CC BY
9
УДК «12.35.014.21.014.424.5
Доктор мед. наук Ю. Д. Думанский, В. Ф. Рудиченко
ЗАВИСИМОСТЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ
ОТ СВЧ-ИЗЛУЧЕНИЯ
Киевский научно-исследовательский институт общей и коммунальной гигиены
В литературе имеются указания о влиянии СВЧ-излучения на обычный ход окислительно-восстановительных реакций в организме. Общеизвестно, что биологическое окисление, протекающее на мембранных структурах митохондрий, сопряжено с синтезом АТФ. Отсутствие экспериментальных данных о действии длительного СВЧ-излучения на основной (аэробный) путь синтеза АТФ в тканях организма послужило причиной настоящего исследования, целью которого была оценка возможного влияния этого излучения на окислительное фосфорилирование в митохондриях печени.
Работа выполнена на 42 белых крысах-самцах, которых в течение 4 мес трижды в день (по 5 дней в неделю) облучали по 40 мин СВЧ-энергией с различной плотностью потока мощности (ППМ) излучения (1000, 500, 100, 50, 25 и 10 мкВт/см2) при помощи аппарата «Луч-58» (Я,= 12 см). Антенна излучала вертикально-поляризованную волну. У декапитированных животных извлекали печень, измельчали ее на холоду ножницами до кащицеоб-разного состояния и затем гомогенизировали 45 с в ледяной среде выделения, содержавшей 0,25 М раствор сахарозы и 0,001 М раствор версена при рН 7,4 (В. П. Скулачев), в стеклянном стакане тефлоновым пестиком. Ядра и обломки клеток осаждали при 700 g 10 мин на центрифуге ЦЛР-1, из надосадочной жидкости выделяли митохондрии при 12 000 g 10 мин (температура в обоих случаях равнялась 0°). Полученные митохондрии хранили на льду в 0,15 М растворе сахарозы. Активность митохондрий в различных функциональных состояниях определяли полярографическим способом. Для этого использовали полярографическую ячейку объемом 2 мл с вибрирующим платиновым электродом, предложенную одним из нас (В. Ф. Рудиченко); ячейка подключалась к полярографу ЛП-7. Среда инкубации состояла из 0,15 М раствора сахарозы, 0,075 М раствора КС1, 0,005 М раствора КН2Р04 (рН 7,4) и 0,0025 М раствора М£2\г (Ю. Н. Лей-кин и А. Д. Виноградов). Субстратами окисления были сукцинат (5 ммоль) или а-кетоглютарат (10 ммоль). Акцептор фосфата АДФ вносили до концентрации, равной 200 мкмоль в пробе. Белок митохондрий определяли с биуре-товым реактивом. В пересчете на сухой вес содержание белка в пробе составляло 2,5—3 мг.
Порядок опытов был следующим. В инкубационную среду вносили митохондрии, затем — субстрат окисления, после чего вводили АДФ. В отсутствие субстратов окисления и фосфорилирования скорость потребления кислорода была незначительной. Такое состояние митохондрий Чане (цит. В. П. Скулачев) определил как состояние 1. Добавление к таким митохондриям субстрата окисления активирует дыхание, наступает состояние 4, когда единственным фактором, лимитирующим дыхание, оказывается дефицит субстрата фосфорилирования. Внесение в этом случае субстрата фосфорилирования (например, АДФ) резко активирует дыхание митохондрий, что соответствует состоянию 3, или активному состоянию. При этом скорость дыхания ограничивается только скоростью проникновения субстратов в митохондрии и мощностью ферментов фосфорилирующего окисления. После того как весь добавленный АДФ синтезируется митохондриальными ферментами в АТФ дыхание вновь тормозится что соответствует состоянию 4, или состоянию дыхательного контроля; оно лимитируется только исчерпанием в среде субстрата фосфорилирования. Следовательно, фосфорилирующее, или активное, дыхание в наших опытах развивается вслед за контролируемым и им же сменяется. После исчерпания в среде инкубации кислорода наступает анаэробиоз, или состояние 5.
Таблица 1
Влияние СВЧ-излумеиия на дыхание и фосфорилирование митохондрий печени при окислении
сукцината
ППМ (в мкВт/см') Фосфорнлирую- щее дыхание (состояние 3) (в мкг атом кислорода мг белкаМх.мин Контролируемое дыхание (состояние Ч) Величины дыхательного контроля Отношение АДФ/О Скорость фосфорилирования АДФ (в мкмоль АДФ
мг белка Мх. мин
x±Sx (п = 6)
0 0,0575±0,0018 0,0087+0,00025 6,65+0,28 1,98+0,12 0,0777+0,0023
10 0,0587+0,0021 0,0086+0,0002 7,02+0,53 1,96+0,13 0,0780+0,0019
р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
25 0,0551+0,0021 0,0090+0,0003 6,18+0,60 1,93+0,12 0,0745+0,0034
Р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05
50 0,0528+ 0,0019 0,0097+0,00036 5,53+0,34 2,06+0,12 0,0738+0,0031
Р >0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05
100 0,0498+0,0011 0,0100+0,00036 5.03+0,26 2,00+0,10 0,0683+0,0035
р <0,02 <0,01 <0,001 >0,05 <0,05
500 0,0478+0,0018 0,0105+0,00025 4,58+0,25 1,95+0,13 0,0621+0,0019
Р <0,01 <0,01 <0,01 >0,05 <0,001
1000 0,0455+0,0018 0,0110+0,00036 4,15+0,19 1,92+0,12 0,0605+0,0024
р <0,001 <0,01 <0,001 >0,05 <0,001
Мы измеряли дыхательный контроль как отношение скорости дыхания в присутствии АДФ, т. е. в состоянии 3, к скорости дыхания после исчерпания АДФ, т. е. в состоянии 4 (Chance и Williams). Эта величина показывает прочность сопряжения дыхания и фосфорилирования. Отношение АДФ/О указывает на количество пунктов сопряжения дыхания и фосфори-лирования в дыхательной цепи. При окислении субстратов, включающихся в дыхательную цепь через флавопротеид, это отношение может равняться 2, как и для сукцината; в случае НАД-зависимых субстратов, когда окисление происходит по более длинной цепи, отношение увеличивается до 3 (пи-руват, малат), а при окислении а-кетоглютарата добавляется еще субстратное фосфорилирование. Поэтому по изменению отношения АДФ/О при окислении различных субстратов цикла Кребса в случае какого-либо воздействия на организм можно установить место повреждающего действия на дыхательную цепь того или иного фактора. Величины скорости фосфорилиро-вания АДФ равны величинам синтеза АТФ и позволяют судить об удельной фосфорилирующей активности митохондрий. Изучение динамики синтеза АТФ, вероятно, может дать исследователю более полное представление об энергетических процессах в клетке, чем определение концентраций АТФ, когда в условиях длительного неблагоприятного воздействия на организм возможны нарушения не только синтеза, но и утилизации АТФ на примерно равные величины, что поддерживает концентрацию АТФ на уровне контроля.
В настоящей работе приводятся величины фосфорилирующего дыхания (состояние 3), контролируемого дыхания (состояние 4), регистрируемого после состояния 3, величины дыхательного контроля, отношения АДФ/О и скорости фосфорилирования АДФ. Статистическую обработку результатов проводили по М. П. Деркачу.
При окислении сукцината митохондриями печени (табл. 1) удалось установить, что СВЧ-излучение при ППМ от 50 до 1000 мкВт/см2 вызывает изменения различных параметров дыхания и фосфорилирования. Микроволновое облучение с ППМ ниже 50 мкВт/см2 не оказывало влияния на изучаемые показатели. Процессы дыхания, по нашим данным, изменялись в первую очередь при контролируемом (нефосфорилирующем) дыхании, начиная с ППМ излучения 50 мкВт/см2 и больше, а затем — при фосфори-лирующем (при ППМ 100 мкВт/см2 и больше). Изменения контролируемого и фосфорилирующего дыхания в опыте носили разнонаправленный характер.
Таблица 2
Действие СВЧ-излучения на функциональную активность митохондрий печени при окислении а-кеюглютарата
ППМ (в чкВт/см') Фосфорилирующее дыхание (состояние 3) (в мкг атом кислорода Контролируемое дыхание (состояние 4) Величины дыхательного контроля Отношение АДФ/О Скорость фосфорилирования АДФ (в мкмоль АДФ
иг белка Мх. мин мг белка Мх.ыиы
•х±5д[ (л = 6)
0 10 Р 25 Р 50 Р 100 р 500 Р 1000 р 0,0310+0,00024 0,0303+0,0010 >0,05 0,0303+0,0011 >0,05 0,0278±0,00018 <0,001 0,0253+0,0013 <0.01 0,0241+0,0013 <0.001 0,0223+0,0014 <0,001 0,0052+0,0003 0,0053+0.00044 >0,05 0,0053+0,00054 >0,05 0,0060+0,00025 <0,05 0,0062+0,00025 <0,05 0,0067+0,0006 <0,05 0,0070+0,00025 <0,001 6,08+0,32 5,88+0,56 >0,05 6,22+0,91 >0,05 4,68+0,18 <0,01 4,12+0,17 <0,001 3,86±0,51 <0,01 3,23+0,24 <0,001 3,92+0,07 4,07+0,19 >0,05 3,88+0,25 >0,05 3,65+0,14 >0,05 3,48+0,15 <0,05 3,30+0,14 <0,01 3,05+0,12 <0,001 0,0475+0,0015 0,0445+0,0031 > 0,05. 0,0452+0,0022 >0,051 0,0390+0,0022 <0,01 0,0347+0,0015 <0,001 0,0318+0,0025 <0,001 0,0247+0,0019 <0,001
При воздействии СВЧ-излучеиия в отмечаемых величинах ППМ контролируемое дыхание увеличивалось, а фосфорилирующее—уменьшалось. Изменения скорости дыхания при воздействии микроволнового излучения привели к значимому снижению величин дыхательного контроля при ППМ от 50 мкВт/см2 и больше. Наряду с этим отмечено, что при окислении сукцината митохондриями печени сохраняются величины отношения АДФ/О на уровне контрольных у всех животных, несмотря на ППМ излучения. Поэтому снижение скорости фосфорилирования АДФ при микроволновом облучении (ППМ 100 мкВт/см2 и больше) является следствием снижения фосфорилирующего дыхания.
При окислении митохондриями печени а-кетоглютарата (табл. 2) изменения параметров дыхания и фосфорилирования под влиянием СВЧ-из-лучения несколько отличались от тех же величин при утилизации дыхательной цепью сукцината. Контролируемое дыхание при окислении митохондриями а-кетоглютарата увеличивалось с тех же величин ППМ, что и для сукцината, тогда как фосфорилирующее дыхание снижалось при меньших величинах ППМ облучения, чем для сукцината (50 и 100 мкВт/см2 соответственно). Окисление а-кетоглютарата митохондриями печени при ППМ излучении 50 мкВт/см2 и больше сопровождалось снижением величин дыхательного контроля. Если при окислении сукцината отношение АДФ/О при всех указанных ППМ излучения приближалось к контрольным величинам, то при утилизации митохондриями печени а-кетоглютарата нами установлено достоверное снижение этого коэффициента, начиная с ППМ излучения 100 мкВт/см2 и больше. В этом случае снижение скоростей фосфорилирования АДФ от микроволнового излучения при окислении а-ке-тоглютарата зависело не только от снижения фосфорилирующего дыхания, как и для сукцината, но и от изменения отношения АДФ/О.
Анализ полученных параметров дыхания и фосфорилирования митохондрий печени при окислении ими сукцината и а-кетоглютарата показывает, что микроволновое излучение при ППМ 50, 100, 500 и 1000 мкВт/см2 и указанном способе воздействия вносит изменения в этот процесс.
В то время как превращение сукцината дыхательной цепью, по нашим данным, сопровождается начальными нарушениями функциональной ак-
тивности митохондрий при утилизации а-кетоглютарата отмечают более глубокие изменения в обычных взаимоотношениях этой цепи.
Общеизвестно, что при окислении указанных выше субстратов имеются общие электронно-транспортные участки в дыхательной цепи. Именно на этом уровне через особый флавопротеид утилизируются посредством ци-тохромов в, с и а в дыхательной цепи сукцинат, тогда как а-кетоглютарат имеет дополнительные переносчики электронов — липоат, никотинамида-деннннуклеотид и свой флавопротеид.
Разобщение дыхания и фосфорилирования при окислении именно а-кетоглютарата и сохранение отношения АДФ/О при окислении сукцината говорят о возникновении блока в дыхательной цепи: субстрат-*-липоат-*никотинамидадениннуклеотид-^-флавопротеид-^цитохромы-»-0 до флавопротеида, так как точка зрения о равнозначной устойчивости различных флавопротеидов к интенсивному воздействию физических факторов не оспаривается (В. П. Скулачев).
Результаты исследования показывают, что при облучении животных СВЧ-энергией в модельном опыте, соответствующем эксплуатационному режиму для бытовых СВЧ-печей, происходят нарушения процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях печени, начиная с ППМ излучения 50 мкВт/см2 и больше. Следовательно, микроволновое излучение с длиной волны 12 см представляет опасность для организма при указанных выше величинах ППМ излучения. Эти данные должны учитываться при разработке бытовых СВЧ-приборов.
Выводы
1. СВЧ-излучение (Х=12 см) при ППМ 50, 100, 500 и 1000 мкВт/см2 влияет на процессы дыхания и фосфорилирования митохондрий печени. Это влияние характеризуется усилением нефосфорилирующего окисления метаболитов цикла Кребса и снижением скоростей потребления кислорода при фосфорилирующем дыхании. Наблюдаемое снижение фосфорилирующего дыхания и частично отношения АДФ/О приводят к уменьшению скоростей фосфорилирования АДФ.
2. Окисление дыхательной цепью сукцината более устойчиво к воздействию микроволнового излучения и связано с большими величинами фосфорилирования АДФ по сравнению с теми же величинами при потреблении а-кетоглютарата как субстрата митохондриями печени.
ЛИТЕРАТУРА. Деркач М. П. Елементи статистично1 обробки результатов 61олог1чного експеременту. Льв1в, 1963, с. 63. — Лебкин Ю. Н., В и н о г р а*-дов А. Д. — В кн.: Митохондрии. Регуляция процессов окисления и сопряжения. М., 1974, с. 55—65. —Скулачев В. П. Аккумуляция энергии в клетке. М., 1969.— Chance В., \V i 1 1 i a m s G. R. — »Advanc. Enzyrrol.», 1956, v. 17, p. 68.
Поступила 30/V—1975 r.
DEPENDENCE OF THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF LIVER MITOCHONDRIA ON THE SUPER-HIGH FREQUENCY RADIATION
Yu. D. Dumansky, V. F. Rudichenko
Under conditions of the action of the super-high frequency (SHF) radiation (X=12cm) for 40 minutes three times a day for a period of 4 months the breathing parameters and the phosphorylation were found to change if the density of the current power was from 50 to 1000 mcW/cm2. The doses below 50mcW/cm2 proved to be ineffective.
The disturbances of the respiratory chain were less pronounced in the oxidation of succinate, than in the use of a-ketoglutarate by mitochondria. In this connection the possible mechanisms of the SHF radiation action on the respiratory chain are discussed.
