CC BY
58
с ОПН достигало 140 пг/мл. Вероятной причиной повышенного содержания в крови этого провоспалительного цитокина, является его гиперпродукция резидентными макрофагами, в частности, Купфферовскими клетками печени, которая, как установлено ранее, коррелирует с синтезом белков острой фазы [3]. Кроме того, в результате проведенных исследований было установлено, что онкобольные с ХПН характеризовались повышенным уровнем ИЛ-8 в сыворотке крови. Аналогичные результаты приводятся и другими исследователями [4,14]. Повышение ИЛ-8 указанными авторами рассматривалось как нарушение ’Й1/’Ш2 баланса, у иммунокомпро-метированных онкологических больных с ХПН.
Вышеперечисленные факты, а также транслокация бактерий и их токсинов из кишечника на фоне нарушений функционирования желудочно-кишечного тракта, вызванных ХПН [9], могут являться причиной установленной нами тенденции повышенной концентрации ЛПС в крови больных. При наличии ОПН были обнаружены еще более высокие уровни ЛПС в крови, в то время как у здоровых доноров в крови эндотоксин не детектировался. Известно, что при синдроме системной воспалительной реакции (ССВР) эндотоксемия может усиливаться не только за счет поступления бак-
терий и их токсинов из первичного очага воспаления, но и за счет усиления трансинтестинальной транслокации. Экспериментально была показана возможность бактериальной транслокации из кишечника при шоке и стрессе [2,6]. Если рассматривать ОПН как явление, сопутствующее манифестации ССВР, то можно ожидать, что поступление бактерий или их токсинов из кишечника вполне может иметь место при данной патологии.
Таким образом, результаты проведенных нами исследований позволяют сделать вывод о том, что развитие почечной недостаточности у онкологических больных в послеоперационном периоде сопровождается увеличением содержания в сыворотке ЛПС, а отличительной характеристикой цитокинового профиля больных с ОПН является повышение (около 100 пг/мл) уровня концентрации ИЛ-6, в то время как наличие ХПН сопровождается повышением в сыворотке крови ИЛ-8. Представленные данные позволяют заключить, что из исследованных показателей в качестве маркеров ОПН могут рассматриваться только ИЛ-6 и ЛПС. Детектируемое повышение ЛПС и ИЛ-8 у онкологических больных с ХПН может быть следствием обострения вялотекущих инфекций на фоне развившейся иммуносупрессии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Громова Е.Г., Тугуз А.Р., Киселевский М.В., Матвеев В.Б. Кинетика цитокинов в сыворотке крови, моче и отделяемом из дренажей в периоперационном периоде у больных раком почки // Иммунология. - М., 2002. - Т. 23. №4. - С.232-235.
2. Дугин С.Ф., Анищенко Н.В., Агаджанян З.С. и др. Стрессогенная потенциация трансинтестинального антигенного транспорта как физиологическая основа развития системных и локальных воспалительных процессов // Кардиологический вестник. - М., 2006. - №2. - С.21-24.
3. Маевская М.В., Буеверов А.О. Цитокины в патогенезе алкогольного гепатита и возможности терапии // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - М., 2009. - №2. - С.14-19.
4. Abou-Shousha S. A., Youssef A.I. Interleukin-2 regulatory effect on P-selectin and interleukin-8 production in patients with chronic renal failure // Egypt. J. Immunol. - 2006. - Vol. 13. №
1. - P. 11-18.
5. An S. De Vriese. Prevention and Treatment of Acute Renal Failure in Sepsis // J. Am. Soc. Nephrol. - 2003. - Vol.14. - P.792-805.
6. Ando T., Brown R.F., Berg R.D., Dunn A.J. Bacterial translocation can increase plasma corticosterone and brain catecholamine and indoleamine metabolism // Am. J. Physiol. -2000. - Vol. 279. №6. - R2164-R2172.
7. Arjmandi-Rafsanjani K., Hooman N., Vosoug P Renal function in late survivors of Iranian children with cancer: Single centre experience // Ind. J. Cancer - 2008. - Vol. 45. №4. - P.154-157.
8. Asmis R., Stevens J., Begley J. G., et al. The isoflavone genistein inhibits LPS-stimulated TNFalpha, but not IL-6 expression in monocytes from hemodialysis patients and healthy subjects // Clin. Nephrol. - 2006. - Vol. 65. №4. - P.267-275.
9. Brunini T. M., Moss M. B., Siqueira M. A., et al. Nitric oxide, malnutrition and chronic renal failure // Cardiovasc. Hematol. Agents Med. Chem. - 2007. - Vol. 5. №2. - P.155-161.
10. Dogan E., Izmirli M., Ceylan K., et al. Incidence of renal insufficiency in cancer patients // Adv. Therapy. - 2005. - Vol. 22. №4. - P.357-362.
11. Khan R.Z., Badr K.F. Endotoxin and renal function: perspectives to the understanding of septic acute renal failure and toxic shock // Nephrol. Dial. Transplant. - 1999. - Vol. 14.- P.814-818.
12. Malaponte G., Bevelacqua V., Fatuzzo P., et al. IL-1beta, TNF-alpha and IL-6 release from monocytes in haemodialysis patients in relation to dialytic age // Nephrol. Dial. Transplant. -2002. - Vol. 17. №11. - P.1964-1970.
13. Meduri G.U. New rationale for glucocorticoid treatment in septic shock // J. Chemotec. - 1999. - Vol. 11. №6. - P.541-550.
14. Nairn J., Hodge G., Henning P Leukocyte subsets: clinical implications for children with chronic renal failure // Cell Mol. Immunol. - 2006. - Vol. 3. №2. - P.151-154.
15. Schmidt C., Hocherl K., Bucher M. Cytokine-mediated regulation of urea transporters during experimental endotoxemia // Am. J. Physiol. Renal Physiol. - 2007. - Vol. 292. №5. -P.F1479-F1489.
16. Tanaka T., Nangaku M. Pathogenesis of tubular interstitial nephritis // Contrib. Nephrol. - 2011. - Vol. 169. - P.297-310.
Информация об авторах: Анисимова Наталья Юрьевна - с.н.с., к.б.н. 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, e-mail: [email protected]; Громова Елена Георгиевна - заведующая, д.м.н, e-mail: [email protected]; Кузнецова Людмила Сергеевна - врач; Андрейчиков Антон Александрович - стажер; Андрейчиков Александр Владимирович - профессор, д.м.н.; Киселевский Михаил Валентинович - заведующий лабораторией, д.м.н.,
профессор, e-mail: [email protected].
© ИСАЕВА Е.Н., ИСАЕВ Ю.С., СЕМИНСКИЙ И.Ж. - 2011 УДК: 340.6:577.21.08
ЗНАЧЕНИЕ ДНК МАРКЕРОВ ПРИ СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ РОДСТВА У ЭТНИЧЕСКИХ БУРЯТ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ
Елена Николаевна Исаева, Юрий Сергеевич Исаев, Игорь Жанович Семинский (Иркутский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.В. Малов, кафедра судебной медицины с основами правоведения, зав. - д.м.н., проф. Ю.С. Исаев, кафедра биологии с курсом медицинской
генетики, зав. - д.б.н., проф. А.А. Майборода)
Резюме. В настоящей работе на примере из практики проведения судебно-медицинской экспертизы по факту установления биологического родства убедительно показано значение распределения частот аллелей девяти ауто-сомных 8ТБ.-локусов (Б13А01, ЪрЪ, Б138317, Б78820, Б168539, ТН01, Б18851, БОА, БЕ8БР8) с учетом этнической принадлежности обследуемых.
Ключевые слова: STR-локусы, генетическое разнообразие, популяционные исследования населения России (Буряты байкальского региона), ДНК-идентификация.
SIGNIFICANCE OF DNA MARKERS IN FORENSIC MEDICAL EXAMINATION OF RELATIONSHIP IN ETHNIC BURYATS OF BAIKAL REGION OF EAST SIBERIA
E. Isaeva, Y. Isaev, I. Seminsky (Irkutsk State Medical University)
Summary. In this paper, an example from the practice of forensic medical expertise on the definition of a biological relationship convincingly demonstrated the value of the distribution of allele frequencies of nine autosomal STR-loci (F13A01, LPL, D13S317, D7S820, D16S539, TH01, D18S51, FGA, FESFPS), taking into account the ethnic appliance of the people under survey.
Key words: autosom microsatellite, genetic diversity, population studies in Russia (Buryat of Baikal Region), DNA-identification.
Молекулярно-генетические технологии, используемые при судебно-медицинских экспертных исследованиях, позволяют проводить количественную оценку доказательственного значения совпадения или несовпадения признаков при идентификации личности, а так же при экспертизе установления родства. Принципиальным вопросом при проведении такого рода экспертных исследований является степень их доказательности.
Уровень доказательности экспертного вывода представляется ключевым моментом, от которого зависит практическая значимость выполненной экспертизы. В арсенале методов современных судебно-биологических исследований молекулярно-генетический анализ является единственным методическим подходом, который позволяет проводить количественную оценку доказательственного значения совпадения или несовпадения признаков при идентификационных исследованиях, а также в экспертизе установления родства.
Вероятность точной идентификации - это тот цифровой показатель количественной оценки, который и представляется в суде. Его величина зависит от корректности расчетной части экспертизы и определяется используемыми эталонными (референтными) аллельными частотами. Практически для всех локусов, используемых в экспертной практике зарубежных стран, продемонстрирована высокая межрасовая вариабельность уровня и характера полиморфизма. Для отдельных популяций характерны различия как в числе, так и в частотном распределении аллелей по отдельным ло-кусам. Это связано в первую очередь с историческими, культурными и социальными факторами, которые обусловливают формирование популяций и соответственно, генофонда каждого конкретного региона.
Несмотря на прогресс в создании баз данных о распределении аллелей и генотипов 8ТЯ-локусов в региональных группах населения мира и в отдельных этнических группах, сведений о полиморфизме аутосомных микросателлитных локусов в этнически дифференцированном населении России пока еще очень мало.
На территории Российской Федерации проживают более 160 различных народностей и национальностей. Знание конкретных частот встречаемости ДНК-маркеров различного типа у населения местной этнической принадлежности является необходимым условием корректного применения методов ДНК-анализа при идентификации личности и биологических следов. Данное требование фигурирует в числе необходимых условий, оговоренных приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Минздравсоцразвития России) от 12 мая 2010 г. N 346н “Об утверждении Порядка организации и производства судебно-медицинских экспертиз в государственных судебно-экспертных учреждениях Российской Федерации”. Согласно указанному приказу в Российской Федерации при экспертизе спорного происхождения детей, в случае неисключения родительства вероятность отцовства/материнства, рассчитанная как
байессова постериорная вероятность, должна составлять не менее 99,90%.
В настоящее время территориальные бюро судебномедицинской экспертизы используют частоты, рекомендованные фирмой-производителем отечественных реагентов для идентификации личности НПФ «АТГ-Биотех» г. Москва (регистрационное удостоверение № ФС 012а2004/1631-05). В основу этих данных положены частоты встречаемости аллелей среди кавказоидов Америки (Butler J., Schoske., Valljne P., Redman J., Kline M., 2003). Однако использование этих данных в качестве стандартных на все популяции России нельзя считать корректным. Использование данных по другим популяциям с помощью специальных коэффициентов перерасчета (L.A. Zhivotovsky, A. Boris, B.A. Malyarchuk, M.V. Derenko, M. Wozniak, T. Grzybowski, 2008) снижает надежность идентификации.
В настоящей работе на примере конкретного экспертного случая оспариваемого отцовства обсуждены вопросы, которые иллюстрируют необходимость проведения масштабных популяционных исследований этнически дифференцированного населения Российской Федерации.
Материалы и методы
Объектами экспертизы явились образцы крови предполагаемого отца, матери и ребенка. Согласно опроса проходящих по делу, мать и предполагаемый отец постоянно проживали в Усть-Ордынском бурятском автономном округе Иркутской области, не являлись родственниками и относились к этническим бурятам предположительно до восьмого-десятого поколения.
ДНК из образцов жидкой крови выделяли по стандартной методике фенол-хлороформным методом [3]. В реакционную смесь для полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 25 мкл вносили 20 нг геномной ДНК. Параллельно осуществляли постановку образцов «отрицательного контроля амплификации» и «положительного контроля амплификации» фирмы-изготовителя. ПЦР проводили на термоциклере «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) с использованием наборов реагентов для амплификации ДНК, разработанных НпФ «АТГ-Биотех» г. Москва согласно протокола разработчика.
Полиморфные по длине амплифицированные фрагменты ДНК анализировали электрофоретически в денатурирующих полиакриламидных гелях (8% ПААГ). После завершения электрофореза результаты документировали путем окрашивания гелей серебром [3] с последующим компьютерным сканированием фореграмм.
Индекс отцовства (Paternity Index, PI) и вероятность истинного отцовства (Probability of Paternity, PP) рассчитывали на основе байесовых алгоритмов, рекомендованных Минздравом РФ [1].
Результаты и обсуждение
В качестве иллюстрации на примере конкретной
экспертизы по факту установления отцовства приведены исходные данные результатов генотипирования
Таблица 1
В препаратах ДНК, выделенных из образцов крови проходящих по делу, установлены следующие генотипические аллельные комбинации:
№ п/п Объект Локус генотип предполагаемого отца генотип ребёнка генотип матери
1 Р13А01 3.2/6 6/6 5/6
2 1_Р1_ 10/12 10/10 10/12
3 Р13Б317 8/9 9/12 12/12
4 Р7Б820 8/14 8/11 11/12
5 Р16Б539 9/11 9/13 8/13
6 ТН01 6/7 7/9 9/9.3
7 Р18Б51 13/14 14/16 13/16
8 РвА 22/24 21/24 21/25
9 РББРРБ 10/13 10/13 10/12
предполагаемого отца, матери и ребенка (табл. 1).
В основе молекулярно-генетического подхода к анализу родства лежит сравнительное изучение аллельных
вариантов высокополиморфных локусов в геномах ребенка и его предполагаемых биологических родителей. При наличии совпадающих аллелей во всех исследованных одноименных локусах у ребенка и предполагаемого отца делается вывод о возможности получения ребенком наследственного материала именно от этого индивидуума. Это означает, что отцовство не исключается. Доказательственное значение совпадений признаков оценивают средствами теории вероятностей и математической статистики. Затем полученные оценки соотно-
сят с требуемыми стандартами доказательности.
По стандартным формулам были рассчитаны значения индекса и вероятности отцовства [1] с использованием значений аллельных частот указанных локусов, рекомендуемых для использования в инструкции к наборам НПФ «АТГ-Биотех» г. Москва (табл. 2) и установленных нами при проведении популяционных исследований этнических бурят (табл. 3).
На конкретном примере показано, что при использовании рекомендуемых аллельных частот (НПФ «АТГ-Биотех», Москва) вероятность отцовства составляет не менее 99,999660%, что является высоко доказательным, но не убедительным без учета этнической принадлежности тестируемых. При этом пороговая величина вероятности отцовства (99,90%) была достигнута при исследовании всего шести полиморфных локусов -Б168539, БШ317, БШ51, ЪРЪ, БОЛ, Б13Л01. При использовании этнических частот аллелей по девяти полиморфным локусам вероятность отцовства оказалась ниже приемлемого стандарта доказательности и составила всего 99,810987% и при дальнейшем исследовании вероятность исключения отцовства сохраняется.
Следовательно, при одинаковых генетических профилях, установленных в ходе экспертизы спорного происхождения ребенка, показатели вероятности отцов-
ства в различных популяциях отличаются и являются в конкретном случае завышенными при использовании частот, рекомендованных для вероятностных расчетов НПФ «АТГ-Биотех», Москва.
Полученные в данной экспертизе результаты наглядно иллюстрируют логическую необходимость изучения базовых оценочных характеристик полиморфных локусов генома человека основных этнических групп Российской Федерации с целью повышения эффективности экспертного применения индивидуализирующих систем.
Таблица 2
Расчет показателя вероятности отцовства на конкретном примере установления генетического родства с использованием рекомендуемых частот аллелей НПФ «АТГ-Биотех», Москва
Вариант I: Ребенок и мать имеют один общий аллель или они оба гомозиготны Вариант II: Ребенок и мать гетерозиготны и их генотипы одинаковы
Формула расчета статистической частоты отцовского аллеля в генотипе ребенка
0=Я(2-Я) 0=^^2)(2^1^2)
№ п/п Название локуса Аллель ребенка совпадающий с предполагаемым отцом № п/п Название локуса Аллель ребенка совпадающий с предполагаемым отцом Аллель ребенка, не совпадающий с предполагаемым отцом, либо второй аллель, совпадающий с предполагаемым отцом в случае, когда генотипы всех троих одинаковы РІ=1/Ппі=10п (индекс отцовства) РР=[1/(1 + Ппі= 10п)]100% (вероятность отцовства, %)
ЫТВ частота аллеля, q ЫТВ частота аллеля, q1 ЫТВ частота аллеля, q2
1 Р16Б539 9 0,113 1 294402 99,999660%
2 Р13Б317 9 0,075 2
3 Р18Б51 14 0,137 3
4 1_Р1_ 10 0,412 4
5 РвА 24 0,136 5
6 Р13А01 6 0,287 6
7 ТН01 7 0,19 7
8 РББРРБ 13 0,028 8
9 Р7Б820 8 0,151 9
Таблица 3
Расчет показателя вероятности отцовства на конкретном примере установления генетического родства с использованием частот установленных для этнических бурят
Формула расчета статистической частоты отцовского аллеля в генотипе ребенка
Q=q(2-q) Q=(q1+q2)(2-q1-q2)
№ п/п Название локуса Аллель ребенка совпадающий с предполагаемым отцом № п/п Название локуса Аллель ребенка совпадающий с предполагаемым отцом Аллель ребенка, не совпадающий с предполагаемым отцом, либо второй аллель, совпадающий с предполагаемым отцом в случае, когда генотипы всех троих одинаковы
NTR частота аллеля, q NTR частота аллеля, q1 NTR частота аллеля, q2
1 D16S539 9 0,2956 1 528 99,810987%
2 D13S317 9 0,1552 2
3 D18S51 14 0,2882 3
4 LPL 10 0,739 4
5 FGA 24 0,3079 5
6 F13A01 6 0,4631 6
7 TH01 7 0,2946 7
8 FESFPS 13 0,2027 8
9 D7S820 8 0,2389 9
ЛИТЕРАТУРА
1. Иванов П.Л. Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицирован-ных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установлении родства // Методические указания. - Минздрав РФ, Москва, 1999. -С.1-12.
2 Budowle B., Baechtel F.S. Modifications to improve the effectivness of restriction fragment length polymorphism typing // App.Theor. Electrjphoresis. - 1990. - Vol. 1. - P181-187.
3. Sambrook J., Fritsch E.E., Maniatis T.R. 1989. Molecular cloning. A Laboratori Manual. Cold spring Harbour, N.Y. Cold Spring Harbor Lad. Press.
Информация об авторах: 664003, Иркутск, ул. Красного Восстания, 1, Исаева Елена Николаевна -заведующая отделением; тел.8-(39-52)-33-35-16; Исаев Юрий Сергеевич - заведующий кафедрой, профессор, д.м.н.; Семинский Игорь Жанович - заведующий кафедрой, профессор, д.м.н.
© ТРУСОВА Ю.С., ШАПОВАЛОВ К.Г. - 2011.
УДК 616.381 - 002
СОСТОЯНИЕ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ У БОЛЬНЫХ С ПЕРИТОНИТОМ НА ФОНЕ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ
Юлия Сергеевна Трусова, Константин Геннадьевич Шаповалов (Читинская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.В. Говорин, кафедра анестезиологии и реаниматологии, зав. - д.м.н. К.Г. Шаповалов)
Резюме. Выполнена оценка состояния микроциркуляторного русла у 17 больных с перитонитом на фоне артериальной гипертензии в раннем послеоперационном периоде и у 15 пациентов с перитонитом без сопутствующей патологии. Методом ИФА определялись концентрация антигена ADAMTS-13 и его ингибитора, уровень TFPI. Установлено, что у пациентов с перитонитом на фоне артериальной гипертензии имеется реологический дисбаланс, проявляющийся изменениями показателей микроциркуляции и гемостаза. У больных с перитонитом на фоне артериальной гипертензии увеличивался показатель микроциркуляции в 1,2 раза, повышалась концентрация ADAMTS-13 в 1,4 раза, возрастал уровень TFPI в 2 раза. Таким образом, течение системного воспалительного процесса и артериальная гипертензия потенцировали отклонения функционального состояния клеток эндотелия.
Ключевые слова: микроциркуляция, гемостаз, дисфункция эндотелия.
THE CONDITION OF MICROCIRCULATION IN THE PATIENTS WITH PERITONITIS ON THE BACKGROUND OF ARTERIAL HYPERTENSION
J.S. Trusova, K.G. Shapovalov (Chita State Medical Academy)
Summary. The purpose of the work was to study the microcirculation in 17 patients with peritonitis on the background of arterial hypertension in the early postoperative period and in 15 patients with peritonitis without concomitant diseases. The concentration of ADAMTS - 13 and its inhibitor and the level of TFPI were determined by ELISA. It was established, that in patients with peritonitis on the background of arterial hypertension there was a rheological imbalance, manifesting by revised indicators of microcirculation and haemostasis. The level ADAMTS-13 is 1,4 times increased in patients with peritonitis on
