CC BY
90
УДК 612.646:575.1
Д. О. Микитенко1 О. В. Підгорна2, О.І. Тимченко3
Клініка репродуктивної медицини «Надія»
(директор - к. мед. н., В.Д. Зукін/
Медико-генетичне відділення КЗ КОР «Київський обласний центр охорони здоров ’я матері і дитини» (гол. лікар - Л. А. Журавльова) 2
ДУ «Інститут гігієни та медичної екології НАМН України»
(директор - д. мед. н., академік АМН України А. М. Сердюк)3 м. Київ
ЗАСТОСУВАННЯ СУЧАСНИХ МЕТОДІВ ДОІМПЛАНТАЦІЙНОГО ГЕНЕТИЧНОГО ДОСЛІДЖЕННЯ
Ключові слова: доімплантаційна генетична діагностика, скринінг, ПЛР, FISH, порівняльна геномна гібридизація
Key words: preimplantation genetic diagnostics, screening, PCR, FISH, comparative genomic hybridization
Резюме. В работе исследованы основные методические аспекты предимплантационной генетической диагностики эмбрионов: проанализированы особенности законодательной базы стран Европы, охарактеризованы особенности использования различных объектов и методов исследования. Особенное внимание уделено разделению показаний для исследования методами FISH и сравнительной геномной гибридизации. Исследовано состояние предимплантационной генетической диагностики в Украине и оценены перспективы и условия дальнейшего развития данного направления.
Summary. In present article main methodical aspects of preimplantation genetic diagnostics of the embrios are investigated: the national regulation features of the European countries are analyzed, the properties of the different testing objects and methods are characterized. Particular ottention is paid to the differentiation of the indications for testing by FISH and comparative genomic hybridization methods. Modern status of the preimplantation genetic diagnostics in Ukraine is investigated, perspectives and conditions of the further development of this medical field are estimated.
Відомо, що феномен зниження фертильності, що спостерігається останніми роками в нашій державі, часто є характерним проявом більшості спадкових хвороб людини. Біологічний сенс цього явища полягає у зменшенні відтворення потомства у сім’ях зі спадковою патологією, що можна розглядати як прояв впливу еволюційно зумовленого природного добору. При зниженні тиску природного добору спостерігаються медико-соціальні наслідки: соціальна дезадаптація (інвалідність) хворих, підвищена потреба у медичному обслуговуванні та зниження тривалості життя [1].
На фоні усталених тенденцій погіршення стану репродуктивного здоров’ я населення все ширшого розвитку набувають технології штучного запліднення.
Але відсутність реєстрів сімей зі спадковою патологією, незадовільна орієнтація пацієнтів і донорів сперми та яйцеклітин у своїх родоводах зумовлює розширення спектру методик, що застосовуються для їх обстеження при використанні таких технологій. З огляду на вище-викладене, надзвичайної актуальності набуває розвиток методів доімплантаційної діагностики (eng. PGD - preimplantation genetic diagnosis) як
єдиного методу селекції ембріонів з генетичним апаратом, що не містить патологічних змін. Він є комплексом заходів, спрямованих на дослідження генетичних структур статевих клітин чи ембріона на етапі до імплантації останнього в порожнину матки.
Використання такого підходу видається одним із дієвих механізмів боротьби з генетичною патологією.
З огляду на брак інформації у вітчизняних лікарів-генетиків щодо можливостей та алгоритмів доімплантаційної генетичної діагностики метою цієї роботи став аналіз сучасних тенденцій їх розвитку задля ширшого їх застосування в Україні.
Основи доімплантаційної генетичної діагностики були закладені ще у 1967 році, коли у науковій літературі з’явилось перше повідомлення щодо визначення статі ембріонів кролика на стадії бластоцист [11]. Однак широкі клінічні дослідження та впровадження розробок у клінічну практику були тривалий час утруднені через відсутність високочутливих та надійних молекулярних методів діагностики. І лише у 1990 р. народилась перша дитина у подружжя з Х-зчепленою патологією в анамнезі [23]. Подаль-
ший розвиток діагностичних технологій сприяв широкому впровадженню методів доімпланта-ційної діагностики та зробив її невід’ємною частиною проведення циклів допоміжних репродуктивних технологій (ДРТ). Пізніше, у 1997 році, з метою централізації даних та стандартизації проведення доімплантаційних досліджень була сформована ініціативна група, яка в подальшому отримала назву PGD Consortium1.
Показання до діагностики. Доімплантаційну генетичну діагностику умовно можна поділити на власне діагностику та скринінг.
Власне діагностика проводиться у подружніх пар, що є носіями встановленого генного чи хромосомного дефекту.
Використання скринінгового підходу зумовлено тим, що навіть у фертильних подружніх пар близько половини випадків становлять анеупло-їдні чи мозаїчні ембріони [20] (залежно від кількості досліджених хромосом). І хоча більшість з них не імплантується або не доношується до пізніх строків вагітності, все ж існує ризик народження дитини з хромосомними аномаліями. Тому, зважаючи на зусилля, докладені пацієнтами та лікарями до досягнення вагітності, доцільно мінімізувати ризик переносу анеупло-їдного ембріона. Саме тому скринінг проводиться за умов, коли подружня пара не має встановлених порушень генетичного апарату, однак ймовірність отримання ембріона з генетичним дефектом є підвищеною.
Підсумувавши, можна звести показання до проведення доімплантаціного генетичного дослідження до такого переліку:
• звичне невиношування вагітності;
• множинні невдалі спроби ДРТ (>2);
• непліддя невизначеного ґенезу;
• вік матері понад 37 років;
• чоловічий фактор непліддя;
• наявність в анамнезі вагітності чи народження дитини з хромосомною аномалією;
• носійство структурних хромосомних перебудов;
• носійство спадкової генної патології.
Об’єкт доімплантаційного генетичного дослідження. На сьогодні існує три різні підходи до аналізу генетичного матеріалу на доімплан-таційному етапі: аналіз полярних тілець яйце-
1 PGD Consortium - структурний підрозділ European Society of Human Reproduction and Embriology, в завдання якого входить збір, аналіз результатів доімплантаційних досліджень в циклах ДРТ, а також уніфікація досліджень шляхом формулювання вимог, правил та протоколів.
клітини, бластомера ембріона та клітин троекто-дермальної оболонки, порівняння яких наведено у таблиці 1.
З наведених у таблиці даних випливає, що вибір будь-якого об’єкта дослідження для доім-плантаційної діагностики пов’язаний з певними обмеженнями, які обов’язково мають бути взяті до уваги. Відтак, вибір має враховувати:
• особливості правового простору діяльності клініки;
• можливості ембріологічної лабораторії;
• предмет доімплантаційної діагностики (на що саме проводиться дослідження);
• метод доімплантаційної діагностики;
• віддаленість та технічна оснащеність цитогенетичної/молекулярно-діагностичної лабораторії;
• індивідуальні особливості ДРТ-циклу.
Особливості правового простору функціонування клініки ДРТ є, мабуть, найвагомішим чинником, під який підводяться усі інші. Законодавчі обмеження, що базуються, в першу чергу, на усталених релігійних поглядах в окремому регіоні, здатні суттєво обмежити свободу прийняття рішення.
Кожна країна має власні національні особливості регулювання сфери ДРТ, однак існують і окремі міжнародні норми. Найбільш вагомим законодавчим актом, що стосується зазначеної сфери, є Директива стосовно людських тканин та клітин (Human Tissue and Cells Directive 2004/23/EC). Вона прямо стосується людських гамет, ембріонів та ліній стовбурових клітин ембріологічного походження, висуваючи низку вимог щодо якості й безпеки процедури, питань контролю, застосування, зберігання, консервування, поширення та переміщення біологічного матеріалу між кордонами (ст. 8, 9, 25), особливо якщо такі дії пов’язані з законодавчими обмеженнями, що існують у країнах-учасницях.
Питань регулювання сфери ДРТ також опосередковано стосуються Хартія фундаментальних прав Європейського союзу та Конвенція про захист прав людини та фундаментальних свобод, Конвенція про захист прав людини та людської гідності у зв’язку з застосуванням біології та медицини (Конвенція про права людини та біомедицину) та Заключна декларація восьмого зібрання Конференції національних етичних комітетів.
Однак, відповідно до зазначених норм, кожна країна є вільною у встановленні більш жорстких законодавчих норм. Порівняльна характеристика законодавчого регулювання репродуктивних технологій в окремих європейських країнах наведена у таблиці 2.
Таблиця 1
Порівняльна характеристика об’єктів дослідження при застосуванні методів доімплантаційної генетичної діагностики*
Об’єкт дослідження Опис Переваги Обмеження
Полярні тільця (перше та друге) Редукційні клітинні утворення, що утворюються на різних стадіях дозрівання яйцеклітини. Полярні тільця не відіграють ролі у заплідненні та можуть бути вилучені без пошкодження яйцеклітини. - Дослідження дає побічне уявлення про генетичний апарат яйцеклітини і не є гарантією його нормальності. - Аналіз не враховує чоловічий фактор запліднення та, отже, не є повною характеристикою майбутнього ембріона.
Бластомери Клітини ембріона на 3 день розвитку (6-8 клітинна стадія, 3 доба). Клітини є недиференційованими та одна-дві з них можуть бути вилучені з мінімальним впливом на життєздатність ембріона. Дослідження бластомерів дає безпосереднє уявлення про стан генетичного апарату ембріона. - Дослідження не виключає наявності мозаїцизму у ембріона. Біопсія бластомера є потенційно негативним чинником впливу на подальший розвиток ембріона. - Не виключена можливість подальшої самокорекції ембріонів з трисомією.
Клітини трофекто- дермальної оболонки Клітини ембріонального походження, що складають зовнішню оболонку на стадії бластоцисти (5-6 доба) - Тестування дає безпосереднє уявлення про стан генетичного апарату ембріона, враховується можливість мозаїцизму. - Більша частина ембріонів з хромосомними аномаліями не доживають до стадії бластоцисти (природній добір), що зумовлює економічну ефективність дослідження трофектодерми. - Дослідження трофектодерми вимагає можливості ембріологічної лабораторії вести бластоцистну культуру. - Проведення ДРТ-циклів з РОБ-дослідженнями, за якими через технічні особливості результат не може бути отриманий протягом доби, вимагає консервування ембріонів та їх
використання у подальших кріоциклах.
Примітка : * - складено з використанням даних, представлених у [5, 9, 10, 24, 26]
Так, у Германії функціонує закон про охорону ембріона, що забороняє дослідження як ембріона в цілому, так і окремих його клітин. Тому скринінг може проводитися лише при використанні першого та другого полярних тілець. Аналогічні обмеження встановлені і у Нідерландах.
Ірландія не має специфічного закону щодо РОБ, але ембріони підпадають під захист Конституції Ірландії у розділі права ненароджених на життя. Відтак, ембріон навіть з генетичною патологією не може бути знищений. Тому РОБ у цій країні не застосовується, а клініки не мають права забезпечувати доімплантаційну діагностику для місцевих пацієнтів навіть за кордоном.
У Греції, наприклад, законом не визначена різниця між доімплантаційною та пренатальною діагностикою.
Сполучені Штати Америки не мають федеральних законів, що безпосередньо регулюють використання методів доімплантаційної діаг-
ностики, однак окремими штатами встановлені власні обмеження.
Не має законодавчих обмежень і Україна. Наша держава характеризується незрілістю законодавчої бази, темпи формування якої суттєво відстають від сучасних тенденцій розвитку медичної науки. Зауваживши на те, що рівень медичних послуг та оснащеність більшості вітчизняних репродуктивних клінік не поступається міжнародному при більш низькій вартості послуг, це забезпечує Україні гідне місце на міжнародному ринку «медичного туризму» та відкриває додаткові можливості для розвитку технологій доімплантаціної діагностики й удосконалення показань до їх застосування.
Застосування методів доімплантаційної генетичної діагностики. Сучасні можливості молекулярної діагностики зумовили використання високочутливих методів доімпланта-ційного генетичного дослідження, в основу яких покладене явище гібридизації нуклеїнових
кислот. Їх можна розділити на три основні групи: методи, засновані на явищі ампліфікації (ПЛР-методи), флуорисцентній гібридизації in situ
(FISH) та геномній гібридизації. Особливості їх призначення можна розглянути за даними таблиці 3.
Таблиця 2
Порівняльна характеристика національного регулювання репродуктивних технологій*
Країна Пренатальна діагностика Доімплантаційна діагностика
Бельгія Дозволена Дозволена, без специфічних обмежень
Велика Британія Дозволена, законодавчо не врегульована Дозволена лише при визначених станах та за умови отримання дозволу Комітету з запліднення та ембріології. Вимагає ліцензування. Є предметом контролю відповідних служб.
Германія Дозволена, законодавчо не врегульована Заборонена, за винятком дослідження полярних тілець
Греція Дозволена Дозволена, законодавчо врегульована
Ірландія Дозволена, законодавчо не врегульована Заборонена
Іспанія Дозволена, законодавчо не врегульована Дозволена лише при визначених станах за умови високо ризику генетичної патології
Італія Дозволена, законодавчо не врегульована Заборонена, за винятком дослідження полярних тілець
Нідерланди Дозволена, законодавчо врегульована Дозволена, законодавчо врегульована
Російська федерація Дозволена, законодавчо не врегульована Законодавчо не врегульована
Словакія Дозволена, не врегульована (існують лише рекомендації) Дозволена, законодавчо не врегульована
Україна Дозволена, законодавчо не врегульована Законодавчо не врегульована
Франція Дозволена, законодавчо врегульована Дозволена лише при визначених станах, врегульована, потребує ліцензування
Чехія Дозволена, законодавчо не врегульована Дозволена лише при визначених станах за умови високо ризику генетичної патології
Швейцарія Дозволена, законодавчо врегульована. Можливе визначення характеристик плоду, які безпосередньо не впливають на його стан. Визначення статі заборонене Заборонена, за винятком дослідження полярних тілець
Примітка : * - складено з використанням даних [19, 25]
Кожен з наведених методів заснований на детекції унікальних послідовностей ДНК, однак низка методичних особливостей зумовлює певну унікальність застосування кожного з них.
Так, доімплантаційна ПЛР-діагностика хоч і має широкі діагностичні можливості, однак, як випливає з даних наведеної таблиці, коло показань до її застосування досить вузьке - дослідження окремих генів. Це пов’язано з обмеженою
кількістю регіонів, що можуть бути досліджені, неможливістю виключення хромосомних ане-уплоїдій, поліплоїдій, а також явища «випадіння алелю». Зазначене обмежує її застосування, наприклад, для селекції ембріонів за статтю, оскільки на анеуплоїдію за статевими хромосомами припадає близько половини випадків.
Відповідно до звітів PGD Consortium, за період 1997 - 2008 рр. акредитованими членами
було проведено 4763 цикли з використанням ПЛР-діагностики, що становить близько 18% усіх доімплантаційних досліджень. З них 4578 -власне доімплантаційна діагностика, лише 182 -селекція ембріонів за статтю та 3 - доім-плантаційний хромосомний скринінг [14].
Світові тенденції використання ПЛР у доім-плантаційній діагностиці характеризуються поступовим зростанням її застосування і за 2008 рік це становило 25,3% усіх доімплантаційних досліджень [12, 13, 14, 15, 18].
Таблиця 3
Застосування методів генетичного дослідження для доімплантаційної генетичної діагностики
Група методів
Приклади
Показання
Засновані на явищі ампліфікації (ПЛР-діагностика)
класична ПЛР
ПЛР в режимі реального часу Секвенування Фрагментарний аналіз Мінісеквенування та мас-спектрометрія
Діагностика моногенної патології Селекція ембріона за HLA-генотипом Селекція ембріона за резус-чинником
FISH-методи
FISH-аналіз
Обмежений хромосомний скринінг Збалансовані хромосомні перебудови у батьків Певні випадки незбалансованих хромосомних перебудов
Селекція ембріона за статтю
Геномна гібридизація
Порівняльна геномна гібридизація
Скринінг всього генома Хромосомні перебудови у батьків Багаторазові невдалі спроби ДРТ Звичне невиношування вагітності при ембріонах, нормальних за каріотипом
FISH-діагностика є найпоширенішим методом доімплантаційної діагностики. Оптимізуючи набір FISH-зондів, можна візуалізувати як конкретний регіон хромосоми, так і всю хромосому, або навіть весь геном. Однак обмежене коло флуорохромів не дозволяє зробити цей метод універсальним - кожен рівень візуалізації має специфічні для нього обмеження: неможливість детекції внутрішньохромосомних порушень у межах одного кольорового бенду та в немічених ділянках.
На сьогодні оптимум технічних можливостей методу дозволяє проведення доімплантаційного скринінгу ембріонів за обмеженою кількістю хромосом (до 12). Як правило, до цього переліку обов’язково входять 13, 15, 16, 17, 18, 21, 22 пари хромосом, а також X та Y, що дозволяє виявляти близько 70-72% усіх випадків анеуплоїдій [21].
Станом на кінець 2008 року членами PGD Consortium було проведено 21829 ДРТ циклів із застосуванням доімплантаційної FISH-діагнос-тики [14], що становило близько 82% випадків доімплантаційних досліджень.
Новою сходинкою розвитку доімплантаційної діагностики стала імплементація у практику
наукових доробок з порівняльної геномної гібридизації. Метод дозволяє проводити одномо-ментний скринінг всього генома на предмет анеуплоїдій, а також надавати кількісну характеристику окремих ділянок хромосом [4]. Зазначені можливості сприяли розширенню діагностичних можливостей, підвищенню точності висновків та швидкому прийняттю методу на озброєння ДРТ-клініками. Через його відносну молодость світова статистика ще відсутня. Але окремі результати вже представлені у міжнародній науковій літературі [8, 16, 17, 22, 27].
Переваги та недоліки кожного з методів зведено у таблиці 4.
Як випливає з аналізу даних, наведених у таблицях 3 та 4, БКН-метод та порівняльна геномна гібридизація мають багато спільних рис, а отже, й показань. З певного погляду, геномну гібридизацію можна представити у вигляді множинної БКН-діагностики, з чим, власне, і пов’язані її обмеження. Відтак, вважається за необхідне розвести показання для доімплантаційного генетичного дослідження за допомогою БКН-методу та порівняльної геномної гібридизації, що і представлено у таблиці 5.
Таблиця 4
Порівняльна характеристика методів доімплантаційної діагностики
Метод
Переваги
Технічні обмеження
Методи, засновані на явищі ампліфікації (ПЛР-діагностика)
Детекція унікальних послідовностей ДНК
Можливість «випадіння алелю».
Обмеження діагностики певним регіоном. Неможливість детекції анеуплоїдій, поліплоїдій. Використання технологій ампліфікації всього геному вносить додаткові помилки.
FISH-методи
Детекція унікальних послідовностей ДНК
Можливість візуалізації окремих хромосом чи всього генома
Обмежена кількість флуорохромів.
Неможливість детекції внутрішньохромосомних дефектів в межах одного кольорового бенду чи в немічених ділянках.
Накладання сигналів.
Розщеплення сигналів.
Низька ефективність гібридизації.
Порушення процесу фіксації клітин.
Необхідність використання індивідуальних зондів (у носіїв хромосомних перебудов).
Геномна гібридизація
Детекція унікальних послідовностей ДНК (кількісна)
Скринінг всього генома
Роздільна здатність від 0,7 млн. пар основ. Неможливість детекції збалансованих хромосомних перебудов.
Обмежена здатність детекції поліплоїдії, мозаїцизму. Висока чутливість до якості вихідного матеріалу. Неоднорідність ампліфікації фрагментів при використанні технологій ампліфікації всього генома.
Зниження величини встановлених відхилень (= достовірності порушень).
На тлі зазначеного вище доцільним є акцентувати увагу на доцільності проведення доім-плантаційного дослідження парам-носіям хромосомних перебудов методом порівняльної геном-ної гібридизації як єдиним на сьогодні методом, що дозволяє скринувати одночасно весь геном на предмет незбалансованих хромосомних аберацій. Зазначений факт є надзвичайно важливим, оскільки носії хромосомних перебудов явно мають
підвищений рівень хромосомної нестабільності, що зумовлює підвищену частоту виникнення анеуплоїдій ембріонів за хромосомами, що не залучені до батьківської хромосомної перебудови. Так, за даними [16], які досліджували ембріони у носіїв хромосомних аберацій, сумарно у 56,2% ембріонів були встановлені аберації хромосом, не пов’язані з батьківською перебудовою (рис. 1).
Таблиця 5
Показання до застосування окремих методів доімплантаційного генетичного дослідження
FISH-діагностика
Порівняльна геномна гібридизація
ДОІМПЛАНТАЦІЙНИЙ СКРИНІНГ Скринінг анеуплоїдій
Скринінг всього генома у випадку:
множинних невдалих спроб ДРТ,
звичного невиношування вагітності, при нормальних за Обмежений скринінг анеуплоіди (за 9-12 хромосомами) .
каріотипом ембріонах,
чоловічого фактора непліддя,
наявності в анамнезі дитини з вродженою аномалією.
Селекція ембріонів за статтю
ДОІМПЛАНТАЦІЙНА ДІАГНОСТИКА у випадку хромосомних перебудов у батьків
очікуваний мінімальний розмір незбалансованого порушення(в залежності від локалізації)
до 2-5 млн. пар нукл. основ . _ , „
. . „ понад 2-5 млн. пар нукл. основ (залежно від локалізації)
(залежно від локалізації)
Хромосомні аберації, асоційовані з батьківською перебудовою
■ Хромосомні аберації, асоційовані а батьківською перебудовою, з залученням додаткових хромосом Хромосомні аберації,НЕ ПОВ'ЯЗАНІ з батьківською перебудовою
■ Нормальний /збалансований хромосомний набір
Рис. 1. Розподіл ембріонів у носіїв хромосомних аберацій (наведено за [16])
Таким чином, при проведенні доімпланта-ційної діагностики БКН-методом у таких пацієнтів принаймні 28,9% ембріонів з анеуплоїдією за хромосомами, не пов’ язаними з батьківською перебудовою, можуть бути пропущені як «нормальні». Наведене є переконливим аргументом на користь аналізу ембріонів в аналогічних випадках методом порівняльної геномної гібридизації, що вже було нами попередньо висвітлено [4].
Сучасний стан доімплантаційної генетичної діагностики в Україні
Світові реалії доімплантаційної діагностики характеризуються невпинним розвитком технологічних та діагностичних можливостей, що дозволяє невпинно підвищувати якість, точність діагностики та підвищує частку успішного запліднення й виношування вагітності в циклах ДРТ.
БКН-діагностика (рис. 2) традиційно є найуживанішою і використовується в абсолютній більшості обстежень пацієнтів в Україні. Однак проводиться вона лише у кількох медичних центрах ДРТ. Через це вузькому колу спеціалістів, що працюють у цій галузі, успішно вдається дотримуватись існуючих світових рекомендацій і вимог щодо проведення такого аналізу, забезпечуючи результативність ДРТ циклів у межах загальноєвропейських показників.
При цьому офіційна статистика щодо частоти та результатів застосування доімплантаційної БКН-діагностики в Україні на сьогодні відсутня.
Складнішою є ситуація з іншими видами досліджень, що дозволяють діагностувати моно-генну патологію та проводити скринінг всього генома ембріона.
У переліку моногенної патології, щодо якої у світі проводяться доімплантаційні дослідження методом ПЛР, перші місця посідають муко-вісцидоз, бета-таласемія, серповидно-клітинна анемія, міодистрофія Дюшена та Беккера, гемофілія, синдром Мартіна-Белла (синдром ламкої Х-хромосоми) та селекція ембріонів за НЬЛ-сумісністю.
На жаль, доімплантаційна ПЛР-діагностика в Україні не є широковживаною, навіть з огляду на широкодоступні дані щодо поширеності наведених вище патологічних станів. Діагностика на сьогодні проводиться в одному медичному центрі - Клініці репродуктивної медицини «Надія» у кількості лише декілька (!) циклів на рік у зв’язку з відсутністю направлення пацієнтів лі-карями-генетиками на такий вид дослідження як один з методів народження здорового потомства у носіїв генної патології.
Рис. 2. Доімплантаційна генетична діагностика РКН-методом. Бластомер (3 доба)
Порівняльна геномна гібридизація є новим методом діагностики та знаходиться лише на початкових етапах свого впровадження, тож і достовірної світової статистики свого застосування ще не має. При цьому ціла низка відомих центрів, що спеціалізуються на застосуванні методів доімплантаційної діагностики, вже застосовує його у клінічній практиці. А в науковій літературі вже з’ явились перші повідомлення про народження дітей при використанні зазначеного методу [6, 16, 22]. В Україні доім-плантаційні обстеження пацієнтів з використанням методу порівняльної геномної гібридизації наразі проводяться також виключно на базі Клініки репродуктивної медицини «Надія», власні результати проведення яких наведені на рис. 3.
ЛгМҐґ 1
Г. Ь п. Ъ. Л- І—шЯ St-.-ír. г, . .Ь _ о- М Ф* * ÉtL,. '
ч If
Chromosomal Position
Рис. 3. Доімплантаційна генетична діагностика методом порівняльної геномної гібридизації. Клітини трофектодерми ембріону (5 доба). Анеуплоїдний ембріон з трисомією за 13 хромосомою та моносомією за 14 хромосомою
Підсумовуючи викладене, можна дійти висновку, що цей метод селекції ембріонів у нашій державі робить лише перші кроки до свого становлення. Доімплантаційна діагностика наразі зосереджена у кількох медичних центрах ДРТ та є переважно діагностикою статі ембріону та обмеженим хромосомним скринінгом на наявність анеуплоїдій.
Варто зазначити, що перспективи подальшого розвитку діагностичних технологій на доімплан-таційному етапі є достатньо ґрунтовними. Це пояснюється поширенням генетично зумовленої патології та зростанням неплідності населення, з іншої - недоступністю такого виду спеціалізованої медичної допомоги через фінансовий чинник та нерозвиненість інфраструктури центрів ДРТ. Так, за орієнтовними розрахунками (виходячи з обґрунтованої кількості 1500 циклів на 1 млн населення на рік [7]), сучасні потреби населення України в ДРТ становлять близько 70 тисяч циклів на рік [2], при тому, що фактичний ринок є значно вужчим. Зокрема, за доступними даними офіційної статистики, у 200S було розпочато всього 109S2 цикли з застосуванням ДРТ
[3].
При цьому, як вже було зазначено, відсутність офіційних статистичних даних щодо застосування доімплантаційної FISH-діагностики зумовлює недоступність даних щодо затребуваності цих досліджень у нашій державі. А слабка структурованість існуючих статистичних звітностей унеможливлює проведення таких розрахунків. Cпроба ж проведення такої оцінки шляхом порівняння національного ринку послуг ДРТ зі світовим є недоцільною через те, що, по-перше, кожна країна має власні обмеження та стандарти проведення цих досліджень, а, по-друге, світовий ринок послуг ДРТ характеризується суттєво більшою структурованістю, порівняно з українським, тому, як правило, доімплантаційні генетичні до-
слідження там проводяться спеціалізованими центрами чи лабораторіями, до яких направляють біологічний матеріал репродуктивні клініки.
Відтак, вважали доцільним частково заповнити вакуум вітчизняного інформаційного простору. Базуючись на тому, що носійство структурних хромосомних перебудов є абсолютним показанням до проведення доімплантаційного генетичного дослідження, можна провести орієнтовні розрахунки. Так, за власними даними медико-генетичного відділення КЗ КОР «Київського обласного центру охорони здоров’ я матері і дитини», за період 2008-2010 рр. з питань подальшого дітонародження було проконсультовано 748 подружніх пар з репродуктивними розладами різних типів та 47 подружніх пар, в анамнезі яких є діти з вродженими вадами розвитку та з хромосомною патологією, що загалом становило 795 пар. При цьому виявлено 21 випадок хромосомних аномалій (19 та 2 відповідно), що становило приблизно 2,6% і є обґрунтованою нижньою межею необхідної частки застосування доімплантаційних досліджень. При апроксимації на фактичну кількість ДРТ-циклів та розрахункові потреби населення України в ДРТ (див. вище), матимемо таке: в Україні наразі має проводитись близько 290 доімплантаційних досліджень на рік. Однак, оскільки доімплантаційна діагностика в Україні зосереджена лише у кількох медичних центрах ДРТ, можна стверджувати, що фактична кількість проведених обстежень є меншою. Між тим, потреба у таких обстеженнях дорівнює близько 1850 випадків.
ПІДСУМОК
Доімплантаційна генетична діагностика на сьогодні є єдиним способом виявлення генетичної патології ембріона. Використання такого
підходу дозволяє підвищити результативність циклів допоміжних репродуктивних технологій, знизити рівень репродуктивних втрат під час вагітності та ймовірність народження дитини з порушеннями генетичного апарату. Особливості її застосування в окремих країнах пов’язані зі встановленими рамками конкретного соціального простору, щодо доцільності якого можуть дискутувати лише його громадяни. Україна, володіючи технічним оснащенням світового рівня та поки не є обмеженою законодавчим регулюванням, має низку переваг щодо подальшого розвитку діагностичних технологій. Використавши таку перевагу, вона має усі шанси стати потужним центром «репродуктивного туризму».
Разом тим, кожен метод, що використовується з цією метою, має свої показання. Надання сліпої переваги котромусь із них призводить до поляризації діагностичної технології та обмеженого доступу до медичної допомоги подружніх пар, що її потребують, зокрема, носіїв моногенної патології, хромосомних перебудов чи при нез’я-сованих причинах непліддя.
Можливо, корінь таких недоліків криється у відсутності системного розвитку теоретичних і практичних проблем медичної генетики в країні, що зумовлено відсутністю спеціальної державної програми. Звідси витікає: а) необізнаність генетиків з сучасними принципами ведення пацієнтів з генетичною патологією й методами селекції ембріонів; б) нерозвиненість закладів молекулярної діагностики в країні; в) недостатня кількість спеціалістів з доімплантаційної діагностики та брак у них досвіду; г) незатребуваність доім-плантаційної діагностики як медичної послуги.
Саме тому, задля реалізації своїх основних функцій, ефективне функціонування репродуктивних технологій вимагає: створення державної цільової програми, мета якої полягала б у розвитку фундаментальних і прикладних проблем медичної генетики. У межах такої програми доцільні: а) запровадження загальнодержавних реєстрів репродуктивних втрат і неплідних подружніх пар, б) розширення спектру обстежень донорів статевих клітин; в) структуризація ринку доімплантаційної діагностики як медичної послуги з відкриттям відповідного центру, що спеціалізувався б на такому виді досліджень. Ііснуюча на сьогодні роз’єднаність клінік унеможливлює запровадження окремих видів досліджень через обмежений потік пацієнтів, що породжує брак досвіду спеціалістів й економічну недоцільність таких обстежень внаслідок високої вартості обладнання та витратних матеріалів.
Уявляється також, що прийняття законопроектів щодо загальнодержавного медичного страхування (які вже не перший рік знаходяться на розгляді Верховної Ради) і подальше впровадження страхової медицини будуть сприяти розвитку допоміжних репродуктивних технологій, оскільки покриватимуться пов‘язані з ними витрати.
Реалізація зазначених пропозицій забезпечить більшу доступність такого виду медичної допомоги, а, відтак, сприятиме зниженню рівня непліддя та зумовить покращення діагностики вроджених та спадкових хвороб і призведе до зниження народження дітей з генетично зумовленою патологією.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Бочков Н. П. Клиническая генетика: учебник / Н.П. Бочков. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Геотар-Мед, 2006. - 480с.
2. Жуматий А. Репродуктивное гостеприимство [Електронний ресурс] / А. Жуматий // Публикации IRTSA. - 2010. - Режим доступу: http://www. irtsa. com. ua/ru/publications.
3. Інформаційно-статистичний довідник про допоміжні репродуктивні технології в Україні. - К.: МОЗ України, 2011. - 23 с.
4. Микитенко Д.О. Порівняльна геномна гібридизація: новий стандарт діагностики в репродуктивній медицині / Д.О. Микитенко, В. Д. Зукін // Здоровье женщины. - 2010. - №9 (55). - С. 183-187.
5. Aberrant behavior of mouse embryo development after blastomere biopsy as observed through time-lapse
cinematography / T. Ugajin, Y. Terada, H. Hasegawa [et al.] // Fertil. Steril. - 2010. - Vol. 93, N 8. - P. 27232728.
6. Clinical application of comprehensive chromosomal screening at the blastocyst stage / W. B. Schoolcraft, E. Fragouli, J. Stevens [et al.] // Fertil Steril.
- 2010. - Vol. 94, N 5. - P. 1700-1706.
7. Collins J.A. An international survey of the health economics of IVF and ICSI / J.A. Collins // Hum. Reprod. Update. - 2002. - Vol.8, N. 3. - P. 265-277.
8. Comprehensive chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples experiencing repeated implantation failure / E. Fragouli, M. Katz-Jaffe, S. Alfarawati [et al.] // Fertil Steril. - 2010. - Vol. 94, N 3. -P. 875-887.
9. Different embryonic development after blasto-mere biopsy for preimplantation genetic diagnosis, observed by time-lapse imaging / Y. Tereda, T. Ugajin, H. Hasegawa [et al.] // Fertil. Steril. - 2009. - Vol. 92, N 4. -P. 1470-1471.
10. Does blastomere biopsy in preimplantation genetic diagnosis affect early serum p-hCG levels? / Y. J. Cho, J. Y. Kim, I. O. Song [et al.] // Clin. Exp. Reprod. Med -2011. - Vol. 38, N 1. - P. 31-36.
11. Edwards R.G. Sexing of live rabbit blastocysts / R. G. Edwards, R. L. Gardner // Nature. - 1967. -Vol.214. - P.567-577.
12. ESHRE PGD Consortium data collection VI: cycles from January to December 2003 with pregnancy follow-up to October 2004 / K. D. Sermon, A. Michiels, G. Harton [et al.] // Hum Reprod. - 2007. - Vol. 22, N 2.
- P. 323-336.
13. ESHRE PGD Consortium data collection VIII: cycles from January to December 2005 with pregnancy follow-up to October 2006 / V. Goossens, G. Harton, C. Moutou [et al.] // Hum. Reprod. - 2008. - Vol. 23, N 12.
- P. 2629-2645.
14. ESHRE PGD consortium data collection X: cycles from January to December 2007 with pregnancy followup to October 2008 / J. C. Harper, E. Coonen, M. De Rycke [et al.] // Hum. Reprod. - 2010. - Vol.25, N.11.
- P.2685-2707.
15. Goossens V. ESHRE PGD Consortium data collection IX: cycles from January to December 2006 with pregnancy follow-up to October 2007 // V. Goossens, G. Harton, C. Moutou [et al.] // Hum. Reprod.
- 2009. - Vol. 24, N 8. - P. 1786-1810.
16. First births after preimplantation genetic diagnosis of structural chromosome abnormalities using comparative genomic hybridization and microarray analysis /
S. Alfarawati, E. Fragouli, P. Colls, D. Wells // Hum. Reprod. - 2011. - Vol. 26, N 6. - P. 1560-1574.
17. First clinical application of comparative genomic hybridization and polar body testing for preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy / D. Wells, T. Escudero, B. Levy [et al.] // Fertil. Steril. - 2002. - Vol. 78, N 3. -P. 543-549.
18. Harper J.C. ESHRE PGD consortium data collection VII: cycles from January to December 2004 with pregnancy follow-up to October 2005 / J.C. Harper, C. de Die-Smulders, V. Goossens // Hum. Reprod. - 2008. -Vol. 23, N 4. - P. 741-755.
19. Legal aspects of PGD Licensing [Електронний ресурс]. - Режим доступу: http://www.hfea. gov. uk/docs/SCAG_ELC_Annex_A_June05.pdf.
20. Multicolour FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal preimplantation embryos from fertile patients / J. D. Delhanty, J. C. Harper, A. Ao [et al.] // Hum Genet. - 1997. - Vol. 99, N
6. - P. 755-760.
21. Munne S. Technology requirements for preimplantation genetic diagnosis to improve assisted reproduction outcomes / S. Munne, D. Wells, J. Cohen // Fertil. Steril. - 2010. - Vol. 94, N 2. - P. 408-430.
22. PGD for reciprocal and Robertsonian translocations using array comparative genomic hybridization / F. Fiorentino, L. Spizzichino, S. Bono [et al.] // Hum Reprod. - 2011. - Vol. 26, N 7. - P. 1925-1935.
23. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification / A.H. Handyside, E.H. Kontogianni, K. Hardy, R. M. L. Winston // Nature. - 1990. - Vol. 344. - P. 768-770.
24. Preimplantation aneuploid embryos undergo selfcorrection in correlation with their developmental potential / S. Barbash-Hazan, T. Frumkin, M. Malcov [et al.] // Fertility Sterility. - 2009. - Vol.92, N 3. - P. 890-896.
25. Preimplantation Genetic Diagnosis in Europe / A. Corveleyn, E. Zika, M. Morris [et al.] // Eur. Communities. - 2007. - Vol. 114. - P. 57-75.
26. Self-correction of chromosomally abnormal embryos in culture and implications for stem cell production / S. Munne, E. Velilla, P. Colls [et al.] // Fertil Steril - 2005. - Vol. 84, N 5. - P. 1328-1334.
27. Validation of microarray comparative genomic hybridization for comprehensive chromosome analysis of embryos / C. Gutierrez-Mateo, P. Colls, J. Sanchez-Garcia [et al.] // Fertil Steril. - 2011. - Vol. 95, N 3. - P. 953-958.
♦
