Нина Владимировна — к.б.н., с.н.с. лаборатории пострадиационного восстановления
Ткаченко Нина Павловна — к.м.н., в.н.с. отдела лазерной фотодинамической терапии
Буянкин Валерий Михайлович — к.м.н., с.н.с. кафедры реабилитологии РГМУ
117997 Москва, ул. Островитянова, д. 1
Феномен радиационно-индуцированной геномной нестабильности способен оказывать влияние на состояние здоровья не только самих облученных лиц, но и их потомков, приводя к повышению канцерогенного риска. Этот вопрос нуждается в тщательном изучении. С помощью современных молекулярно-клеточных технологий требуется проведение обследования лиц, подвергшихся воздействию ионизирующих излучений при ликвидации аварии на ЧАЭС, и их потомков первого поколения с целью формирования группы высокого канцерогенного риска, последующего клинического наблюдения и внедрения целенаправленных профилактических мероприятий.
Механизмы формирования радиационно-индуци-рованной нестабильности генома, по всей видимости, заключаются в возникших изменениях в облученной клетке, приводящих к различным (очевидно, эпиге-
нетическим) способам передаваться потомкам. Как отмечают В.К. Мазурик и В.Ф. Михайлов (2001) [1], известны три взаимосвязанные системы поддержания стабильности генома. Они включают систему окислительно-восстановительного гомеостаза, систему контроля клеточного цикла в сверочных точках и систему репарации повреждений ДНК. На уровне клеточных популяций, в том числе in vivo, в индукцию радиационной нестабильности генома вовлечены и другие механизмы. Немаловажная роль, вероятно, принадлежит так называемому, эффекту «свидетеля» (bystander effect). Он заключается в появлении повышенного количества мутаций, гибели необлученных клеток, которые находились в контакте с облученными клетками или продуктами их жизнедеятельности [2, 3—5].
Основываясь на результатах работ [6—8], можно предполагать, что на уровне организма существуют дополнительные механизмы, приводящие к возникновению и поддержанию радиационно-индуциро-ванной нестабильности генома. Авторы оценили выраженность нестабильности генома облученных клеток у потомков и установили, что частота мутаций in vivo значительно выше, чем in vitro. Известный исследователь радиационно-индуцированной генетической нестабильности E. Wright пришел к выводу, что проявление этого феномена in vivo в клетках гемопо-этической системы является не столько результатом «внутренней» нестабильности, сколько отражением ответа на постоянную продукцию повреждающих сигналов в тканевом микроокружении [3]. Процессы, происходящие в тканевом микроокружении, являются дополнительным механизмом повреждения генетического аппарата клеток и частично объясняют большую выраженность генетической нестабильности in vivo, чем in vitro [9].
На основе общепринятых представлений о ключевой роли мутаций в злокачественной трансформации клеток было сделано предположение, что в ходе канцерогенеза должен возникать мутационный процесс, который ускоряет появление требуемых для злокачественной трансформации множественных последовательных и взаимодействующих мутаций [10, 11]. Генетическая нестабильность, индуцированная радиационным воздействием, могла бы быть таким процессом и играть существенную роль в радиационном канцерогенезе. Нарушение молекулярных механизмов контроля клеточного цикла и р53-зави-симого ответа на повреждение ДНК наблюдается как в клетках злокачественных опухолей, так и в клетках с радиационно-индуцированной генетической нестабильностью. Если сравнивать количество соматических мутаций при наследственной и радиационно-индуцированной нестабильности не с нормой, а друг с другом, то в первом случае количество мутаций будет выше. Радиационно-индуцированная нестабильность повышает канцерогенный риск, как и наслед-
ственно обусловленная генетическая нестабильность.
Результаты цитогенетического мониторинга свидетельствуют о значительном первоначальном повышении частоты хромосомных аберраций у ликвидаторов в зависимости от накопленной дозы радиационного воздействия. В еще более отдаленные сроки (от 10 до 15 лет) после аварии было выявлено повторное умеренное повышение частоты аберраций [12]. Как справедливо отмечают авторы, этот факт, отмеченный независимыми группами исследователей, отражает возникновение отдаленной генетической нестабильности в соматических клетках облученных лиц.
В литературе имеются данные о частоте мутаций по TCR (Т-клеточный рецептор) и HPRT (гипок-сантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза) локусам в лимфоцитах периферической крови ликвидаторов Чернобыльской аварии [13, 14—18]. Результаты группового сопоставления частоты мутаций в группах ликвидаторов и контрольных лиц однозначно свидетельствуют о повышении этого показателя соматического мутагенеза и по одному и по другому локусу у ликвидаторов, несмотря на длительное время с момента облучения. При этом все авторы указывают на значительный индивидуальный разброс данных с наличием небольшого количества лиц счастотой мутаций, превышающей верхнюю границу 95% доверительного интервала [14, 15].
Наблюдаемое повышение уровня соматического мутагенеза у ликвидаторов не является следствием прямого действия радиации на лимфоциты во время облучения. Вероятно, по крайней мере у части лиц, происходит усиленное формирование мутантных клеток de novo в отдаленные сроки после радиационного воздействия вследствие генетической нестабильности лимфоцитов, возникшей у потомков под влиянием ионизирующего излучения облученных клеток.
Возможность индукции нестабильности генома у потомков облученных родителей дискутируется в литературе уже в течение нескольких лет [19—23], причем в ряде работ показана генетическая нестабильность соматических клеток после облучения в малых дозах у потомков не только первого, но и последующих поколений животных. Так, наблюдался эффект повышения в 1,3 раза частоты микроядер в эритроцитах костного мозга у потомства F1 хронически облученных самцов-мышей при дозе 0,1 Гр [16, 17, 24, 25]. Примечательно, что этот эффект распространялся и на поколение F3 при облучении родителей (самцов) в несколько более высоких дозах — 21,5 и 31,5 сГр. Серия работ белорусских исследователей, посвященная изучению генетической нестабильности в природных популяциях грызунов, обитающих на загрязненной радионуклидами территории, также подтверждает возможность индукции и длительного сохранения этого феномена [26].
Вместе с тем результаты изучения соматического
мутагенеза у детей облученных родителей и результаты эпидемиологических исследований достаточно противоречивы. Представлены данные о значительном повышении частоты хромосомных аберраций, минисателлитных мутаций, микроядер в лимфоцитах и эритроцитах крови детей, родившихся у родителей, облученных в результате аварии на ЧАЭС и на ПО «Маяк» в Челябинской области [27—29]. Исследованы частота точковых мутаций в гене p53 и полиморфизм гипервариабельных последовательностей [30], ассоциированных с микросателлитами, в ДНК клеток периферической крови потомков F1 облученных лиц — профессионалов ядерно-энергетического комплекса в дозах до 500 сГр. Для группы потомков, рожденных от отцов, подвергшихся облучению в дозах выше 300 сГр, доказано повышение полиморфизма ми-кросателлитных повторов, а также частоты точковых мутаций.
Итоги наблюдений за большой когортой детей, родившихся у родителей, которые пережили атомные бомбардировки Хиросимы и Нагасаки, остаются предметом противоречивых суждений [31, 32]. Данные, полученные с помощью традиционных ци-тогенетических методов, не противоречат предположению об отсутствии генетических последствий у потомков облученных лиц. При этом указывается на сложность интерпретации результатов и необходимость использования новейших методов исследования.
Имеются данные об отсутствии повышения частоты мутаций в микросателлитных локусах у детей ликвидаторов аварии на ЧАЭС, облученных в дозах менее 50 мЗв [28]. В работе [29] не установлено статистически значимых различий частоты мутаций в минисателлит-ных локусах в группе детей ликвидаторов и в контроле, однако авторы отмечают повышение в 1,4 раза частоты мутаций в группе детей ликвидаторов, зачатых не позднее чем через 2 мес после окончания работы в зоне аварии, по сравнению с детьми, зачатие которых произошло спустя 4 мес и более после облучения родителя. Не обнаружено повышения частоты мини- или микросателлитных мутаций и в работах К Slebos и соавт. и Л. Кшга и соавт. [31, 32], причем в первом исследовании частота мутаций не зависела от дозы облучения родителя, во втором — зависела.
Ряд российских авторов исследовали уровень соматического мутагенеза у детей ликвидаторов аварии на ЧАЭС с помощью традиционных цитогенетиче-ских методов. Данные, полученные в лаборатории И.Е. Воробцовой, свидетельствуют о повышении частоты хромосомных аберраций в группе детей ликвидаторов по сравнению с возрастным контролем [11, 33]. Аналогичные данные получены И.И. Сусковым и соавт. [34, 35], причем наиболее выраженные изменения были характерны для детей с врожденными пороками ЦНС. В доступной нам литературе имеется только одна публикация, касающаяся частоты
генных соматических мутаций у детей ликвидаторов [36]. В работе исследована частота мутаций по локу-су Т-клеточного рецептора, и выявлено увеличение этого показателя не только у ликвидаторов аварии на ЧАЭС, но и у их детей.
Таким образом, существование феномена радиа-ционно-индуцированной генетической нестабильности при радиационном воздействии подтверждено разными исследователями в отношении разнообразных биологических систем как in vitro, так и in vivo, и в настоящее время уже не подвергается сомнению. Можно считать доказанным существование генетической нестабильности, возникающей под действием радиации на организм животных (мышей как наиболее изученной биологической системы). В отношении организма человека данные противоречивы или явно недостаточны (как в случае с генными соматическими мутациями).
характеристика групп обследованных и методы исследования
Основные группы исследования включали 211 ликвидаторов аварии на ЧАЭС и 45 детей ликвидаторов, вызванных для диспансерного обследования в Детский научно-практический центр противорадиационной защиты или госпитализированных в отдел лазерной и фотодинамической терапии МРНЦ РАМН для обследования и/или лечения.
Группа контроля состояла из 319 лиц, не подвергавшихся зарегистрированным генотоксическим воздействиям в связи с проживанием на загрязненной территории и профессиональной деятельностью. Данные о частоте TCR-мутантных клеток у контрольных лиц были использованы для расчета возрастной нормы исследуемого показателя. Группа возрастного контроля (n=132) была сформирована из общей группы 319 необлученных лиц. Контрольная группа детей включала 52 ребенка сходного возраста.
На всех обследованных (детей и взрослых) были заполнены направления в лабораторию пострадиационного восстановления МРНЦ РАМН. Кроме того, на детей были оформлены «Карты диспансеризации», разработанные в Детском научно-практическом центре противорадиационной защиты и включающие несколько блоков — паспортную часть, данные перинатального анамнеза, семейного анамнеза с указанием особенностей воздействия ионизирующего излучения на родителей детей, данные анамнеза заболеваний и результаты консультаций и обследований. После проведения амбулаторного обследования по показаниям дети, нуждавшиеся по состоянию здоровья в углубленном обследовании, госпитализировались в клинику реабилитации радиационного риска Детского научно-практического центра противорадиационной защиты.
Проведен поиск и верификация необходимой дозиметрической информации о ликвидаторах аварии на ЧАЭС, собранной в Российском государственном медико-дозиметрическом регистре (РГМДР) на основании Приказа МЗ РФ № 281 от 26.11.93 г. «О порядке ведения РГМДР». Средняя доза (±SE) в общей группе ликвидаторов составила 10,3±0,8 рад. Средняя доза в группе ликвидаторов 1986 г. составила 12,1±1,3 рад, 1987 г. — 6,2±0,7 рад, 1988—1990 гг. — 6,9±2,6 рад.
Метод идентификации клеток с генными мутациями по TCR-локусу проводился в соответствии с разработанной японскими авторами методикой [25, 26]. Известно, что на поверхности Т-лимфо-цитов экспрессирован комплекс Т-клеточного рецептора (TCR) и CD3-антигена. Так как TCR-гены функционально гемизиготны, на поверхности лимфоцитов представлены продукты только одного ал-леля. Мутация в функционирующем аллеле приводит к тому, что CD3 комплекс не экспрессируется на поверхности Т-лимфоцита. Такие мутанты определяются c помощью проточной цитометрии как CD3-негативные среди CD4-позитивных Т-клеток. Для идентификации мутантных клеток используют мо-ноклональные антитела к CD3- и CD4-антигенам, меченные разными флуорохромами. С помощью специальной компьютерной программы подсчитывают частоту мутантных клеток.
Компьютерную обработку проводили с использованием программы CellQuestPro («BDIS», США). На графике распределения клеток по интенсивности светорассеяния выбирали регион неповрежденных лимфоцитов и в дальнейшем оценивали флюоресценцию клеток, меченных флюоресцеинизотиоционатом и фикоэритрином, только в этом регионе. На графике распределения клеток по интенсивности флюоресценции определяли количество клеток с иммунофе-нотипом CD3+CD4+, характерным для Т-хелперных лимфоцитов, и с вариантным иммунофенотипом CD3—CD4+, который соответствует клеткам с мутациями по TCR-локусу. Частоту мутантных клеток определяли как отношение числа клеток с фенотипом CD3—CD4+ к числу CD4+ клеток. В каждом образце анализировали 2-105 лимфоцитов.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc., США) и Origin 6.0 ("Microcal Software, Inc.", США) для персонального компьютера. В случае нормального распределения вариант полученные выборки характеризовали по среднему значению, стандартному отклонению (SD) или стандартной ошибке (SE), которые вычисляли с помощью указанных программ. В случае не нормального распределения вариант полученные выборки характеризовали по медиане, нижнему и верхнему квартилям. Достоверность различий двух выборок оценивали по критерию Манна— Уитни. Различия считали статистически значимыми
при р<0,05. Сравнение доли лиц с повышенными частотами мутантных клеток в двух группах проводили с помощью критериев Фишера или х2. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
результаты и обсуждение
Известно, что частота соматических клеток с мутациями увеличивается с возрастом даже в случае отсутствия генотоксических воздействий, связанных с неблагоприятными условиями проживания (включая загрязнение радионуклидами), профессиональным контактом с вредными воздействиями различной природы (химической, физической, в том числе радиационной, и т.д.). Среди ликвидаторов аварии на ЧАЭС, зарегистрированных к базе данных РГМДР, повышенная частота мутантных клеток обнаружена у 12,7±3,0%.
Частота TCR-мутантных клеток в группах ликвидаторов с разными дозами облучения
Проведен групповой анализ частоты TCR-мутан-тных лимфоцитов у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и контрольных лиц аналогичного возраста. Полученные результаты представлены на рис. 1. Распределение частоты мутантных клеток в контрольной группе носило нормальный характер, в группе ликвидаторов — было лог-нормальным из-за наличия лиц с высокой частотой мутаций. Расчеты по критерию Манна— Уитни свидетельствуют о статистически значимом увеличении частоты TCR-мутантных клеток в группе ликвидаторов по сравнению с контролем (р=0,002).
При сопоставлении частоты TCR-мутантных клеток с дозой облучения, верифицированной по базе
Контрольные доноры
20
1 15
о
е 10
U
§ 5
0
п
30-_ 25-
й 20-
0
£ 15-
о>
g 10^
1 б-0-
10 12 14 16 18 20 Ликвидаторы аварии на ЧАЭС
Ей
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Частота ТСК мутантных клеток, • 10ч
Рис. 1. Распределение частоты ТСЯ-мутантных клеток в группе контрольных лиц и ликвидаторов аварии на ЧАЭС.
данных РГМДР, корреляции сравниваемых показателей не установлено.
Дозиметрическая информация о ликвидаторах Чернобыльской аварии страдает неточностью, что мо-
Таблица 1. Сопоставление частоты ТСЖ-мутантных клеток с периодом работы в зоне аварии на чАЭС
Период работы Число ликвидаторов Медиана частоты му- Нижний — верхний % ликвидаторов с повышенной
тантных клеток, •Ю-4 квартили, •Ю-4 частотой мутантных клеток
1986 г. 101 4,0 3,0—5,7 12,6
1987—1990 гг._74_40_2,7—5,0_13,3_
Таблица 2. Средние накопленные дозы в различных возрастных группах ликвидаторов
Диапазон возраста ликвидаторов в момент облучения Доза радиационного воздействия (среднее ± SD), рад (Р)
19—30 лет 17,3±9,1
31—40 лет 7,4+6,7
41—50 лет 6,8±10,2
51—60 лет 3,2+4,5
жет являться одной из причин отсутствия корреляции дозы и частоты мутантных клеток как показателя генетической нестабильности лимфоцитов. С другой стороны, установленное в настоящей работе отсутствие указанной корреляции, возможно, отражает общую закономерность, характеризующую радиационно-ин-дуцированную генетическую нестабильность. Тем не менее из-за неточности индивидуальной дозиметрической информации проведен дополнительный статистический анализ частоты мутантных клеток у ликвидаторов, работавших в зоне аварии в разные годы. Такой анализ представлял интерес по двум причинам: 1) дозы, накопленные ликвидаторами в 1986 г. были выше, чем в последующие годы; 2) при подобном анализе расширяется группа исследования со 123 человек с верифицированными дозами до 175 человек с известным временем работы в зоне аварии. Результаты анализа частоты мутантных клеток у лиц, принимавших участие в ликвидации аварии в разные годы, представлены в табл. 1. Как следует, различий в частоте мутан-тных клеток у ликвидаторов 1986 г и последующих лет не установлено. Также не различалась доля лиц с повы-
I 4~ 1 2~
« --------
19-30 31-40 41-50 51-60
Возраст ликвидаторов, годы
Рис. 2. Зависимость доли ликвидаторов с повышенной частотой мутантных клеток от возраста при работе в зоне
чаэс.
шенной частотой мутантных клеток среди ликвидаторов, работавших в зоне аварии в 1986 г., по сравнению с работавшими в 1987—1990 гг.
Влияние возраста ликвидаторов (в период участия в спасательных работах в Чернобыле) на долю лиц с повышенной частотой мутантных клеток показано на рис. 2. Наблюдалась обратная корреляция исследуемого показателя соматического мутагенеза с возрастом (Л=0,9; р=0,01; и=166). Полученные данные свидетельствуют о том, что повышенная частота мутантных клеток встречается чаще среди лиц, подвергшихся радиационному воздействию в молодом возрасте.
Однако, как показано в табл. 2, средняя накопленная доза в подгруппах молодых ликвидаторов на момент облучения была выше, чем в старших возрастных подгруппах. Так, средние дозы облучения (±SE) в возрастных группах 19—40 лет и 41—60 лет статистически значимо различались, составляя 11,6±1,0 и 6,2±1,7 рад (Р) соответственно (р=0,006). Таким образом, повышение частоты мутантных клеток у ряда ликвидаторов не связано с различиями в накопленной дозе во время работы в радиационно-опасной зоне, но зависит от возраста в момент облучения.
частота TCR-мутантных клеток у детей ликвидаторов
Проведен анализ частоты TCR-мутантных клеток у 45 детей ликвидаторов аварии на ЧАЭС и 52 контрольных лиц сходного возраста. Частота мутантных клеток у детей ликвидаторов не отличалась от таковой в контрольной группе (табл. 3). В группе детей ликвидаторов частота мутантных клеток у мальчиков была несколько выше, чем у девочек, однако различия не достигали статистической значимости (р=0,25).
При одновременном анализе установлено, что частота мутантных клеток у родителей — ликвидаторов аварии на ЧАЭС была существенно выше, чем у детей, и составляла в среднем 3,5-10-4 (р=0,008). Частота мутантных клеток у детей ликвидаторов не коррелировала с таковой у родителей (рис 3).
Также не установлено корреляции частоты TCR-
Таблица 3. Частота ТСЯ-мутантных клеток в группе детей ликвидаторов и контрольной группе
Группа Число лиц Средний возраст (диапазон), годы Медиана частоты TCR-мутан-тных клеток (квартили), •Ю-4 Количество лиц с повышенной частотой мутантных клеток, %
Дети ликвидаторов
Все 45 13,5 (4—21) 2,2 (1,6—2,8) 4
мальчики 21 13,5 (8—21) 2,6 (2,0—3,8) 4
девочки 24 13,5 (4—19) 2,1 (1,6—2,5) 0
Дети контрольной группы 52 15,8 (14—26) 2,5 (1,9—3,3) 0
Г =-0,0048 р = 0,9807
S
х
■О
f X
I s 2
. О "
о о
Частота мутантных клеток у родителей, • 10"4
Рис. 3. Сопоставление частоты ТСЯ-мутантных клеток у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и их детей.
5,5
5,0
f
О 4,5
>S Ï 4,0
% 3,5
s 3,0
h
X 2 2,5
Ê 2,0
1,5
Ь 1,0
J
0,5
0,0
г = -0,1503, Р = 0,4544
Доза облучения родиталей, рад
Рис. 4. Сопоставление частоты TCR-мутантных клеток у детей ликвидаторов аварии на ЧАЭС и дозы радиационного воздействия на организм родителей.
мутантных клеток у детей и дозы радиационного воздействия на родителей (рис. 4). При этом следует отметить, что в обследованной нами группе только у одного из родителей доза облучения превышала 30 рад, начиная с которой регистрируется эффект увеличения частоты соматических мутаций у потомков сотрудников атомной промышленности [17].
Таким образом, в обследованной нами группе детей ликвидаторов не обнаружено повышения частоты генных мутаций по сравнению с возрастным контр-
олем. Поэтому размер группы повышенного канцерогенного риска (по критерию частоты TCR-мутантных клеток) в этой когорте не превышает контрольные величины. Полученные нами результаты позволяют точнее установить границы дальнейших исследований генного соматического мутагенеза у детей ликвидаторов. В частности, невыясненным остался вопрос об уровне соматического мутагенеза у потомков, зачатие которых произошло менее чем через 2 года после облучения родителя, а также у потомков, родители которых подверглись облучению в дозах более 20—30 рад. В обследованной нами группе детей ликвидаторов только один ребенок был зачат менее чем через 2 года после облучения родителя. Частота мутантных клеток у этого ребенка превышала возрастную норму и была самой высокой в обследованной группе, что свидетельствует в пользу высказанного предположения об увеличении количества генных соматических мутаций в группе детей, зачатие которых произошло в близкие сроки после облучения родителей.
заключение
В настоящее время не вызывает сомнений существование радиационно-индуцированной нестабильности генома клеток/организмов у части потомков ликвидаторов, подвергшихся действию ионизирующих излучений в различных дозах, включая диапазон малых доз (до 200 мЗв). Значительно хуже изучены закономерности возникновения генетической нестабильности у облученных животных и человека, еще хуже — у их потомков. Тем не менее имеющиеся данные о частоте мутаций в лимфоцитах ликвидаторов аварии на ЧАЭС, подавляющее большинство которых подверглось радиационному воздействию в малых дозах, подтверждают возможность проявления этого феномена в отдаленные сроки после облучения. Данные о генетической нестабильности соматических клеток детей ликвидаторов достаточно противоречивы и должны быть расширены.
Разработка новых подходов к формированию группы высокого канцерогенного риска среди лиц, облученных в малых дозах (а это не только ликвидаторы аварии на ЧАЭС, но и многочисленные контингенты сотрудников атомной промышленности, жителей за-
грязненных радионуклидами территорий), а также их потомков требует, прежде всего, ответа на вопрос, влияет ли радиационно-индуцированная генетическая нестабильность соматических клеток на вероятность злокачественной трансформации клеток и развитие онкозаболеваний. Имеющиеся в настоящее время методы выявления генных соматических мутаций позволяют рутинно использовать определение TCR-мута-ций для массовых скрининговых обследований.
Проведенное цитогенетическое обследование детей различных когорт наблюдения (в семейном аспекте) с анализом хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови и исследованием кариотипа отражает наличие геномной нестабильности у них в виде увеличения количества сложных и стабильных хромосомных аберраций в отличие от детей группы сравнения [37, 38]. Одновременно имеет место снижение элиминационной способности хромосомных поломок, проявляющееся в снижении индекса репарационной активности ДНК как спонтанной, так и гамма-инду-цированной. Регистрация ослабления репаративных процессов свидетельствует о сниженном защитном потенциале и, следовательно, о повышенной индивидуальной чувствительности к воздействию определенных экопатогенных факторов.
Углубленное патогенетическое изучение данной проблемы невозможно без использования комплексных цитогенетических и молекулярно-генетических
методов обследования и наблюдения детей и их семей. В данном вопросе имеет значение долгосрочное наблюдение за формированием соматических мутаций, которые приводят к геномной нестабильности с последующим формированием хронической патологии, в том числе радиационно-индуцированной.
В обследованной группе детей ликвидаторов не обнаружено повышения частоты генных мутаций (по критерию частоты TCR-мутантных клеток) по сравнению с возрастным контролем. Однако невыясненным остался вопрос об уровне соматического мутагенеза у потомков, зачатие которых произошло менее чем через 2 года после облучения родителя, а также у потомков, родители которых подверглись облучению в дозах более 20—30 рад. Это предположение требует проверки в дальнейших исследованиях.
Современные достижения в области стандартизации методов диагностики, новые знания в вопросах этиологии и патогенеза, четкое определение их понятий и критериев у детей, подвергшихся воздействию радиационного фактора, на основании длительного периода наблюдения за ними определяют новизну и ценность данных методов. В настоящее время меняющаяся экономическая и социальная ситуация диктует необходимость дальнейшего совершенствования медицинской помощи детям, пострадавшим в результате действия ионизирующей радиации.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мазурик В.К., Михайлов В.Ф. Радиационно-индуцируе-мая нестабильность генома: феномен, молекулярные механизмы, патогенетическое значение // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Том 41. № 3. С. 272—289.
2. Пелевина И.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В. и др. Нестабильность генома после воздействия радиации в малых дозах (в 10-километровой зоне аварии на ЧАЭС и в лабораторных условиях) // Радиационная биология. Радиоэкология. 1996. Т. 36, № 4. С. 546—560.
3. Wright E.G. Microenviromental and genetic factors in haemopoietic radiation responses // Int. J. Radiat. Biol. 2007. Vol. 83, № 12. P. 813—818.
4. Trott K.R., Jamali M, Manti L, Teibe A. Manifestation and mechanisms of radiation-induced genome instability in V79 Chinese hamster cells // Int. J. Radiat. Biol. 1998. Vol. 74, № 6. P. 787—791.
5. Бычковская И.Б., Степанов Р.П., Федорцева Р.Ф. Особые долговременные изменения клеток при воздействии радиации в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 1. С. 20—35.
6. Воробьева М.В. Исследование радиочувствительности хромосом детей облученных родителей // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Ст-Петербург, 1995. 25 с.
7. Jamali M, Trott K.P. Persistent increase in the rates of apoptosis and dicentric chromosomes in surviving V79 cells after X-irradiation // Int. J. Radiat. Biol. 1996. Vol. 70, № 6. P. 705—709.
8. Ponnaiya B, Cornforth M.N., Ulrich R.L. Induction of chromosomal instability in human mammary cells by neutrons and gamma-rays // Radiat. Res. 1997. Vol. 147. P. 288—294.
9. Алферович А.А., ГотлибВ.Я., Конрадов А.А. и др. Воздействие малых доз ионизирующего излучения на клетки млекопитающих // Известия Академии наук СССР. Серия биологическая. 1992. № 1. С. 127—130.
10. Шевченко В.А., Снигирева Г.П. Значимость цитогенетиче-ского обследования для оценки последствий Чернобыльской катастрофы // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. Т. 46, № 2. С. 133—139.
11. Воробцова И.Е. Семенов А.В. Комплексная цитогенетиче-ская характеристика лиц, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. Т. 46, № 2. С. 140—151.
12. Саенко А.С., Замулаева И.А. Результаты и перспективы использования методов определения частоты мутан-тных клеток по локусам гликофорина А и Т-клеточно-го рецептора для оценки генотоксического действия ионизирующих излучений в отдаленные сроки после воздействия// Радиационная биология. Радиоэкология. 2000. Т. 40, № 5. C. 549—553.
13. Thomas C.B., Nelson D.O., Plechanov P. Elevated frequencies of hypoxanthine phosphoribosyltransferase lymphocyte mutants are detected in Russian liquidators 6 to 10 years after exposure to radiation from the Chernobyl nuclear power plant accident // Mutat. Res. 1999. Vol. 439. P. 105—119.
14. Dubrova Y.E. Radiation-induced transgenerational instability // Oncogene. 2003. № 22. P. 7087—7093.
15. Nomura T.Transgenerational effects of radiation and chemicals in mice and humans // J Radiat Res. 2006. Vol. 47. Suppl. P. B83—B97.
16. Фоменко Л.А, Ломаева М.Г, Безлепкин В.Г, Газиев А.И.
Геномная нестабильность, выявляемая микроядерным тестом, у потомства F1- поколения мышей, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 2006. Т. 46, № 4. С. 431—435.
17. Заичкина С.И., Розанова О.М., Ахмадиава А.Х. и др. Изучение действия низкоинтенсивного излучения, моделирующего радиационные нагрузки в условиях авиационных полетов в атмосфере на высоте 10 км, на мышах in vivo // Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки—медицине». М., 2007. С.150—151.
18. Ryabokon N.I., Goncharova R.I. Transgenerational accumulation of radiation damage in small mammals chronically exposed to Chernobyl fallout // Radiat. Environ. Biophys. 2006. Vol. 45. P. 167—177.
19. Степанова Е.И., Мишарина Ж.А., Вдовенко В.Ю. Отдаленные цитогенетические эффекты у детей, облученных внутриутробно в результате аварии на Чернобыльской АЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. 2002. Т. 42, № 6. С. 700—703.
20. Севанькаев А.В., Михайлова Г.Ф., Потетня О.И. и др. Результаты динамического цитогенетического наблюдения за детьми и подростками, проживающими на радиоактивно-загрязненных территориях после Чернобыльской аварии // Радиационная биология. Радиоэкология. 2005. Т. 45, № 1. С. 5—16.
21. Замулаева И.А., Орлова Н.В., Смирнова С.Г. и др. Закономерности соматического мутагенеза у ликвидаторов аварии на ЧАЭС в отдаленные сроки после радиационного воздействия // Радиация и риск. 2006. Т. 15, № 1—2. С. 68—76.
22. Dubrova Y.E., Nesterov V.N., Krouchinsky N.G. et al. Human minisatellite mutation rate after the Chernobyl accident // Nature. 1996. Vol. 380, № 6576. P. 683—686.
23. Ильинских Н.Н., Ильинских Е.Н., Иванчук И.И., Рогозин Е.А. Использование микроядерного теста для оценки состояния цитогенетического аппарата у людей, проживающих в зоне влияния Сибирского химического комбината // Радиационная биология. Радиоэкология. 1998. Т. 38, № 2. С. 164—170.
24. Безлепкин В.Г., Антипова В.Н., Васильева Г.В. и др. Исследования полиморфизма простых повторов и генных мутаций в ДНК крови потомков родителей-отцов, подвергшихся воздействию гамма-радиации // Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки-медицине». М., 2007. С.175—176.
25. Neel J.V., Schull W.J., Awa A.A et al. Implications of the Hiroshima-Nagasaki genetic studies for the estimation of the human "doubling dose" of radiation // Genome. 1989. Vol. 31, № 2. P. 853—859.
26. Neel J.V., Schull W.J., Awa A.A et al. The children of parents exposed to atomic bombs: estimates of the genetic doubling dose of radiation for humans // Am. J. Hum. Genet. 1990. Vol. 46, № 6. P. 1053—1072.
27. Сусков И.И., Кузьмина Н.С. Полигеномная реализация
мутагенных эффектов в организме людей, подвергающихся воздействию радиации в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология. 2003. Т. 43, № 5. С. 157—152.
28. Шевченко В.А. Эволюция представлений о генетической опасности ионизирующих излучений для человека // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 615—626.
29. Furitsu K., Ryo H, Yeliseeva K.G. et al. Microsatellite mutations show no increases in the children of the Chernobyl liquidators // Mutat. Res. 2005. Vol. 581, № 1—2. P. 69—82.
30. Livshits L.A., Malyarchuk S.G., Kravchenko S.A. et al. Children of Chernobyl cleanup workers do not show elevated rates of mutations in minisatellite alleles // Radiat. Res. 2001. Vol. 155, № 1. P.74—80.
31. Slebos R.J., Little R.E., Umbach D.M. et al. Mini- and microsatellite mutations in children from Chernobyl accident cleanup workers // Mutat. Res. 2004. Vol. 559, № 1—2. P.143—151.
32. Kiuru A., Auvinen A., Luokkamaki. M. et al. Hereditary minisatellite mutations among the offspring of Estonian Chernobyl cleanup workers // Radiat. Res. 2003. Vol. 159, № 5. P. 651—655.
33. Bigbee W.L., Jensen R.H., Veidebaum Tet al. Biodosimetry of Chernobyl cleanup workers from Estonia and Latvia using the glycophorin A in vivo somatic cell mutation assay // Radiat. Res. 1997. Vol. 147. P. 215—224.
34. Сусков И.И., Кузьмина Н.С. Проблема индуцированной геномной нестабильности в детском организме в условиях длительного действия малых доз радиации // Радиационная биология. Радиоэкология. 2001. Т. 41, № 5. С. 606—614.
35. Сусков И.И., Агаджанян А.В., Балева Л.С, Сипягина А.Е. Неспецифический характер трансгенерационного феномена геномной нестабильности у потомков облученных родителей // Вестн. Рос. военно-мед. академии. 2008. В. 3 (23). С.187—187.
36. Рубанович А.В., Агаджанян А.В., Акаева Э.А. и др. Комплексное изучение трансгенерационных геномно-им-мунных нарушений в соматических клетках детей облученных родителей. Связь радиочувствительности с генотипическим статусом организма // Тезисы докладов конференции «Фундаментальные науки-медицине». М., 2007. С. 155—156.
37. Сипягина А.Е., Балева Л.С, Кузьмина Т.Б. и др. Особенности формирования врожденных пороков развития у детей ликвидаторов радиационной аварии // Рос. вестн. перинатол. и педиат. 2005. № 2. С. 53—56.
38. Хандогина Е.К., Агейкин В.А., Зверева С.В. Цитогенетиче-ское обследование различных групп детей, проживающих в районах Брянской области, загрязненных в результате Чернобыльской аварии // Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. Т. 35, № 5. С. 618—625.
Поступила 26.02.10
