CC BY
36
Посiви бука на люокультурних площах повнiстю знищуються або ду-же пошкоджуються мишовидними гризунами, популяцп яких збiльшуються в лiсi в урожайнi для бука роки. Без ефективних заходiв боротьби з цими шюд-никами поЫви культур бука дуже ризикованi.
Найбшьш продуктивними i бiологiчно стiйкими у Карпатах е мiшанi за складом деревних порiд насадження бука за участю природних супутнiх лiсоутворювачiв, перелж i кiлькiсне спiввiдношення яких характеры для конкретних висотно-екологiчних умов i вiдповiдають корiнним деревоста-нам. Для шдвищення стiйкостi насаджень i конкурентноздатност вирощу-ваних порiд 1х розмщують кулiсами, кулiсно-ланковим способом або бюгру-пами розмiром не менше 5*5 м.
Належне обгрунтування способiв i технологи сезонного зберiгання го-ршюв бука, вирощування садивного матерiалу та створення культур, перевiр-ка наукових розробок у практицi лiсового господарства Карпат забезпечили основи штучного вирощування букових насаджень у виробничих масштабах.
Лггература
1. Бочковский В.П. Искусственное выращивание бука в условиях Карпат// Лесное хозяйство, 1955, № 1.
2. Гаврусевич А.М. Штучне вщновлення бука люового в Украшських Карпатах// VI Симпоз1ум ШРЁО з проблем бука. Тези доповщей. - Льв1в, 1995. - 38 с.
3. Корпель Ш., Мат1ч С. Люов1 культури бука в Центральны та Схщнш Gвропi// VI Симпоз1ум 1иБЯО з проблем бука. Тези доповщей. - Льв1в, 1995. - С. 42-43.
4. Молотков П.И. Естественное и искусственное возобновление буковых лесов Карпат// Расширенная сессия ученого совета УкрНИИЛХА. Тезисы докладов. - Харьков, 1958. - С. 7-8.
5. Молотков П.1., Гаврусевич А.М. Рют 1 розвиток с1янщв бука люового при р1зно-му свггловому режим1// Вюник сшьськогосподарсько! науки. 1960, № 11. - С. 90-95.
6. Молотков П.И. Естественное возобновление и рубки в буковых лесах// Естественное возобновление лесов. - Ужгород; Карпаты, 1971. - .
7. С. 67-91.
8. Третяк Ю.Д. Поновлення бука 1 його супутниюв природним шляхом та культурами. - Льв1в: Люотехшчний ш-т, 1958. - 19 с.
9. Швиденко А.Й. Культура бука в Черновицкой области. - Ужгород: Карпаты, 1964. - 21 с.
10. Крокер В., Бартон Л. Физиология семян. - М.: Изд-во ин. лит-ры, 1955. - 399 с.
11. Болеслав Сушка, Клаудше Муллер Марк Боннет-Мас1м Берт. №БЮпа 1еБпусИ dvzew 118с1а81усЬ оё 2Ыоги ёо - Warszawa-Poznan: Wydawnictwo паико^'е PWN, 1994. - 299 с.
УДК 630*165.3:630*64: 630*12 Асист Р.М. Гречаник, канд. с.-г. наук;
асист. О.Ф. Базюк; acnip. З.Д. Бондаренко - УкрДЛТУ; технологЛ.В. Федяй - приватне бютехмчне тдприемство "Поплета"
ЗАСТОСУВАННЯ Б1ОТЕХНОЛОГ1ЧНИХ МЕТОД1В ДЛЯ РОЗМНОЖЕННЯ Г1БРИДУ ОСИКИ I ТОПОЛ1 ЧОРНО1 ТА М1КОРИЗАЦ11 САДИВНОГО МАТЕР1АЛУ
З огляду на те, що осика формуе ектомiкоризний тип симбiозу, для проведення експерименпв ми зупинились на свинушщ тонкiй - Paxillus involutus (Batsch. Fr.). Метою було вивчення можливосп сумюного культивуваня мiкросаджанцiв riбридноi форми осики в умовах in vitro разом з видшеною чистою культурою вищих грибiв та вирощування шокулюму даного гриба-симбiонта за методом Marx et al. (1982).
Ризогенез мшроживщв гiбриду осики проводили на середовищi MSMN, яке по-передньо було шокульоване чистою культурою Paxillus involutus. Iнгiбування росту корiння осики як i росту грибницi не вщбувалося. Ефективнiсть мшоризацп у сте-рильних умовах була досить високою.
Стерильну культуру Paxillus involutus вирощували за температури 25 °С про-тягом 1.5 тижня на модифiкованому Melin-Norkrans (MNM) агаризованому середо-вищi. Мщелярш диски iз стандартних чашок Петрi використовували для шщацл ма-сового розмноження iнокулюму, який ми вирощували в рiзноманiтних контейнерах на сфагновому моа. Даний iнокулюм використовували для шокуляцп адаптованих до умов навколишнього середовища саджанцiв гiбриду осики в нестерильних умовах.
Ключов1 слова: мшориза, мiкроклональне розмноження, iнокулюм, середовище.
Assist. R. Grethanik; assist. O. Bazyuk; doctorateZ. Bondarenko - USUFWT; L. Fedyaj- "Popleta"
Usage of biotechnological methods at propagation of aspen hybrids and mycorrhizal inoculation of planting material
In view of the fact, that aspen forms ectomycorhizal type of symbiosis, the object of our researches was Paxillus involutus (Batsch. Fr.). We studied the possibility of co-cultivation of micro-seedlings of hybrid aspen at in vitro conditions together with pure culture of higher fungies inoculum production of the given mushroom by Marx et al. (1982) method. Rhizogenesis of microcuttings of hybrid aspen was done on MSMN medium, which was preinoculated by pure Paxillus involutus culture. Growth inhibition of aspen roots and of mycelium was noot observed. Mycorrhizal inoculation effectiveness was quite high at axenic conditions.
Sterile culture of Paxillus involutus grew at 25°С during 1.5 week on modified Melin-Norkrans (MNM) medium. Mycelial disks from Petri dishes were used for initiation of inoculum mass propagation, which was grown at different vegetation containers on peat moss. Given vegetation inoculum was used for mycorrhization of adapted to ex vitro environment conditions hybrid aspen seedlings.
Key words: mycorrhiza, micpropagation, inoculum, environment.
Вступ
Мжориза - це симбюз специф1чного Грунтового гриба з др1бними ко-ренями багатьох люових дерев та кушдв. Гриб-симбюнт слугуе продовжен-ням кореневоi системи рослини, транспортуючи воду та поживш елементи до коршня. Засвоення фосфору та азоту е специф1чною функщею мшоризного гриба, який вщдае дереву щ макроелементи у форм1, що е доступною для нього. Взаемно, рослина е первинним джерелом енерги для гриба, надаючи прост! цукри та вггамши, що продукуються у процес фотосинтезу, перено-сяться у коршня i у подальшому до симбюнта.
Зпдно з1 сучасними досл1дженнями та класифшащями щодо мшоризи, то ii основш види е такими: екто-, судинно-арбускулярна, ерикощна та орхщна мшоризи. Цей розподш залежить як вщ залучених оргашзм1в, так i в1д розвитку симбюнтних орган1в, а також i в1д i^ анатомii та функцш (Carlile M.J., 1994).
Використання специф1чних гриб1в для формування ектом1коризи на саджанцях люових пор1д у розсаднику може значно покращити ix рют та адаптац1ю п1сля висадки. Дерева багатьох вид1в не будуть нормально рости та розвиватися без них. Зусилля на залюення видами, що потребують екто-м1коризи, коли цей тип симбюзу буде в1дсутн1м на люокультурнш площ1, як правило, будуть безустшними. Протягом останн1х трьох десятил1ть було ч1т-
ко прошюстровано значення iнокyляцiï селективними ектомiкоризними грибами в умовах люового розсадника з метою покращення якост залюення зви-чайних лiсових земель та деградованих територш (Bowen, 1965; Mikola, 1973; Trappe, 1977; Molina and Trappe, 1982; Marx and Cordell, 1988).
У подальших роботах Marx et al. (1982) вперше запропонували споЫб вирощування вегетативного шокулюму Pisolithus tinctorius (Pers.) у промис-лових масштабах та шокулящю ним саджанщв лiсових порiд, якi вирощу-вались iз вiдкритою кореневою системою у контейнерах.
На сьогодш застосовуються таю методи шокуляцп мiкоризи:
• шокулящя спорами чи плодовими тiлaми;
• перемiшyвaння тепличного Групту з люовим гумуспим покривом (цей метод вважаеться одпим iз пaйефективпiших, якщо пе брати до уваги затрати па транспортування, але юпуе досить великий ризик зараження Групту);
• шокулящя мшоризним iпокyлюмом па осповi сфагнового моху та вермикуль ту в теплицях па розсадпиках;
• шокулящя мшросаджанщв в умовах in vitro чистою мщелярпою культурою;
• шокулящя попередньо-шокульованими сiяпцями ("чистi" сiяпцi висад-жуються поряд iпокyльовaпих);
• шокулящя ендомшоризою за методом INVAM (США);
• метод Dr. Епс Danell (Швецiя) для мiкоризпого симбiозy соспа -лисичка;
• використання "сиптетичпих" спор (мшориза у формi кульок iз захиспим пок-ривпим шаром), що виробляються у Фрaпцiï.
Ми проводили дослщження в таких напрямках:
1) вивчення можливост сyмiсного культивування мжросаджанщв пб-ридноï форми осики Populus trémula х Р. tremulooides в умовах in vitro разом з видшеною чистою культурою вищих грибiв;
2) вирощування шокулюму за методом Маркса (Маге, 1982), де ноЫем був сфагновий мох.
1. Матeрiали i Mei^n
Експлантанти для шщаци мiцелярноï культури брались з плодового тша гриба, у подальшому продезшфшованого (гiпохлорит нaтрiю, 90 % ети-ловий спирт) i просушеного у стерильних умовах. Видшення експлaнтaнтiв проводили з основи шжки i переносили на поживне середовище в чашки Пет-рь В експериментах застосовувались рiзнi типи поживних середовищ.
Зпдно з 1-им напрямком дослiджень для цього була шщшована культура адвентивних пагошв гiбридy осики шведськоï селекцп D-06 iз спля-чих бруньок, яка i слугувала вихiдним рослинним мaтерiaлом для подальших робiт. Базовим поживним середовищем було середовище МураЫге-Скуга iз 0.8 мг/л БАП (6-бензиламшопурин) та 0.1 мг/л НОК (нафтилоцтова кислота).
Джерелом експлантанлв були молодi пагони з бiчними i верхiвковими бруньками. У процесi роботи найбшьш вдалим виявився вибiр у ролi експлaнтaнтiв бруньок, розiбрaних до серединного апекса. 1з бруньок видаля-ли покривш лусочки i вичленяли меристемний купол розмiром близько 4 мм. Термшальш бруньки звiльняли вiд молодих листочюв, а з латеральних бруньок молодi листочки не видаляли.
Пщ час експерименту випробовували чотири варiанти стерилiзацп експлантантiв. Але спершу сегменти промивали у проточнiй водi з додаван-ням детергенту, потiм занурювали !х у стерилiзуючi розчини, а шсля закш-чення стерилiзаци промивали !х стерильною дистильованою водою.
Концентраци стерилiзуючих розчинiв, послiдовнiсть !х застосування i час стерилiзаци:
1. 70 %-ий розчин етилового спирту - 20 с; 0,2-процентний розчин хлориду ртут - 30 хв.; 0,25-процентний розчин хлорного вапна -2^10 хв.; триразове промивання стерильною дистильованою водою.
2. 70% розчин етанолу - 20 с; 0,2-процентний розчин хлориду ртут -40 хв.; 7-процентний розчин перекису водню - 5 хв.; одноразове про-мивання стерильною дистильованою водою.
3. 70 %-ий розчин етанолу - 20 с; 2-процентний розчин гшохлориту нат-рда - 6 хв.; 7-процентний розчин хлорамшу - 20 с; одноразове про-мивання стерильною дистильованою водою.
4. 70 %-ий розчин етанолу - 20 с; 0,1-процентний розчин хлориду ртут -20 хв.; 0,25-процентний розчин хлорного вапна - 2*10 хв.; триразове промивання стерильною дистильованою водою.
У наших дослщах ми використовували рiзнi поживш середовища, як характеризувалися рiзними спiввiдношеннями мжро- i макроелементiв, з метою визначення найбшьш оптимального середовища з точки зору вщповщно до природних умов росту рослини.
Культури вирощувались на таких середовищах: модифжоване середо-вище МБ-1 i МБ-2 [51], середовище для деревних порiд - "РМ, модифжова-не середовище БК""
З метою вивчення дИ рiзних регуляторiв росту ми аналiзували дда БАП (6-бензиламiнопурин), НОК (нафтилоцтова кислота), 1МК (шдолшмас-ляна кислота) в рiзних концентрацiях i поеднаннях на процеси морфогенезу пагошв i ризогенезу.
Для мехашчного закрiплення експлантантiв у поживному середовишд використовувався стерильний перлгг i рiзнi види агару. Джерелом вуглецю була сахароза, оптимальна концентращя яко! пiдбиралась експериментально. Поживне середовище стерилiзували протягом 20 хв за температури 121 °С i тиску 1,1-1,2 кгс/см2.
Експлантанти вирощувались за температури 20-22 °С i тривалост свiтлового дня 16 год. Освгглення проводилось флоурисцентними лампами (ЛДЦ) з штенсившстю 4-8 кЛк.
Вкорiненi проростки (а з метою експерименту - i невкоршеш) висад-жувались у культивацшш торфовi брикети (ЛГй-ро1в, виробництво Канада) i проходили поступову акшматизащю до умов навколишнього середовища у культивацшнш кiмнатi протягом двох тижшв, пiсля чого вони були готовi до висаджування у вiдкритий грунт.
Паралельно вирощування мiцелiальноl культури проводили шляхом поЫву базидiоспор безпосередньо iз плодових тiл за методом Н. Фрiза (2) на сусло-агарь Пророщування базидiоспор проводили за температури +24 °С.
Для забезпечення оптимального 1х проростання вологiсть повiтря шдтри-мувалась не нижче 80 %. Для и збереження в чашках Петрi останнi переносили в ексжатор чи заклеювали парафшмом.
На перших етапах дослiджень з метою шпбування росту бактерiй, що забруднювали грибну культуру, проводили видшення на пiдкислений сусло-агар (рН = 4.5-5.0), добавляли антибютики в рiзних поеднаннях (пенiцилiн -200 одиниць, стрептомщин - 100 одиниць у 1 мл середовища). Для видшення культур у деяких штамах мухомора червоного кусочки плодового тша по-мiщали спочатку у стерильш чашки Петрi на вологий фшьтрувальний папiр i лише пiсля появи ростучого мщелда переносили на агаризоване середовище з антибютиками. Основний наголос ми робили на абсолютнш чистой вихщ-но! маточно! культури, оскшьки це мае особливе значення для вирощування життездатного iнокулюму на поживних ноЫях.
Маточнi культури даних базидюмще^в зберiгали пiд стерильним ва-зелшовим маслом у морозильнiй камерi, а похщш пасажi пiдтримувалися методом переЫву на сусло-агар 1 раз на 10-11 мюящв.
2. Результати дослщжень
2.1. Розмноження г1бриду осики та топол1 чорноТ методом
культури тканин
Важливим i складним моментом у мжроклональному розмноженнi е одержання стерильного вихщного матерiалу, тому що поверхневi тканини ор-ганiв рослин заражеш епiфiтними бактерiями, грибками та !х спорами. Пра-вильний вибiр стерилiзуючоl речовини полягае в тому, щоб нейтралiзувати епiфiтну мiкрофлору i не пошкодити тканину рослини. К^м цього, дезинфь куюча речовина повинна добре змиватися i не проникати в тканину рослини. Тому режим стерилiзацil треба шдбирати експериментально для кожно! рослини та органу окремо.
Шд час стерилiзацil експлантанлв осики найкращих результатiв було досягнуто при використанш 4-го варiанту стеркшзаци, тобто:
• 70 % С2Н5ОН - 20 с;
• 0,1 % ЩСЬ - 20 хв.;
• 5 % хлорне вапно - 2x10 хв.;
• 3-разове промивання стерильною дистильованою водою.
Така послщовшсть застосування хiмiчних агентiв викликана специфь кою 1хньо! д11. Спочатку спирт руйнуе восковий налщ полегшуючи тим самим доступ детергенту до живих тканин рослин. Застосування ^С12 у данш концентраци зменшило кiлькiсть iнфiкованих експлантантiв (у середньому 2-3 експлантанти на 10 шт.), а сам хлорид ртут при цьому не мав шпбуючо-го впливу на експлантант. Залишки сулеми негативно впливають на життездатшсть експлантанлв, тому застосування хлорного вапна для ви-далення цих залишкiв було необхщним, тим бiльше, що вш мав ще й додат-кову стерилiзуючу дiю. Застосування перекису водню було неефективним.
Культури вирощувались на середовишд МБ-1 при освiтленнi 5000 Лк i тривалостi свiтлового дня 16 год. На цих культурах ми дослщжували вплив регуляторiв росту цитокшшового типу - 6-бензиламiнопурину (БАП) та наф-
тилоцтово! кислоти (НОК) на приживлюванiсть експлантан^в i на морфогенез пагошв.
З точки зору приживлюваностi експлантан^в i морфогенезу пагонiв найбiльш вдалою була концентрацiя БАП 0,8 мг/л. Вона давала 100 % при-живлюваност експлантантiв i найбiльшу штенсившсть пагоноутворення (див. рис. 1 i 2).
.¡3 я
^ 5
М О
« я
н 2
я а я а
§ 5
* &
« м
.а н
н ^ <у
'2 .а
Ч
2
120 100 80 60 40 20 0
100 100 100 100
80 88 80
;
0,2 07 1 1 0^ 1 1 1 ,2 1 ,4 )
Концентращя БАП (мг/л) Рис. 1 Вплив БАП на приживлювашсть експлантантiв
я ^ нт
.¡2 X
*£ в от
* я 2 « к н
■А Я Н «
« ч 2 к е а а
я н
п
е р
е
и
25 20 15 10 5 0
21
1 7, 4
а л
6 П 3,7 п с
2,7 1 П 2,5 ■
0,2 0 4 ? 0 >,6 с ),8 1 1,2 1,4
Концентращя БАП (мг/л) Рис. 2 Вплив БАП на морфогенез паготв при вмiстi НОК 0.1 мг/л
Шсля цих маншуляцш культури пересаджувались на середовище для шдукци ризогенезу. Це було середовище МБ з додаванням синтетичних ре-гуляторiв росту ауксинового типу - НОК та 1МК у рiзних концентращях. Взагалi, вкорiнення пагонiв у культурах можливе за наявностi лише одного з цих регуляторiв - НОК. Але в лiтературi е дат (АЬ^а, 1987) про те, що зас-тосування кiлькох регуляторiв росту ауксинового типу в рiзних поеднаннях значно тдвишуе iнтенсивнiсть ризогенезу. З ще! причини, а також для прис-корення вкорiнення мiкропагонiв, ми виршили застосувати одночасно два регулятори росту - НОК та 1МК (табл. 1).
Табл. 1. Ризогенез мжроживщв гiбриду осики залежно вiд концентрацш НОК _та 1МК через 9 114 дшв вiд початку культивування_
Концентрация НОК, мг/л Концентращя 1МК, мг/л 9 дшв 14 дшв
середня кшьюсть корешв на експ. кшьюсть експлантат1в, яю утворюють кореш, % середня кшьюсть корешв на експ. кшьюсть експлантат1в, яю утво-рюють кореш, %
0,0 0,0 1.8 + 0,5 80 2.5 + 0,6 88
0,01 0,01 2,8 + 0,3 92 3,9 + 0,4 92
0,1 0,1 4,3 + 0,3 100 7,7 + 0,4 100
0,2 0,2 5,5 + 0,1 100 7,7 + 0,2 100
1,0 1,0 0,7 + 0,4 44 1,0 + 0,4 64
Як видно з отриманих результат, кшьюсть корешв збшьшуеться з 9-го до 14-го дня культивування, що свiдчить про те, що 9 днiв - ще недостат-нiй термiн для того, щоб робити висновки про вплив регуляторiв росту на ризогенез. Оптимальним термiном для цього е 14 дшв. Але як i для 9-денних, так i для двотижневих культур, з точки зору формування корешв оптимальною була концентращя НОК - 0,2 мг/л та 1МК - 0,2 мг/л. За тако! концентраци спостерiгаеться найвища кiлькiсть утворених коренiв на 1 експлан-тант, причому ризогенез вщбувся у 100 % експлантантiв. Концентраци НОК 1 мг/л i 1МК 1 мг/л негативно впливали на ризогенез у культур^ що говорить про те, що перевищення концентраци цитокшшових регуляторiв може мати шпбуючий вплив на вкорiнення i викликати некроз листя i верхiвок пагошв.
У лiтературi е данi, що усшшне культивування деревних порiд за-лежить не лише вiд правильно пщбраних спiввiдношень регуляторiв росту, але й вiд багатьох iнших факторiв (Воnga, АЬи|а, ТИогре,...), зокрема, вщ концентраци солей у середовишд, вiд вмiсту сахарози, рН середовища i деяких ш-ших факторiв. Тiльки правильне поеднання регуляторiв росту з цими факторами забезпечуе усшх мжроклонального розмноження обрано! рослини.
2.2. Шдб1р оптимального середовища для вкоршення г1брид1в
осики та росту культури ектомжоризних гриб1в
Данi лгтературних джерел говорять про те, що рiзнi спiввiдношення сахарози i регуляторiв росту можуть пiдвищувати iнтенсивнiсть утворення пагошв i коренiв у культурах (Bowen О.Б., 1965). Ми виршили пiдiбрати оп-тимальну концентрацiю цу^в у середовищах для морфогенезу кореня у пб-риду осики, модифжуючи !х глюкозою з додаванням солодового екстракту. В основу цього експерименту була покладена iдея використання цу^в та !м подiбних додаткiв з середовища МЫМ для розмноження грибiв (без яких дос-лiджуванi гриби не можуть рости) при загальному зменшенш макроелементiв у 2 рази вщповщно до середовища Мурасiге-Скуга, i це кiнцеве середовище було назване як МБМЫ. Концетрацiю солодового екстракту ми не змшювали (3 г на лпр), але концентрацiя глюкози змiнювалась вiд 10 до 40 г на лгтр по-живного агаризованого середовища.
« ^
М X
'is в
S i« я
Ig 12
л =
и Я ü Ч •¡3 с
я w
.13 I« ^
R X
п «
а
ш
U
Концентращя глюкози (г/л)
Рис. 3. Вплив концентраци глюкози наризогенез у KyRbmypi гiбриду осики на cepeöoeuw(i MSMN i eMicmi 0,2 мг/л НОК та 0,2 мг/л 1МК)
Процеси коренеутворення вимагають, поряд з цитокшшовими регуляторами, досить високо! концентраци глюкози. Найбшьше коршщв на один експлантант утворювалось при 30 % глюкози у середовищд.
Найбшьш вдало мiцелiй утворював колошю в термостатi в експе-риментах 3i свинушкою тонкою на сусло-агарь
Ми перевiряли iнтенсивнiсть росту РахШш involutus на середовишi MSMN без культури осики. Можна стверджувати, що культура ектомшориз-них грибiв проявляла досить штенсивний рiст на даному середовищд, хоча i вiдставала приблизно на 25 % по росту вщ модифшованого середовища Ме-лша-Норкранс.
Ризогенез мiкроживцiв гiбриду осики проводили на середовишд MSMN, яке попередньо було шокульоване чистою культурою РахШш involutus. Iнгiбування росту коршня осики, як i росту грибнищ, не вiдбувалося. Ефективнiсть мжоризаци в умовах in vitro була досить високою.
2.3. Апробащя способу масового намноження шокулюму на
сфагновому мос1
Вегетативний iнокулюм свинушки тонко! вирощували за згаданою ви-ще методикою (Магх еt а1.,1982). Стерильну культуру РахШш involutus вирощували за температури 25 °С протягом 1,5 тижня на модифжованому (MNM) агаризованому середовищд. Мiцелярнi диски iз стандартних чашок Петрi використовувались для шщаци масового розмноження iнокулюму, який ми вирощували в рiзноманiтних контейнерах: лабораторш колби з кришками з алюмшево! фольги та спецiальнi вегетацiйнi 1-лiтровi емкосл для росту мiцелiю iз полiпропiленовою кришкою з ватним фшьтром.
Середовище MNM складалось iз 0,05 г хлористого кальщю, 0,025 г хлориду натрш, 0,5 г одно-замщеного фосфату калiю, 0,25 г дво-замщеного фосфату амонiю, 0,15 г сульфату магшю, 1,2 мл 1 % хлориду залiза, 100 мг иамш-НС1, 3 г солодового екстракту та 10 г глюкози у 1 л дистильовано! води. Додавали 15 г агару для формування твердого середовища. Шсля автокла-вування рН як рщкого, так i агаризованого середовища, було в межах 5,5-5,7.
У контейнери клали добре порiзаний мох, попередньо насичений рщ-ким поживним середовищем, зливали залишки середовища, закривали криш-
о
кою та автоклавували протягом 1 год за температури 121 С. Шсля охолод-ження контейнерiв, субстрат iнокулювали чистою культурою штаму Рахillus involutus Рё-121, який характеризувався надзвичайно агресивним ростом. Ця культура була отримана шляхом вщбору та отриманий дикарiон ми викорис-товували як вихiдну маточну культуру надалi в усiх дослщженнях.
Первинний стерильний iнокулюм на сфагновому мос ми використо-вували для апробаци способу масового намноження шокулюму. З метою адаптаци до виробничих умов, що юнують на окремих виробництвах (в на-шому випадку - люорозсадниках) ми не бачимо можливост налагодження стерильно! технологи вирощування шокулюму, осюльки це без спещально пiдготовленого персоналу та досить дорогого обладнання (автоклави, ламша-ри та шше лабораторне устаткування) е неможливим для малих виробництв.
На нашу думку, доцшьним е використання технологш, що вже пра-цюють досить ефективно у виробничих умовах, як це е у випадку вирощування сапрофгтних 1сивних грибiв (Р1ешОш ostreatus, Lentinus edodes, Vo1varie1-1а та шш^. Тобто пропонуемо замють методу жорстко! стериизаци субстрату застосувати споЫб семьстеришзаци, або як його ще називають - метод ксе-ротермiчноl обробки субстрату. Цей метод був вперше застосований в Угор-щинi у кiнцi 70-х роюв пiд час енергетично! кризи для вирощування гливи, у подальшому вш був вдосконалений у крашах Швденно-Схщно! Ази.
Суть методу зводиться до того, що попередньо шдготовлений (подрiб-нений) субстрат обробляеться парою за температури 95-100 °С протягом досить короткого часу (60-90 хв), шсля цього зволожуеться водою iз вапном та сполуками беномилу (фунпстатик). Вапно додають до субстрату з метою шд-няття рiвня рН до 7-8, фунгiстатик беномил (який мютиться у комерцiйних продуктах - таких як фундазол (виробник Угорщина) чи бенлат (виробник Швецарiя) проявляе фунпстатичну дш на нижчi гриби i при певних кон-центращях не впливае на рiст вищих базидiальних грибiв.
Для перевiрки ди рiзних фунгiстатикiв та !х концентраци на рют мi-целiальноl культури РахШш invo1utus ми випробовували таю хiмiчнi сполуки: беномил, манкозеб, шродюн, прохлораз.
Багато фунгiцидiв, доступних на в^чизняному ринку, е дуже ефектив-ними проти грибкiв i мають досить незначний негативний вплив на рослин i тварин. Таю сполуки мають високу бiохiмiчну специфiчнiсть, взаемодшчи з окремим компонентом клiтини чи бiохiмiчним процесом. 1х селективнiсть походить тшьки з того елемента, що е присутшм у клгтиш патогенного гриба, чи зi сполуки, яка стае активною, тшьки в межах кштини патогена.
Беномил е представником бензiмiдазолiв, що використовуються для запобшання чи лжування рослинних хвороб, яю викликаються досить широким спектром грибiв. Бензiмiдазоли мають шпбуючий вплив на хщ мi-тотичного подшу, а тому i на рют органiзму. Вони дiють шляхом запобшання полiмеризацil тубулiну i витягування мжротрубочок в ядрi. Тому цей хiмiч-ний агент мае фунпстатичну дш.
Щоб переконатись в ефективностi застосування беномилу для намно-ження синтетичного шокулюму на сфагновому мосi ми провели експеримент iз використанням шокуляци чашок Петрi з агаризованим МЫМ середовищем такими патогенними нижчими грибами як ТпсЬоёегша аигоу1г1ёе та Сiаdobot-гиш аБрегоГогиш у поеднанш з РахШш inуolutus iз додаванням рiзних фунгь цидiв (у рiзних концентрацiях) (табл. 2).
Табл. 2. Частка iнгiбування Trichoderma auroviride та Сlаdobotrum asperoforum i
PaxШus involutus тд дieю фунгщиду, %
Фунгщид Концентращя, ррш Trichoderшa auroуiride Сlаdobotruш asperoforuш Paxillus inуolutus
1 50,5 44,6 0
Беномил 10 50 100 100 100 100 0 0
100 100 100 10
1 51,6 54,0 0
Манкозеб 10 50 100 100 100 100 0 5
100 100 100 20
1 0 0 0
Iргоdiопе 10 50 50,5 61,3 28,8 35,3 0 0
100 65,4 45,6 67
1 85,2 100 0
Ргосhlоraz 10 50 100 100 100 100 0 0
100 100 100 52
Примггка: вщсоток шпбування зам1рювався по д1аметру колони.
З табл. 2 бачимо, що найменш токсичним для Paxillus inуolutus i порiв-няно ефективним iз наведених вище патогенiв е все-таки беномил. Якщо взя-ти до уваги, що дда фунгiстатика перевiряли на стерильних субстратах, то можна стверджувати, що для практичного застосування на пастеризованих субстратах беномил необхщно застосовувати у концентращях 50 ррш. Знаючи, що комерцшш продукти, таю як фундазол та бенлат мютять 50 % беномилу, то у кшцевому випадку необхщно застосовувати концентращю 100 ррш фундазолу чи бенлату для обробки субстрату.
У лабораторних умовах ми таким чином модифжували метод отри-мання шокулюму на пастеризованому субтрал iз стерильного шокулюму:
1. Проводили попередне замочування подрiбненого сфагнового моху протягом 2 год у модифжованому середовишд Мелша-Норкранса в шертному посудь
2. Додавали 1 % крейди до зволоженого субстрату (вщсоток крейди роз-раховувався вщповщно до маси вологого субстрату) з метою шдви-щення рН субстрату до рН 7-8. Така висока шщальна лужшсть се-редовища е необхщною (з практичного досвiду вирощування субстрату !с^вних грибiв) для шпбування росту нижчих грибiв. У подальшо-му рН субстрату падае, що е результатом росту мщелiальноl культури та ефекту "самошдкислення".
3. Фунпстатик було виршено додавати методом оприскування з пульверизатора пiсля проведення ксеротермiчноi обробки.
4. Технологiчний етап семi-стерилiзацii проводили в автоклавах ВК-75 при тиску 0.3 атм (t = 97 °С) у полшропшенових пакетах бельгшсько1 фiрми Мусеliа 3i стрiчковим антимiкробним фiльтром (пори < 0.2 мк), що вит-римують автоклавування.
5. Пакети пiсля шокуляци герметично запаювались.
6. 1нокульований субстрат переносили в термостат у температуру 24 °С.
7. Заростання субстрату проходило 2-3 тижш залежно вщ кiлькостi шо-кулюму (простерилiзованого шокулюму).
Завдяки високш чистотi культури та агресивност штаму було отри-мане абсолютне заростання носiя культурою РахШш involutus.
Отриманий iнокулюм використовували для "зараження" вирощених гiбридiв у контейнерах iз продезiнфiкованою (розчином формалiну) грунто-сумiшшю.
Висновки
• Мiкоризацiя в умовах in vitro виявилась досить ефективною, хоча найбiльш трудомiсткою i складною технологiчно, що для практичного застосування е досить проблематичним. Цей метод найбшьше пiдходить для лабораторних фiзiологiчних та бiотехнологiчних дослiджень.
• Другому напрямку дослiджень необхiдно придшити бiльшу увагу з метою впровадження для практичного застосування. На нашу думку, вирощування стерильного шокулюму на сфагновому мос тдходить для менш агресивних мiкоризо-утворюючих грибiв, таких як Во1е1:ш edulis, Suillus, тощо.
• У майбутньому, з метою тдвищення ефективност мiкоризацii доцшьним е використання мiкроорганiзмiв (препарати "Бiоспорин", "Рiзоплан", тощо) для сприяння росту ектомiкоризи та шпбування нижчих мiкроорганiзмiв.
• Для практичного застосування найбшьш доцiльним е використання лише за-рубiжних генетичних банкiв культур (таких як CBS в Нiдерландах, АТТС у США) для отримання чистих культур бшьш швидкоростучих штамiв мшори-зоутворюючих грибiв, що значно економить зусилля та кошти та е найбiльш надшним з метою уникнення помилок iз введениям у культуру.
Л1тература
1. Ahuja M.R. Aspen. In: Evans DA, Sharp WR and Ammirato PJ (Eds.)// Handbook of Plant Cell Culture. Macmillan Publishing Company. New York, 1986. - pP. 626-651.
2. Ahuja M.R. In vitro propagation of poplar and aspen// Bonga JM and Durzan DJ (Eds.) Cell and Tissue Culture in Forestry. Vol.3. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, 1987. -pP. 207-223.
3. Ahuja M.R., Krushe D. and Melchior G.H. Determination of plantlet regeneration ca-pa-city of selected aspen clones in vitro// Ahuja MR (Ed.) Somatic Cell Genetics of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 1988. - pP. 127-135.
4. Bowen G.D. Mycorrhiza inoculation in forestry practice// Aust For 29, 1965. -pP. 231-237.
5. Бисько H.A., Бухало A.C., Baccep С.П. и ДР. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре. - К.: Наук. думка, 1983. - 312 c.
6. Бухало А.С. Актуальные проблемы глубинного культивирования съедобных грибов// Производство высших съедобных грибов в CCCP. - К.: Hay^ думка. 1978. - С. 24-29.
7. Carlile M.J., Watkinson S.C. The Fungi// Academic Press Inc SanDiego, 1994. -pP. 23-35.
8. Marx et al. Commercial vegetative inoculum of Pisolithus tinctorius and inoculation techniques for development of ectomycorrhizae on container - grown tre seedlings// Forest Sci 28, 1982. - pP. 373-400.
9. Mikola P. Application of mycorrhizal symbiosis in forestry practice// Ectomycorrhizae: their ecology and physiology (G.C. Marks and T.T. Kozlowski, eds.). Academic Press, New York, 444, 1973. - pP. 383-411.
10. Theodorou C. and G.D. Bowen. Mycorrhizal responses of radiata pine in experiments with different fungi// Aust For 34, 1970. - pP. 183-191.
11. Varma A., B. Hock (Eds.) Mycorrhiza. Structure, Function// Molecular Biology and Biotechnology. Springer-Verlag, 1995.
12. Vozzo J.A., and E. Hacskaylo. Inoculation of Pinus caribea with ectomycorrhizal fungi in Puerto Rico// Forest Sci 17, 1971. - pP. 239-245.
13. Бондаренко З.Д., Гречаник Р.М. Мжроклональне розмноження деяких видiв роду Populus// Наук. вюник УкрДЛТУ: Лавницью дослщження в УкраЫ. - 2002. - С. 233-236.
УДК 630*181.28 Доц. Ю.М. Дебринюк, канд. с.-г. наук - УкрДЛТУ
ЯЛИНА еВРОПЕЙСЬКА (СМЕРЕКА) ЯК ВИСОКОПРОДУКТИВНА ПОРОДА МАЛОГО ПОЛ1ССЯ
Розглянут питання продуктивносп Picea abies [L.] Karst. в чистих i змшаних люових культурах Малого Полюся. Рекомендовано типи люових культур за участю ялини.
Doc. Yu.M. Debrinuk - USUFWT Norwau Spuce as highly productive species of Male Polissya
It is discussed aspects of Picea abies [L.] Karst. productivity at pure and mixed forest cultures of Male Polissya. It is recommended types of forest cultures with spruce admixture.
Ялина европейська за поширешстю серед хвойних порщ Славутського ДЛГ, на територи якого проводились дослщження, знаходиться на другому мющ, займаючи площу 1143 га або 5,5 % вкритих люом земель. Попит на породу (новор1чш ялинки, рудстшка, баланси тощо) в регюш е достатньо ви-соким, що стало наслщком широкого впровадження ялини в л1сов1 культури регюну. Про значне розширення територи зростання Picеа abies свщчать дат [6]. Так, в ХХ столгт в рiвниннiй частит Украши створено бшьше 42000 га насаджень з перевагою ялини та значну кшьюсть змшаних насаджень. За да-ними М.А. Голубця [2], якщо межi природного поширення ялини охоплю-вали площу 480 тис. га, то територiя ii сучасного суцшьного поширення зрос-ла бшьш шж вдвое. Площа одиничного розселення теж збшьшилась з 1000 до 1800 тис. га.
1снуе багато прикладiв високопродуктивних ялинових насаджень у позаареальних умовах. В оптимальних умовах зростання ялина европейська е швидкорослою високопродуктивною породою, здатною за порiвняно коротю термши накопичувати значнi запаси деревини [11, 4]. Зокрема, штучш ялин-ники Малого Полюся Г.А. Порицький [8] вщносить до типу деревостанiв з прискореним ростом у молодому вщ.
В.О. Бузун [1] вказував на високий рiвень рентабельносп вирощування ялинових насаджень в умовах Украшського Полюся та малий термiн окуп-
