Зміна сили скорочення скелетних м’язів під впливом піріміфосметилу Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Фізика живого, Т. 18, No 1,2010. С. 42-46.

© Левківська Л. В., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С.

УДК: 577.3

ЗМІНА СИЛИ СКОРОЧЕННЯ СКЕЛЕТНИХ М’ЯЗІВ ПІД ВПЛИВОМ ПІРІМІФОСМЕТИЛУ

Левківська Л. В., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С.

Київський національній університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет, кафедра біофізики, вул.

Володимирська, 64, 01033 Київ, Україна

Надійшла до редакції 25.12.2009

Проведені тензометричні дослідження динаміки скорочення пучків волокон м’язу m.tibialis жаби Rana temporaria в ізотонічному режимі під дією модульованої стимуляції та розчинів піріміфосметилу. Піріміфосметил концентраційно залежно пригнічував скорочення м’язових волокон. Встановлено його нерівномірний вплив на силову відповідь та зміну довжини м’язових волокон. Показано, що при використанні розчину піріміфосметилу в інтервалі концентрацій від 10"7 моль/л до 10"5 моль/л інгібіторні ефекти найменше проявляються впродовж дотетанічного скорочення. При цьому змінюється характер тривалості скорочення при незначній зміні загальної силової відповіді м’язових волокон. Отримані результати свідчать, що інгібіторні властивості розчинів піріміфосметилу підсилювались як при підвищенні концентрацій даної речовини, так і при збільшенні тривалості її дії.

Ключові слова: м ’язове скорочення, скелетний м ’яз, піріміфосметил.

ВСТУП

Фосфорорганічні сполуки, а також їх похідні становлять більш ніж 40% від загальної кількості пестицидів, які використовуються у сільському господарстві [1]. Широке застосування фосфорорганічних пестицидів, незважаючи на відносно високу токсичність, обумовлене їхніми інсектицидними й акарицидними властивостями. Щорічно у світі налічується близько 3000000 випадків інтоксикації фосфорорганічними інсектицидами [2]. Однак, згідно з економічними розрахунками, відмова від застосування токсичних для людського організму сполук, неминуче привела би до скорочення всього врожаю у світі на 50% і викликала би ріст цін на сільськогосподарську продукцію в 4-5 раз [1].

Значна кількість фосфорорганічних пестицидів, що використовуються, відноситься до групи

фосфортіонатів. Прикладом таких інсектицидів є піріміфосметил, який завдяки своїй невисокій вартості має широке комерційне поширення [3]. Згідно даних літератури, при отруєнні фосфортіонатами однією з головних токсичних дій є інактивація ацетилхолінестерази, що призводить до накопичення ацетилхоліну в нервово-м'язових з'єднаннях з подальшою надмірною стимуляцією ацетилхолінових рецепторів скелетних м'язів. Підвищена концентрація ацетилхоліну в синапсі викликає стійку деполяризацію рухової кінцевої пластинки [4,5]. Однак, можливо, що токсичний вплив фосфорорганічних інсектицидів у низьких концентраціях не супроводжується інгібуванням ацетилхолінестерази, тому, що малих доз цих сполук недостатньо, щоб викликати холінергічні ефекти у піддослідних тварин [6]. Досліджено, що патологічні зміни в скелетних м'язах у результаті

впливу високих доз фосфорвмісних інсектицидів супроводжуються оксидативними ушкодженнями мембрани м'язових клітин, порушенням перетворення енергії й кальцієвого гомеостазу [7,8]. Виявлені також ультраструктурні зміни м'язових волокон з порушенням упорядкованої організації саркомерів та міофібрил, дезорганізацією й фрагментацією міофіламентів [9]. Незважаючи на значну кількість робіт присвячених дослідженню токсичних властивостей фосфортіонатів, на сьогодні ще не вистачає експериментальних даних для пояснення їх впливу, в невеликих кількостях, на функціонування скелетних м'язів та зміни їх статичних і динамічних параметрів.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Дослідження проводили на волокнах м’язу m.tibialis anterior, виділених з задньої кінцівки жаби Rana temporaria. Препарат протягом 60 хвилин адаптували в постійно циркулюючому фізіологічному розчині наступного складу: 115,5 ммоль/л Nad, 2 ммоль/л КС1, 1,8 ммоль/л CaCl2 та 2 ммоль/л Na2HPO4 + NaH2PO4 (pH 7.0) Експеримент проводили в ізотонічному режимі. Фіксували силу скорочення, температуру омиваючого розчину та параметри стимулюючого сигналу при постійному контролі зовнішнього навантаження.

Після використання розчинів піріміфосметилу м’яз відмивали фізіологічним розчином до досягнення вихідних параметрів скорочення. У експериментах використовували розчини піріміфосметилу в діапазоні концентрацій від 10-7 до 10-5 моль/л.

Для реєстрації сили скорочення пучків волокон скелетного м’язу використовували тензометричну

ЗМІНА СИЛИ СКОРОЧЕННЯ СКЕЛЕТНИХ М’ЯЗІВ ПІД ВПЛИВОМ ПІРІМІФОСМЕТИЛУ

установку, створену на кафедрі біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Даний пристрій являв собою комплекс, що складався: з камери з системою датчиків, в якій розміщувався досліджуваний препарат, системи насосів та дозаторів, датчиків сили, генератора синхронних імпульсів, системи термоконтролю, осцилографів, комплексу АЦП-ЦАП. Стимуляцію здійснювали електричними імпульсами прямокутної форми тривалістю 2 мс, які формували за допомогою генератора імпульсів, керованим ЦАП, через платинові електроди. Тривалість стимуляційного сигналу становила 2000 мс.

Характеристики стимулюючого сигналу задавали програмно і передавали з комплексу АЦП-ЦАП на генератор з часом затримки не більше 0.3мс. Згенеровані імпульси поступали через подразнюючі електроди до дослідницької камери з м’язовим препаратом. Час затримки при цьому становив не більш 0,2 мс. Загальний час затримки фіксували на вході комплексу АЦП-ЦАП, що дозволяло враховувати його при обробці результатів.

Для реєстрації зміни сили використовували п’єзодатчик з системою підсилювачів. Датчик сили розміщувався на трьохкоординатному столику що дозволяло орієнтувати положення датчика відносно камери та датчика довжини волокна.

Статистичну обробку результатів дослідження проводили методами варіаційної статистики за допомогою програмного забезпечення Origin 7.0. При побудові графіків враховували відносну та абсолютну похибки експерименту. Отримані показники, трансформовані комплексом АЦП-ЦАП, піддавали згладжуванню за допомогою FFT (Fast Fourier Transform) - фільтра з коефіцієнтом згладжування k=5. Кожна з кривих, наведених на рисунках в даній роботі, є результатом узагальнення 10-12-ти аналогічних експериментів.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для зручності опису отриманих результатів та їх адекватного трактування нами проведено розподіл динамічної відповіді активного м’язу на дві часові ділянки тривалістю по 500 мс, які відповідали різним станам процесу скорочення.

F1 - початок силової відповіді м’язу, (співпадає з початком зміни частоти стимуляції).

F2 - відповідає виходу силової продуктивності м’язу на стаціонарний рівень скорочення.

Слід відмітити, що у більшості випадків між періодами F1 та F2 виникала тривала часова затримка.

Встановлено, що на початку стимулюючого сигналу частотою 30 Гц та загальною тривалістю 2000 мс силова відповідь м’язу на ділянці F1 досягала свого максимуму протягом перших 50-80 мс дії стимуляції (рис. 1). Щоб встановити концентрації

піріміфосметилу, під впливом яких відбувались зміни сили скорочення, було досліджено дію

піріміфосметилу у діапазоні концентрацій 10-7 - 10-5 моль/л.

а

б

Рис. 1. Вплив розчинів піріміфосметилу на динамічні параметри скорочення викликані електростимуляцією з частотою 30 Гц та тривалістю 2000 мс, залежно від

тривалості дії реагенту.

• - розчин піріміфосметилу 10"7 моль/л;

О- розчин піріміфосметилу 10-6 моль/л;

▲ - розчин піріміфосметилу 10-5 моль/л. а - період И; б - період Р2;

Тривалість досліджених періодів - по 500 мс. Початкові значення відповідають максимальним показникам параметрів скорочення без дії піріміфосметилу. В кожній з представлених кривих вказані максимальні показники параметрів скорочення на кожному з часових інтервалів (викликаних окремим стимулюючим сигналом). По осі абсцис - час дії піріміфосметилу, по осі ординат відображені відповіді м’язових волокон виражені у відсотках від контрольного рівня. Час релаксації 2 хвилини.

Рис. 2. Діаграма зміни сили скорочення пучків волокон скелетного м’ язу жаби при дії стимулюючого сигналу (частотою 30 Гц та тривалістю 2000 мс) в часовому інтервалі дії розчинів піріміфосметилу, який відповідав стаціонарному стану скорочення.

□ - розчин піріміфосметилу 10-7 моль/л;

- розчин піріміфосметилу 10-6моль/л;

- розчин піріміфосметилу 10-5 моль/л.

К - контроль; И, Р2- періоди м’язового скорочення.

Левківська Л. В., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С.

£ 10%

Рис. З (а, б). Вплив розчинів піріміфосметилу на зміну сили скорочення викликані електростимуляцією з частотою 30 Гц та тривалістю 2000 мс, залежно від тривалості дії реагенту.

В - розчин піріміфосметилу 1-10-7моль/л;

О - - розчин піріміфосметилу 2,5-10-7моль/л;

А - розчин піріміфосметилу 5-10-7 моль/л. а - період F1; б - період F2;

Час релаксації 2 хвилини. Інші позначення як на рисунку 1.

Рис. 4. Діаграма зміни сили скорочення пучків волокон м’язу жаби при дії стимулюючого сигналу (частотою 30 Гц та тривалістю 2000 мс) в часовому інтервалі дії розчинів піріміфосметилу, який відповідав встановленню рівноважного стаціонарного стану скорочення.

К - контроль; F1, F2,- періоди м’язового скорочення;

Інші позначення як на рисунку 3.

Показано, що піріміфосметил в концентрації 10-5 моль/л, вже після десятої хвилини досліджень пригнічує активність скелетно-м’язових препаратів майже на 80% (рис. 2).

При концентрації 10-5 моль/л спостерігався вихід сили скорочення скелетно-м’язових препаратів на стаціонарний рівень (10-та хвилина дії препарату), тому дослідження дії піріміфосметилу в більших концентраціях було недоцільно. Суттєві зміни в динаміці силових кривих при лінійному зменшенні силової продуктивності м’язових волокон

відбуваються вже при концентрації піріміфосметилу 10-7 моль/л.

Виходячи з вищенаведеного для оцінки інтенсивності впливу піріміфосметилу на різні ділянки поодинокого скорочення, використали розчини піріміфосметилу в діапазоні концентрацій від 10-7 до 5-10-6 моль/л.

У результаті досліджень впливу піріміфосметилу в концентрації 10-7 моль/л встановлено, що зміни сили

м’язового скорочення спостерігались, через дві хвилини (рис. 3) після виходу сили м’язового

скорочення на стаціонарний рівень який відбувався на 8-ій хвилині експерименту впродовж ділянки F1 і становив 95,6±1,5 % від контролю, та на 14-ій хвилині експерименту впродовж ділянок F2 і становив 91,1±1,3% відповідно (рис. 4).

Піріміфосметил у концентрації 2,5 • 10-7 моль/л пригнічує динамічні характеристики м’язового скорочення починаючи з 8-ї хвилини дії стимулу (рис. 3). Максимальне зменшення сили м’язового

скорочення відбувалось на 10-їй хвилині експерименту впродовж ділянки F1 і становило 85,9±1,4%, та на 12-ій хвилині експерименту,

впродовж ділянки F2 і становило 82,4±1,7% (рис. 4).

Вплив розчину піріміфосметилу в концентрації 5-10-7 моль/л. показав, що пригнічення динамічних

характеристик м’язового скорочення відбувалось, починаючи з 6-ї хвилини дії стимулюючого сигналу. Максимальне зменшення сили м’язового скорочення відбувалось на 7-ій хвилині впродовж ділянки F1 і становило 83,6±1,8% (р>0,05) від контролю.

Найбільше зменшення сили м’язового скорочення впродовж ділянок та F2 відбувалось на 12-ій відповідно, і становило 81±2,9%) від контролю.

Вплив розчинів піріміфосметилу в концентраціях

1-10-6 моль/л, 2,5 -10-6 моль/л, та 5 • 10-6 моль/л. (рис. 5,6) показав, що пригнічення динамічних характеристик м’язового скорочення відбувалось, починаючи вже з 2-ї хвилини дії стимулюючого сигналу.

а

б

Рис. 5. (а, б). Вплив різних концентрацій розчинів

піріміфосметилу на силу скорочення пучків м’ язових волокон жаби.

Щ - розчин піріміфосметилу 1-10-6моль/л;

- розчин піріміфосметилу 2,5-10-6моль/л;

А - розчин піріміфосметилу 5-10-6 моль/л. а - період F1; б - період F2;

Час релаксації 2 хвилини. Інші позначення як на рис. 1.

ЗМІНА СИЛИ СКОРОЧЕННЯ СКЕЛЕТНИХ М’ЯЗІВ ПІД ВПЛИВОМ ПІРІМІФОСМЕТИЛУ

Слід зазначити, що на 2-й хвилині дії препарату зниження силової продуктивності волокон досягало відповідно 85,6±1,% , 81,6±1,2, та 78,6±1,1 від контролю. Вихід сили м’язового скорочення на стаціонарний рівень в концентрації 1 • 10-6 моль/л, відбувався на 10-ій хвилині експерименту, в концентрації 2,5 Т0-6 моль/л на 12-ій хвилині відповідно. При використанні концентрації піріміфосметилу 5-10-6 моль/л, встановити час досягнення максимального зменшення сили скорочення при постійному зменшенні сили було ускладнено. Можна стверджувати тільки те, що силова відповідь не перевищувала 25% на 14 хвилині дослідження.

Слід зазначити що у дослідженому діапазоні концентрацій розчинів піріміфосметилу відмивання м’язових препаратів розчином Рінгера хоч і супроводжувалося відновленням динамічних параметрів скорочення до вихідних значень, однак проходило дуже повільно, і в деяких випадках цей час сягав декількох годин. Час відновлення роботи м’ язового препарату до рівня контрольних значень лінійно залежав від тривалості дії реагенту та водночас пропорційно збільшувався з підвищенням концентрації використаного розчину піріміфосметилу.

Рис. 6. Діаграа зміни сили скорочення пучків м’язових волокон жаби при дії стимулюючого сигналу (частотою 30 Гц та тривалістю 2000 мс) в часовому інтервалі дії розчинів піріміфосметилу, який відповідав встановленню рівноважного стаціонарного стану скорочення.

■ - розчин піріміфосметилу 1-10"6 моль/л;

О - розчин піріміфосметилу 2,5-10-6моль/л;

А - розчин піріміфосметилу 5-10-6 моль/л.

К - контроль; П, Р2,- періоди м’язового скорочення.

Отримані нами експериментальні дані дозволяють припустити, що при використанні розчинів піріміфосметилу в інтервалі концентрацій від 10-7 моль/л до 5 • 10-6 моль/л інгібіторні ефекти цього пестициду на процес м’язового скорочення найменше проявляються впродовж дотетанічних інтервалів скорочення. При цьому змінюється характер тривалості скорочення при незначній зміні загальної силової відповіді м’язових волокон.

Відмінності динамічних показників впродовж різних ділянок скорочення можна пояснити існуванням різних молекулярних механізмів на до та після тетанічних рівнях взаємодії м’язових білків [10,11]. Відповідно з цим, однакова концентрація

біологічно-активної речовини може викликати різні ефекти на різних ділянках кожного з поодиноких скорочень. Тому особливу увагу в роботі ми приділяли встановленню саме змін в часі досягнення рівноважного стаціонарного стану скорочення під впливом піріміфосметилу.

Відомо, що дана сполука є реакційно здатною. [7,

8, 9], яка навіть при незначних концентраціях може змінювати динамічні, та механічні параметри скорочення м’язів. В випадках дослідження їх дії на скоротливу активність м’язів, коли невідомий час досягнення рівноважного стаціонарного стану скорочення, лінійне зменшення силової відповіді м’язу при збільшенні тривалості дії реагенту унеможливлює адекватне тлумачення отриманих експериментальних даних, внаслідок похибок які будуть виникати при збільшенні часу дослідження. Ці похибки можуть суттєво змінювати характер досліджуваних кривих. Тому при дослідженні кінетики скорочень викликаних короткочасовими стимулюючими сигналами, становиться необхідним визначення часу досягнення м’ язом стаціонарного рівня скорочення без суттєвих трендів в той чи іншій бік за кожної використаної концентрації досліджуваної сполуки.

В дослідженому діапазоні концентрацій використана речовина концентраційно залежно пригнічувала генерацію сили скорочення м’язових волокон жаби. Зниження показників генерації сили м’ язових волокон в часовому інтервалі спостереження та протягом кожного окремого перебігу відбувалося постійно і у більшості випадків носило лінійний характер. Динамічні параметри скорочення зазнавали найменшого впливу впродовж дотетанічних ділянок скорочення.

Отримані результати свідчать, що інгібіторні властивості розчинів піріміфосметилу підсилювались як при підвищенні концентрацій даної речовини, так і при збільшенні тривалості її дії, в усіх досліджених нами випадках. Це можна пояснити збільшенням кількості речовини, що проникає через плазматичну мембрану м’язового волокна [7], а також її впливом на мембранні процеси [8]. Досліджуваний пестицид може проникати в клітину за рахунок розчинення в ліпідній фазі плазматичної мембрани і у подальшому впливати на функціональну активність клітинних структур.

Література

1. Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции

фосфорорганических нейротоксинов// Успехи

биологической химии. -2004. - Т. 44. - С. 307—340.

2. Bairy K.L., Vidyasagar S., Sharma A., Sammad V. Controversies in the management of organophosphate poisoning //Ind J Pharmacol. - 2007. -Vol.39, №2. - Р.71-74.

3. Ferdinand N., Pierre W., Marie-Chantal D., Augustave K., Pierre K. Effects of pirimiphos-methyl (an organophosphate insecticide) on the fertility of adult male rats // Afr Health Sci. -2007. - Vol. 7, №1. - P. 3-9.

4. Paudyal B.P. Organophosphorus poisoning// J Nepal Med Assoc. - 2008. -Vol.. 47, №172. - P.251-258

Левківська Л. В., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С.

5. Chen-Chang Yang, Jou-Fang Deng. Intermediate syndrome following organophosphate insecticide poisoning // J Chin Med Assoc. - 2007. - Vol.70, № 11. - P. 467-472

6. Albers J., Garabrant D., Schweitzer S., Garrison R., Richardson R., Berent S. The effects of occupational exposure to chlorpyrifos on the peripheral nervous system: a prospective cohort study //Occup Environ Med. - 2004. - Vol.61, №3. -P.201-211.

7. Dandapani M., Zachariah A., Kavitha M., Jeyaseelan L., Oommen A. Oxidative damage in intermediate syndrome of acute organophosphorus poisonin // Ind J Med Res. - 2003. -Vol.11. - P. 253-259.

8. Yang D., Lu X., Zhang W., He F. Biochemical changes in primary culture of skeletal muscle cells following dimethoate exposure //Toxicology. - 2002. -Vol.174. - P.79-85.

9. Kaya H.B. Ultrastructure of nerve and muscle fiber following organophosphate poisoning //Journal of Islamic Academy of Sciences. - 1992. -Vol.5, №2. - P. 93-99.

10. Ноздренко Д.Н., Мирошниченко Н.С., Запоило И.А. Динамика сокращения изолированого мышечного волокна

лягушки при высокочастотной модулированой стимуляции // Физика живого. - 2002. - Вып. 10, № 1. - С. 41-47.

11. Мірошниченко М.С., Залоїло І.А., Ноздренко Д.М., Прилуцкий ЮІ. Динаміка скорочення ізольованого м’язового волокна // Фізика живого. - 2002. - Т.10, № 2. - С. 71-77.

12. Литвинюк Л.В., Абрамчук ОМ., Ноздренко Д.М., Мірошниченко М.С. Дія розчинів хлориду алюмінію з рутином на механіку м’язового скорочення. // Фізика живого - 2009р., Т.17, N.1 C. -172-178.

13. Абрамчук ОМ.., Ноздренко Д.М., Мотузюк О.П. Вплив етилового спирту на динаміку скорочення скелетних м’язів в ізотонічному режимі. // Науковий вісник Волинського національного університету імені Лесі Українки., 2008. N.3, С.-14-16.

14. Мельничук О.М. Ноздренко Д.Н., Мірошниченко М.С. Вплив

кверцетину на параметри скорочення м’язових волокон жаби в ізотонічному режімі. // Вісник Київського

національного університету імені Тараса Шевченка. Серія: Біологія. - 2005. - вип. 42-43. - С. 69-70.

ИЗМЕНЕНИЯ СИЛЫ СОКРАЩЕНИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПОД ВЛИЯНИЕМ ПИРИМИФОСМЕТИЛА Левковская Л. В., Ноздренко Д.Н., Мирошниченко Н.С.

Проведены исследования динамики сокращения пучков волокон мышцы m.tibialis лягушки Rana temporaria в изотоническом режиме при воздействии модулированной стимуляции и растворов пиримифосметила. Пиримифосметил зависимо от концентраций подавлял сокращения мышечных волокон. Выявлено его неравномерное влияние на силовой ответ и изменение длины мышечных волокон. Показано, что при использовании раствора пиримифосметила в диапазоне концентраций от 10-7 моль/л до 10-5 моль/л ингибиторные эффекты наименее проявляются на протяжении дотетанического сокращения. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ингибиторные свойства растворов пиримифосметила усиливались как при повышении концентрации этого вещества, так и при увеличении длительности его действия.

Ключевые слова: мышечное сокращение, скелетная мышца, пиримифосметил.

THE CHANGE OF SKELETAL MUSCLE FORCE UNDER INFLUENCE OF PIRIMIPHOS Levkivska L.V., Nozdrenko D.M., Miroshnichenko M.S.

Investigations of the contraction dynamics of m.tibialis muscle fibers of frog Rana temporaria under isotonic conditions and under influence of modulated stimulation and solutions of pirimiphos-methyl were accomplished. Pirimiphosmethyl depressed muscle fibers contraction in a concentration-dependent manner. Nonuniform effect of used substance on muscle fibers force response and length change was revealed. It was shown that inhibitor effects of pirimiphosmethyl within a concentration range from 10-7mol/l to 10-5 mol/l were less during pretetanic intervals of contraction. The results obtained indicate that inhibitory properties of pirimiphosmethyl solutions were enhanced both during increase of substance concentration and increase the time of action in all investigated cases.

Key words: muscle contraction, skeletal muscle, pirimifosmetil.